Summary
Protocol
- Bereid microfluïdische kanaal met anti-CD4 + biotinlayted oppervlak.
- Injecteer 10 ml van het monster bloed op 5 ml / min in de microfluïdische kanaal met injectiepomp.
- Spoel het bloed van 20 ml / min voor 20 min met PBS.
- Injecteer verdunde FACS lyseren oplossing (verdund tot 10% uit voorraad oplossing met PBS) op 5ul/min gedurende 15 minuten.
- Incubeer gedurende 15 minuten.
- Injecteer primair CD3 + antilichaam-oplossing (verdund tot 10% uit voorraad oplossing met PBS) op 5 ml / min voor 20 minuten.
- Incubeer 2 uur.
- Spoel kanaal met PBS bij 5 ml / min gedurende 15 minuten.
- Injecteer 20% AF488 CD4 + antilichaam, 0,2% DAPI stockoplossing, en 10% secundair CD3 + antilichaam op 5 ml / min gedurende 20 minuten op hetzelfde moment.
- Incubeer gedurende 20 minuten.
- Spoel het kanaal met PBS bij 5 ml / min gedurende 15 minuten.
- Count cellen onder fluorescentiemicroscoop:
- White (optisch) - Zwart-wit: cel-en stof
- UV (DAPI) - Blauw: cel slechts
- Blauw (CD4 +) - Groen: T-lymfocyten en monocyten
- Groen (CD3 +) - Rood: T-lymfocyten alleen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |