Summary
Protocol
- Preparare canale microfluidica con anti-CD4 + biotinlayted superficie.
- Iniettare 10 ml di sangue campione a 5 ml / min nel canale di microfluidica con pompa a siringa.
- Lavare il sangue a 20 ml / min per 20 min con PBS.
- Iniettare una soluzione diluita di FACS lisante (diluito al 10% dalla soluzione madre con PBS) a 5ul/min per 15 minuti.
- Incubare per 15 min.
- Iniettare primario CD3 + soluzione di anticorpi (diluita al 10% dalla soluzione madre con PBS) a 5 ml / min per 20 min.
- Incubare per 2 ore.
- Scovare canale con PBS a 5 ml / min per 15 min.
- Iniettare 20% AF488 CD4 + anticorpi, 0,2% soluzione stock DAPI, e il 10% CD3 + anticorpi secondari a 5 ml / min per 20 minuti, allo stesso tempo.
- Incubare per 20 min.
- Lavare il canale con PBS a 5 ml / min per 15 min.
- Contare le cellule al microscopio a fluorescenza:
- Bianco (ottica) - Bianco e nero: cellulare e polvere
- UV (DAPI) - Blu: cell solo
- Blu (CD4 +) - Verde: T-linfociti e monociti
- Verde (CD3 +) - Rosso: T-linfociti solo
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |