Summary
Protocol
- Подготовка микрожидкостных каналов с анти-CD4 + biotinlayted поверхности.
- Inject 10 мл образца крови в 5 мл / мин в микрожидкостных канал с шприцевой насос.
- Промойте крови на 20 мл / мин в течение 20 мин с PBS.
- Inject разбавленный FACS лизирующего раствора (разбавляют до 10% от исходного раствора с PBS) в 5ul/min течение 15 мин.
- Инкубировать 15 мин.
- Inject первичной CD3 + раствор антител (разбавляют до 10% от исходного раствора с PBS) в 5 мл / мин в течение 20 мин.
- Инкубируйте в течение 2 часов.
- Промойте канал PBS в 5 мл / мин в течение 15 мин.
- Inject 20% AF488 CD4 + антитела, 0,2% DAPI маточного раствора, а 10% вторичных антител CD3 + в 5 мл / мин в течение 20 мин, в то же время.
- Инкубируйте в течение 20 мин.
- Промойте канал PBS в 5 мл / мин в течение 15 мин.
- Граф клетки под флуоресцентным микроскопом:
- Белый (оптический) - Черно-белый: клетки и пыли
- УФ (DAPI) - Синий: только клеток
- Синий (CD4 +) - Зеленый: Т-лимфоцитов и моноцитов
- Зеленый (CD3 +) - Красный: Т-лимфоцитов только
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |