Summary
Protocol
- Mikroakışkan kanal anti-CD4 + biotinlayted yüzey hazırlayın.
- 5 ml / dk 10 ml numune kan şırınga pompası ile mikroakışkan kanal içine enjekte edilir.
- PBS ile 20 dakika için 20 ml / dak kan yıkayın.
- 15 dakika için 5ul/min seyreltilmiş FACS parçalama solüsyonu (PBS ile stok solüsyonu% 10 sulandırılmış) enjekte edilir.
- 15 dakika boyunca inkübe.
- 5 ml / dk 20 dk birincil CD3 + antikor solüsyonu (PBS ile stok solüsyonu% 10 sulandırılmış) enjekte edilir.
- 2 saat süreyle inkübe edin.
- 5 ml / dk 15 dk PBS ile kanal yıkayın.
- 5 ml / dk, aynı zamanda 20 dakika boyunca% 20 AF488 CD4 + antikor,% 0.2 DAPI stok solüsyonu,% 10 ikincil CD3 + antikor enjekte edilir.
- 20 dakika boyunca inkübe.
- 5 ml / dk 15 dk kanalı PBS ile yıkayın.
- Floresan mikroskop altında hücrelerin sayısı:
- Beyaz (optik) - Siyah ve beyaz: hücre ve toz
- Yalnızca UV (DAPI) - Mavi: hücre
- Blue (CD4 +) - Yeşil: T-lenfosit ve monosit
- Sadece Yeşil (CD3 +) - Kırmızı: T-lenfosit
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |