Summary
Protocol
NIH3T3 세포 준비 :
탈출을위한 A. 셀
- 다음 세포, 세포 매체와 희석 1시 1분, 그리고 T75 플라스크에서 15 ML 팔콘 튜브로 전송 Trypsinize
- , centrifuging하여 펠렛으로 세포를 스핀 다운 뜨는을 기음과 DPBS로 세포를 씻어
- 다시 펠렛으로 세포를 스핀 다운 및 뜨는을 기음
- 미디어 Resuspend 세포
- hemocytometer (~ 200 T75 플라스크 당 X 10 4 셀 / ML)의 세포 밀도를 결정
- 원심 분리기 세포 솔루션은 뜨는 대기음 및 세포 농도 변화에 대한 미디어의 적절한 금액에 resuspend
B. 세포 방출
- 방출을 위해 사용하기 전에 소용돌이 세포
- 주사기로 세포 솔루션을 200 μL를 전송
- 펄스 발생기에 적절한 모드를 설정
- 꺼내기 한 방울 여러 방울을 위해 (파열), "E. 버"모드로 펄스 발생기를 설정
- 연속 비말의 방출 들어, "상식을 훨씬"모드로 펄스 발생기를 설정
- 신호 설정 변경
- 5 V 및 LOL 0 V 및 확인 "LIM"LED가 켜져입니다 힐러리 : 높은 수준과 낮은 수준의 출력 전압을 설정
- 사각형 펄스로 신호를 설정
- ( "의무") 솔레노이드 밸브가 '졌 그나 "에 대한 값을 변경하거나 듀티 사이클을 변경하여 비말의 방출을 위해 열려있는 시간을 변경
- 'PER'에 대한 값을 변경하여 배출의 주파수를 변경
- "버"에 대한 값을 변경하여 버스트에 탈출 방울의 개수를 변경
- 현미경으로 영상 준비 기판에 추출 세포 솔루션
C.의 스테 이닝
- 0.5 μL calcein - AM 및 DPBS의 ML 당 2 μL ethidium의 homodimer로 염료 용액을 만들어
- 염색 용액에 담가 준비 기판
- 샘플 37 10 분 동안 부화 허용 ° 이미징하기 전에 C를
실험 검증
- 니콘 이클립스 TE - 2000 U 형광 현미경에서
- 스팟 고급 소프트웨어 (진단 주식 회사)
- 데드 / 라이브 어세이
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
| Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
| 5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
| Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
| Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
| XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
| NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
| Trypsin | 0.05% solution | |||
| NIH 3T3 cell medium | ||||
| DPBS | Buffer | |||
| T75 | Tissue culture flasks | |||
| Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |
