Summary
Protocol
NIH3T3 células de preparación:
A. Las células de eyección
- Trypsinize las células, y luego se diluye 1:1 con los medios de comunicación celular, y la transferencia de un frasco T75 a un tubo de 15 ml Falcon
- Centrifugar las células en un pellet por centrifugación, se aspira el sobrenadante y lavar las células con DPBS
- Centrifugar las células en una bolita de nuevo, y aspirar el sobrenadante
- Resuspender las células en los medios de comunicación
- Determinar la densidad celular con hemocitómetro (~ 200 X 10 4 células / ml por frasco T75)
- Solución de centrífuga de células, se aspira el sobrenadante y resuspender en cantidad adecuada de los medios de comunicación para diferentes concentraciones de células
B. expulsión de la célula
- Vortex antes de usar las células para la eyección
- Transferencia de 200 l de solución de células en la jeringa
- Establecer el modo apropiado en el generador de impulsos
- Para la expulsión de gotas individuales y múltiples gotas (ráfagas), generador de pulso para "E. Bur" modo de
- Para la eyección de gota continua, generador de pulso en "NORM" modo de
- Cambiar la configuración de la señal
- Establecer el nivel de alta y baja tensión Nivel de salida: LIS a 5 V y LOL a 0 V y asegúrese de que el "LIM" está encendido
- Establecer como una señal de pulso cuadrado
- Cambiar la cantidad de tiempo que la válvula solenoide se abre para la eyección de gotas, cambiando el valor de "MED" o cambio de ciclo de trabajo ("derecho")
- Cambiar la frecuencia de la expulsión, cambiando el valor de "PER"
- Cambiar el número de gotas expulsadas en una explosión al cambiar el valor de "Bur"
- Solución de células de expulsión sobre el sustrato preparado para imágenes con microscopio
C. La tinción
- Conforman solución colorante con 0,5 l calceína-AM y 2 l homodímero de etidio por ml de DPBS
- Sumergir sustrato preparado en la solución colorante
- Que la muestra de incubar durante 10 minutos a 37 ° C antes de exponer
Experimento de Validación
- En una Nikon Eclipse TE-2000 microscopio fluorescente U
- Punto avanzado de software (Diagnostics, Inc.)
- Live / Dead ensayo
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
Trypsin | 0.05% solution | |||
NIH 3T3 cell medium | ||||
DPBS | Buffer | |||
T75 | Tissue culture flasks | |||
Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |