Summary
Cet article décrit les procédures de base pour mener des expériences de cartographie optique dans le coeur de lapin perfusé de Langendorff en utilisant le système d'imagerie panoramique, et la modalité d'imagerie double (de tension et de calcium).
Abstract
L'imagerie optique et de sondes fluorescentes ont une méthodologie de recherche considérablement progressé dans le domaine de l'électrophysiologie cardiaque d'une manière qui n'aurait pas été accomplie par d'autres approches 1. Avec l'utilisation du calcium et de colorants sensibles au voltage, cartographie optique permet la mesure des potentiels d'action transmembranaires et les transitoires de calcium à haute résolution spatiale sans le contact physique avec le tissu. Cela rend les mesures de l'activité électrique cardiaque possible sous plusieurs conditions où l'utilisation d'électrodes est difficile ou impossible 1. Par exemple, les enregistrements optiques fournir des informations précises des changements morphologiques du potentiel de membrane pendant et immédiatement après la stimulation et de défibrillation, tandis que les techniques conventionnelles d'électrode souffrent de relance induite par des artefacts pendant et après les stimuli en raison d'une polarisation de l'électrode.
Le coeur de lapin perfusé de Langendorff est l'un des modèles les plus étudiés de la physiologie du cœur humain et la physiopathologie. De nombreux types d'arythmies observées cliniquement pourrait être récapitulée dans le modèle de coeur de lapin. Il a été démontré que les ondes dans le coeur de lapin au cours des arythmies ventriculaires, déterminée par la taille effective du coeur et de la longueur d'onde de la rentrée, sont très similaires à celle du cœur humain 2. Il a également été montré que les aspects critiques de l'excitation-contraction (EC) couplage de lapin myocarde, tels que la contribution relative du réticulum sarcoplasmique (RS), est très similaire à la CE de couplage de l'homme 3. Nous présentons ici les procédures de base d'expériences de cartographie optique dans les cœurs de lapin perfusé de Langendorff, y compris la configuration système de perfusion de Langendorff, la cartographie optique de configuration des systèmes, l'isolement et la canulation du cœur, de perfusion et de colorant coloration du cœur, excitation-contraction découplage, et la collecte des signaux optiques. Ces méthodes pourraient être également appliquées au cœur d'autres espèces que le lapin avec des ajustements de taux de débit, optique, solutions, etc
Deux systèmes de cartographie optique sont décrits. Le système de cartographie panoramique est utilisé pour cartographier l'ensemble de l'épicarde coeur de lapin 4-7. Ce système fournit une vue globale de l'évolution des circuits réentrants cours arythmogenèse et la défibrillation, et a été utilisé pour étudier les mécanismes des arythmies et des antiarrhythmia thérapie 8,9. Le système de cartographie double est utilisée pour cartographier le potentiel d'action (PA) et le calcium transitoire (CAT) simultanément à partir du même champ de vision 10-13. Cette approche a permis d'améliorer notre compréhension de l'importance du rôle du calcium dans l'alternance de l'électrique et l'induction d'une arythmie 14-16.
Protocol
1. Préparation
- Préparer fraîchement solution Tyrodes fait »(en mm, 128,2 NaCl, CaCl 2 1,3, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, et 11,1 glucose). Afin d'accélérer la préparation quotidienne des solutions, préparer deux solutions de stock à l'avance et les conserver à +4 ° C Réfrigérateur: (1) Stock I (en g/2L, 374,6 NaCl, CaCl 2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) et (2) Stock II (en g/2L, 84,01 NaHCO 3). Pour faire 2L de solution suffisante pour une expérience de prendre Tyrodes '1840mL d'eau déminéralisée et mélanger en elle 80 ml de stock I, 80 ml de Stock II, et 4g de glucose.
- Préparer des solutions étalons de colorants et de découpleurs: (1) excitation-contraction solution stock découplant blebbistatin (Tocris Bioscience, 2mg/ml Solution dans le DMSO), (2) sensibles au voltage stock de solution de colorant di-4-ANEPPS (Invitrogen, 1mg/mL solution dans le DMSO), (3) la tension colorant sensible RH solution stock 237 (Invitrogen, solution 1.25mg/ml dans le DMSO); indicateur de calcium (4) Rhod-deux heures solution stock (Invitrogen, solution de 1mg/ml dans le DMSO). Une expérience lapin seul nécessite environ 30 uL de la solution stock di-4-ANEPPS, 30 ul de la solution RH237 stock, et 200 ul de la Rhod-deux heures solution stock. Pour éviter la congélation et décongélation répétées, nous stockons 100 aliquotes de di-4-ANEPPS à -20 ° C. D'autres colorants sont également stockés à -20 ° C. Stocker le blebbistatin dissous dans 4 ° C réfrigérateur.
- Avant la récolte du cœur, la solution de Tyrodes transfert »dans la bouteille 2L et le placer dans un bain d'eau (Fisher Scientific) qui maintient la température de la solution à 37 ° C. La solution est oxygénée à 95% d'O 2 - 5% de CO 2. Le pH est maintenu à 7,35 ± 0,05 en ajustant le niveau d'oxygénation. La solution est distribuée dans le système de perfusion de Langendorff et est filtré par un filtre en nylon net (taille des pores: 11μm, Millipore) placé dans la ligne de perfusion avant la canule.
- Préparer le matériel de surveillance avant la récolte du coeur. Un capteur de pression (WPI) est utilisé pour surveiller la pression aortique pendant l'expérience. De base du capteur de pression est ajustée à zéro mmHg lorsque le cœur n'est pas attaché au système de perfusion. Les pseudo-ECG électrodes sont placées dans la chambre à plomb approximative I, II et III de l'ECG Einthoven triangle.
2. La récolte et la perfusion de cœurs de lapin
- Fixer le lapin dans le dispositif de contention lapin. Euthanasier le lapin par une injection intraveineuse de pentobarbital sodique (50 mg / kg) avec 2000 U d'héparine. Quand le lapin est complètement euthanasiés, qui est déterminée par le manque de réflexe de la douleur, la cavité thoracique est rapidement ouvert et le cœur et les poumons sont excisées.
- Faites une entaille à l'extrémité supérieure de l'aorte ascendante, avant toutes les branches de l'arc aortique. Rincer l'air de l'aorte ascendante, puis rapidement cathétériser le cœur à une canule de calibre 16, qui a déjà été attaché à un trappeur bulle qui est très important pour garder l'air hors des coronaires. Une fois que le coeur est perfusé par voie rétrograde dans un système non-recirculation perfusion de Langendorff, faire une coupe à ouvrir le péricarde rapidement.
- Retirez le poumon, la trachée, des graisses et des tissus conjonctifs, tandis que le sang est évacué par la perfusion.
- Très important! Un tube en silicone (~ 3cm de long et 2 mm de diamètre) est inséré dans une veine pulmonaire et la valve mitrale dans le ventricule gauche (VG) et gardé là toute l'expérience. Ce tube libère la solution qui est piégé dans le LV. Sans circulation pendant des heures pendant l'expérience Langedorff-perfusion dans un cœur mécanique immobilisé, il est susceptible de provoquer une ischémie sévère dans la cavité du VG et de produire des arythmies.
- Déplacez le cœur avec la canule à la recirculation de Langendorff perfusion du système avec l'appareil de cartographie optique.
3. Mener des expériences en utilisant le système de cartographie panoramique optique
- Placez le coeur dans une chambre à six pans sur-mesure et connecter la canule pour le système de perfusion. Maintenir la pression aortique à 60 ± 5 mmHg en ajustant le débit de la pompe à perfusion. Moniteur conduisent j'ai pseudo-ECG. Maintenir le pH à environ 7,35 ± 0,05.
- Eteignez la lumière ambiante, parce blebbistatin est photoinactivated fin UV et faible (450-490 nm) 17 de la partie visible du spectre. Injecter lentement la solution mère blebbistatin par le port d'injection dans le trappeur bulle d'air situé au-dessus de la canule. Injecter lentement blebbistatin 0.1ml pour chaque injection bolus. Attendez que la pression de se stabiliser avant la prochaine injection.
- Placez délicatement l'électrode sur le rythme emplacement spécifique à votre design expérimental.
- Mettez l'image du cœur dans le verre dépoli situé sur le plan image de chaque tableau photodiode (PDA) à partir de troisespacés angles entourant le cœur. Ajustez la position de la canule et les distances entre chaque PDA et le cœur afin de s'adapter au coeur du champ de vue de chacun des trois PDA. Prenez une photo de chaque image focalisée dans le verre dépoli.
- Lentement injecter 10 ~ 20 pi solution stock de di-4-ANEPPS par le port d'injection dans le piège à bulles d'air dans la solution de perfusion. Attendre 1 ~ 3 minutes avant de prendre enregistrements optiques.
- Pour le premier enregistrement, allumer la lumière LED verte (pas de filtre d'excitation, INONDATIONS LED, LUMILEDS), prenez enregistrements optiques simultanément de trois PDA connecté avec le système de sur-mesure d'acquisition de données, 5 et éteindre la lumière LED. Vérifier la qualité des signaux des différents pixels de chacun des trois PDA. Ajouter 0,1 ~ 0,2 ml solution stock blebbistatin si les artefacts de mouvement dans le potentiel d'action optiques sont remarqués. Ajouter une autre solution à 5 uL d'actions di-4-ANEPPS s'il signal-bruit est faible.
- Terminer le protocole conçu expérimental pour l'étude fonctionnelle. Re-tacher le coeur avec une solution 5uL stock supplémentaire di-4-ANEPPS si le signal se dégrade au cours des expérimentations en raison de photoblanchiment ou de lavage.
- Allumez la lumière ambiante après l'achèvement de l'étude fonctionnelle. Prenez des photos de cœur de 36 angles régulièrement espacés. Ce résultat est obtenu en tournant le cœur à une étape de 10 ° avec un appareil numérique fixé à l'emplacement d'un PDA.
- Prenez le cœur hors de la chambre. Égoutter l'ensemble des solutions. Lavez le système de perfusion dans la séquence de l'eau déminéralisée, alcool réactif à 70%, et encore de l'eau DI.
- L'analyse des données comprend la reconstruction de la géométrie du cœur du 36 photographies numériques, l'enregistrement du signal optique sur la surface de la géométrie reconstruite, et la quantification de la durée du potentiel d'action (DPA), la vitesse de conduction (CV), phase, etc 6
4. Mener des expériences en utilisant le système de cartographie double
- (Continuer après partie 2) Placez le coeur canule dans une chambre de verre (Radnoti) et de connecter la canule pour le système de perfusion. Cerner le coeur au fond de la chambre de silicium à l'apex du ventricule et oreillette.
- Eteignez la lumière ambiante. Injecter lentement la solution mère blebbistatin (15 ~ 20 min pour atteindre 10 uM) par le port d'injection avant de la canule de perfusion afin d'immobiliser le cœur.
- Mettez un plat en plastique de Pétri, ou d'autres couvrent fenêtre en verre, au-dessus de la surface épicardique de réduire le mouvement de la surface de solution.
- Discussion de deux caméras CMOS dans le système de cartographie double (Ultima-L, SciMedia) au même champ de vision. Fluorescence émise est séparé par un miroir dichroïque (635nm coupure, Omega Optical), et filtré par un filtre 700nm longpass (Thorlabs) pour les signaux de tension et par un passe-bande 590 / 30 nm filtre (Omega Optical) pour les signaux de calcium.
- But des guides de lumière de deux lampes halogènes (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, Californie) vers le domaine de la cartographie de vue de réaliser un éclairage uniforme. Filtres d'excitation (531/40 nm, SemRock) sont utilisés.
- Tache le cœur avec la solution de tension colorant sensible des stocks HR 237 (10 ~ 30 uL) par le port d'injection.
- Mélanger les Rhod-deux heures (0.2ml) solution mère avec Pluronic F-127 (Invitrogen, mélange 1:1). Soniquer pendant 1min dans un sonicateur bain-marie. Injecter le mélange à travers le port du trappeur bulle. Attendez environ 20 minutes pour permettre à la dé-estérification des Rhod-deux heures avant le début de la cartographie.
- Pour un enregistrement, éteindre la pompe pour éviter le mouvement surfusion à la surface de la solution, tourner sur la source lumineuse d'excitation (les lampes halogènes); prendre enregistrements optiques utilisant deux caméras connectées au système d'acquisition de données (Ultima-L, SciMedia) ; éteindre la lumière d'excitation, et mettez la pompe surfusion. Vérifier la qualité des signaux optiques. Re-tacher les tissus, si nécessaire.
- Terminer le reste du protocole conçu pour une étude expérimentale.
- Allumez la lumière ambiante et de prendre une photographie du cœur contenant le champ de vision. Prenez le cœur hors de la chambre. Égoutter l'ensemble des solutions. Lavez le système de perfusion dans la séquence de l'eau déminéralisée, alcool réactif à 70% (Fisher Scientific), et de l'eau DI.
- L'analyse des données contient des mesures d'APD, CV, la durée de calcium transitoire (CATD), le délai entre la course ascendante AP et de l'élévation de chat, le temps de montée du calcium transitoire, et la constante de temps un ajustement monoexponentielle de la désintégration de cat.
Les résultats représentatifs:
Figure 1. Les résultats représentatifs d'une expérience de lapin perfusé de Langendorff en utilisant le système de cartographie panoramique optique. (A) La vue antérieure du cœur de lapin et la géométrie de lapin reconstruite cœur sous la forme d'un treillis à trois dimensions-grille de surface. (B) TIl défit surface épicardique couleur par la phase (obtenu à partir de l'analyse plan de phase 18) en indiquant le front d'onde en rouge pendant un épisode de tachyarythmie. (C) Les enregistrements optiques potentiel d'action à partir de cinq endroits autour de la singularité phase marquée par 1-5 dans la partie B. (D) Huit des instantanés de front d'onde d'activation (couleur rouge) pendant un cycle de propagation d'une arythmie stables réentrant. Les cercles de front d'onde dans le sens horaire autour d'une singularité de phase, qui est visible à la surface antérieure du cœur. La couleur de la repolarisation (bleu) est réglé pour être partiellement transparente, de sorte que le front d'onde postérieur est visible (par exemple, à 80ms, 100ms, 120ms et). Un film de cette arythmie réentrante est fournie dans la vidéo d'appoint 1. Les méthodes de reconstruction géométrique, l'enregistrement du signal, le calcul de carte de phase, et le déballage de surface sont décrites en détail ailleurs 6.
Figure 2. Les résultats représentatifs d'une expérience de Langendorff perfusé de lapin cardiaque en utilisant le système de cartographie double (cartographie simultanée du potentiel d'action et de calcium transitoire). (A) la surface antérieure du cœur avec le champ de la cartographie de vue couvert par des points noirs. (B) Une vue rapprochée d'enregistrements à partir d'un site. (C) des traces exemples du potentiel d'action (en bleu) et le calcium transitoire (rouge) à partir d'un ensemble de positions espacées uniformément marqué par les points noirs dans le panneau A. Notez que tous les enregistrements de pixels sont affichés et la résolution spatiale est 200μm.
Discussion
Basé sur notre expérience, les clés d'un succès de Langendorff perfusé expérimentation coeur de lapin comprennent une solution bien préparé Tyrodes, récolte rapide du cœur, bien entretenu la pression de perfusion, et le pH de la solution appropriée oxygéné dans le système de perfusion. Afin d'enregistrer le signal à plus haute possible, rapport signal-bruit, nous devons tenir compte de facteurs y compris la source de lumière, des filtres optiques, une optique de focalisation, photodétecteurs, etc 19. Les détails de ces aspects sont abordés ailleurs 19. Lapins jeunes (âge: 4-5 mois, poids: 7-9 kilos) pourrait être utilisé pour éviter la graisse épicardique, ce qui diminue le rapport signal sur bruit des signaux optiques.
Le signal enregistré par chaque pixel est une intégration pondérée de la lumière émise à partir d'un volume de tissu. La profondeur de ce volume tissulaire dépend de la longueur d'onde d'excitation et d'émission du colorant utilisé. Pour di-4-ANEPPS, comme exemple, la profondeur de pénétration est estimé à 300 um dans le coeur de lapin 20. Ainsi, l'interprétation du signal optique doit être faite avec prudence lorsque l'hétérogénéité locale de la fonction électrique sont présents dans le noeud sinusal, noeud auriculo-ventriculaire, et pendant 1,21,22 arythmie ventriculaire.
Une limitation de la technique de cartographie optique comparée avec l'enregistrement de l'électrode est que la phase de repolarisation du potentiel d'action est souvent distored optiques par artefacts de mouvement provoqué par la contraction cardiaque. Contrainte mécanique peut être utilisé pour réduire l'artefact, mais ne peut pas les éliminer complètement. En comparaison, pharmacologiques excitation-contraction découpleurs sont efficaces pour éliminer les artefacts de mouvement. Cependant, ces découpleurs (par exemple 2,3-Butanedione monoxime) pourrait avoir d'importants effets secondaires électrophysiologiques. Blebbistatin a été démontré ne pas avoir de néfastes effets secondaires sur l'électrophysiologie cardiaque dans le coeur normal 23, et est donc un découplant prometteuse pour la cartographie optique. Il faut noter que l'accélération de l'œdème dû à l'abolition de la contraction pourrait également affecter l'électrophysiologie.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Subventions du NIH R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
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