Summary
Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.
Abstract
Optische beeldvorming en fluorescerende probes aanzienlijk geavanceerd onderzoek methodologie op het gebied van elektrofysiologie van het hart op een manier die niet kon worden verwezenlijkt door andere benaderingen: 1. Met het gebruik van de calcium-en voltage-gevoelige kleurstoffen, optische mapping kunnen de metingen van transmembraan actiepotentialen en calcium transiënten met een hoge ruimtelijke resolutie, zonder het fysieke contact met het weefsel. Dit maakt metingen van de cardiale elektrische activiteit mogelijk onder veel omstandigheden waarbij het gebruik van elektroden is lastig of onmogelijk is een. Bijvoorbeeld optische opnames accurate morfologische veranderingen van de membraanpotentiaal tijdens en onmiddellijk na stimulatie en defibrillatie, terwijl de conventionele elektrode technieken last van stimulus-geïnduceerde artefacten tijdens en na de stimuli te wijten aan een elektrode polarisatie.
De Langendorff-doorbloed konijn hart is een van de meest bestudeerde modellen van het menselijk hart fysiologie en pathofysiologie. Veel soorten van aritmieën klinisch waargenomen kan worden samengevat in het konijn hart model. Er werd aangetoond dat de golfpatronen in het konijn hart tijdens ventriculaire aritmieën, bepaald door de effectieve grootte van het hart en de golflengte van terugkeer, zijn zeer vergelijkbaar met die in het menselijk hart 2. Er werd ook aangetoond dat belangrijke aspecten van de excitatie-contractie (EG) koppeling bij konijnen myocardium, zoals de relatieve bijdrage van sarcoplasmatisch reticulum (SR), is zeer vergelijkbaar met de menselijke EG-koppeling 3. Hier presenteren we de elementaire procedures in kaart brengen van optische experimenten in Langendorff-geperfuseerde konijn harten, waaronder het Langendorff perfusie de systeeminstellingen, het in kaart brengen van de optische systemen setup, de isolatie en canulatie van het hart, perfusie en dye-kleuring van het hart, excitatie-contractie ontkoppeling, en het verzamelen van optische signalen. Deze methoden kunnen ook worden toegepast op het hart van andere soorten dan konijn met aanpassingen van de debieten, optica, oplossingen, etc.
Twee optische mapping systemen worden beschreven. Het panoramische mapping systeem wordt gebruikt om de gehele epicard van het konijn hart kaart 4-7. Dit systeem biedt een globaal overzicht van de evolutie van de re-entry circuits tijdens arrhythmogenesis en defibrillatie, en werd gebruikt om de mechanismen van aritmieën en antiarrhythmia therapie 8,9 bestuderen. Het duale mapping systeem wordt gebruikt om de actie potentiaal (AP) en calcium van voorbijgaande aard (CAT) gelijktijdig uit hetzelfde beeldveld 10-13 kaart. Deze aanpak heeft versterkt ons begrip van de belangrijke rol van calcium in de elektrische alternans en de inductie van aritmie 14-16.
Protocol
1. Voorbereiding
- Bereid vers gemaakte Tyrodes 'oplossing (in mm, 128.2 NaCl, 1,3 CaCl2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, en 11,1 glucose). Te versnellen de dagelijkse bereiding van oplossingen, voor te bereiden twee stockoplossingen van tevoren en bewaar ze bij +4 ° C koelkast: (1) Stock I (in g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17.52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10.67 MgCl 2) en (2) Voorraad II (in g/2L, 84.01 NaHCO 3). Te maken 2L van de oplossing Tyrodes 'voldoende voor een experiment duurt 1840mL gedeïoniseerd water en meng er in 80 ml van Stock I, 80ml van Stock II, en 4g van glucose.
- Bereid voorraad oplossingen van kleurstoffen en uncouplers: (1) excitatie-contractie ontkoppelrail blebbistatin stockoplossing (Tocris Bioscience, 2mg/mL oplossing in DMSO), (2) voltage-gevoelige kleurstof di-4-ANEPPS stockoplossing (Invitrogen, 1mg/ml oplossing in DMSO), (3) voltage-gevoelige kleurstof RH 237 stockoplossing (Invitrogen, 1.25mg/ml oplossing in DMSO), (4) calcium indicator Rhod-2AM stockoplossing (Invitrogen, 1mg/ml oplossing in DMSO). Een enkel konijn experiment vereist ongeveer 30 pi van de di-4-ANEPPS voorraadoplossing, 30 pi van de RH237 voorraadoplossing, en 200 pi van de Rhod-2AM stamoplossing. Om te voorkomen dat herhaaldelijk bevriezen en ontdooien, slaan we 100 pi fracties van di-4-ANEPPS bij -20 ° C. Andere kleurstoffen worden ook opgeslagen bij -20 ° C. Bewaar de opgeloste blebbistatin in +4 ° C koelkast.
- Vóór de oogst het hart, de overdracht Tyrodes 'oplossing in de 2L fles en plaats deze in een waterbad (Fisher Scientific), die de oplossing temperatuur blijft op 37 ° C. De oplossing is zuurstof met 95% O 2 - 5% CO 2. De pH wordt gehandhaafd op 7,35 ± 0,05 door het aanpassen van de oxygenatie niveau. De oplossing is verspreid in de Langendorff perfusie-systeem en wordt gefilterd door een nylon net filter (poriegrootte: 11μm, Millipore) geplaatst in de perfusie lijn voordat de canule.
- Vooraf voor te bereiden bewakingsapparatuur de oogst het hart. Een drukopnemer (WPI) wordt gebruikt om de aorta druk tijdens het experiment te controleren. Basislijn van de drukopnemer wordt aangepast aan mmHg nul wanneer het hart niet aan de perfusie-systeem. Pseudo-ECG-elektroden worden geplaatst in de kamer te benaderen Lead I, II en III van de Einthoven driehoek ECG.
2. Oogsten en perfusie van Rabbit Hearts
- Bevestig het konijn in het konijn restrainer. Euthanaseren het konijn door een intraveneuze injectie van natrium pentobarbital (50 mg / kg) met 2000 U heparine. Als het konijn is volledig gedood, die wordt bepaald door het ontbreken van pijn reflex, is de borstholte snel geopend en het hart en de longen zijn weggesneden.
- Maak een snee aan de bovenkant van de aorta ascendens voordat alle takken van de aortaboog. Spoel de lucht uit de aorta ascendens en dan snel het hart canule om een 16-gauge canule, die eerder is bevestigd aan een zeepbel trapper dat is heel belangrijk voor het houden van lucht uit hartinfarcten. Zodra het hart is retrogradely geperfundeerd in een niet-recirculerende Langendorff perfusie-systeem, maakt een snee aan het hartzakje snel te openen.
- Verwijder de longen, luchtpijp, vet en bindweefsel, terwijl het bloed wordt gespoeld door de perfusie.
- Zeer belangrijk! Een silicone (~ 3cm lang, en 2 mm in diameter) wordt ingebracht via een longader en mitralisklep in de linker ventrikel (LV) en daar gehouden gedurende het experiment. Deze buis brengt de oplossing die is gevangen in de LV. Zonder circulatie voor uren tijdens de Langedorff-perfusie experiment in een mechanisch geïmmobiliseerd hart, is het waarschijnlijk tot ernstige ischemie veroorzaken in de LV holte en aritmie te produceren.
- Verplaats het hart met de canule aan de recirculatie Langendorff-perfusie-systeem met de optische mapping apparaat.
3. Uitvoeren van experimenten met behulp van de Panoramic Optical Mapping System
- Plaats het hart in een op maat gemaakte zeshoek kamer en sluit de canule op de perfusie-systeem. Handhaving van de aorta druk bij 60 ± 5 mmHg door het aanpassen van het debiet van de perfusie pomp. Monitor lead I pseudo-ECG. Handhaven van de pH-waarde rond de 7,35 ± 0,05.
- Zet de kamer licht, omdat blebbistatin is photoinactivated door UV-en low end (450-490 nm) 17 van het zichtbare deel van het spectrum. Injecteer langzaam blebbistatin voorraad oplossing door de injectiepoort in de lucht-bubble trapper boven de canule. Injecteer langzaam 0,1 ml blebbistatin voor elke bolus injectie. Wacht tot de druk om te stabiliseren voordat de volgende injectie.
- Plaats voorzichtig de pacing elektrode op de locatie specifiek zijn voor uw experimenteel ontwerp.
- Focus het beeld van het hart in het matglas gelegen aan het beeldvlak van elke foto-diode-array (PDA) uit driegelijkmatig hoeken rondom het hart. Pas de positie van de canule en de afstand tussen elke PDA en het hart om het hart te passen in het veld-of-view van alle drie de PDA's. Maak een foto van elk scherp beeld in het matglas.
- Injecteer langzaam 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS voorraad oplossing door de injectiepoort in de lucht-bubble trap in de perfusie-oplossing. Wacht 1 tot 3 minuten voordat optische opnames.
- Voor de eerste opname, zet u de groene LED licht (geen excitatie filter, LED OVERSTROMINGEN, LUMILEDS) op, gelijktijdig optische opnamen van drie PDA's die verband houden met de op maat gemaakte data-acquisitiesysteem, 5 en zet de LED-licht. Controleer de kwaliteit van de signalen van verschillende pixels van alle drie de PDA's. Voeg 0,1 ~ 0,2 ml blebbistatin voorraad oplossing als bewegingsartefacten in het optische actiepotentiaal worden opgemerkt. Voeg nog een 5 ul di-4-ANEPPS voorraadoplossing als signaal-ruis-verhouding laag is.
- Finish de ontworpen experimentele protocol voor de functionele studie. Re-vlekken op de hart met extra 5μL di-4-ANEPPS voorraad oplossing wanneer het signaal verslechtert tijdens de experimenten te wijten aan fotobleken of wash-out.
- Zet de kamer licht na de voltooiing van de functionele studie. Maak foto's van het hart van 36 gelijkmatig verdeeld hoeken. Dit wordt bereikt door het draaien van de hart op een stap van 10 ° met een digitale camera vast op de locatie van een PDA.
- Haal het hart uit de kamer. Giet alle oplossingen. Was de perfusie-systeem in de volgorde van de DI-water, 70% reagens alcohol, en weer DI water.
- Data-analyse omvat de reconstructie van het hart geometrie van de 36 digitale foto's, de registratie van het optische signaal op het oppervlak van de gereconstrueerde geometrie, en de kwantificering van actie potentiaal duur (APD), geleidingssnelheid (CV), fase, enz. 6
4. Uitvoeren van experimenten met behulp van de Dual Mapping System
- (Ga na deel 2) Plaats de canule hart in een glazen kamer (Radnoti) en sluit de canule op de perfusie-systeem. Vastpinnen het hart naar het silicium bodem van de kamer op de ventriculaire apex en atria.
- Zet de kamer licht. Injecteer langzaam blebbistatin stockoplossing (15 ~ 20 min tot 10μM te bereiken) via de injectiepoort voorafgaand aan de perfusie canule naar het hart te immobiliseren.
- Leg een plastic petrischaaltje of andere glazen venster te dekken, boven de epicardiale oppervlak om de beweging van de oplossing oppervlak te verminderen.
- Focus twee CMOS-camera's in het duale mapping systeem (Ultima-L, SciMedia) in hetzelfde beeldveld. Uitgezonden fluorescentie wordt gescheiden door een dichroïsche spiegel (635nm cutoff, Omega Optical) en gefilterd door een 700nm longpass filter (Thorlabs) voor spanning signalen en met een 590/30 nm bandpass filter (Omega Optical) voor calcium signalen.
- Richt de lichtgeleiders van twee halogeenlampen (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) naar het in kaart brengen gezichtsveld zelfs verlichting te bereiken. Excitatie filters (531/40 nm, SemRock) worden gebruikt.
- Vlek het hart met de voltage-gevoelige kleurstof RH 237 stockoplossing (10 ~ 30 pi) via de injectiepoort.
- Meng de Rhod-2AM (0,2 ml) voorraad oplossing met Pluronic F-127 (Invitrogen, 01:01 mengsel). Sonificeer 1 minuut in een waterbad ultrasoonapparaat. Injecteer het mengsel via poort de bel Trapper's. Wacht ongeveer 20 minuten om de de-verestering van de Rhod-2 AM voor in kaart brengen van start.
- Voor een opname, schakelt u de superfusie pomp om beweging te voorkomen aan het oppervlak van de oplossing, zet de excitatie lichtbron (de halogeen lampen); nemen optische opnamen met behulp van beide camera's aangesloten op het data-acquisitie-systeem (Ultima-L, SciMedia) , zet de excitatie licht, en zet de superfusie pomp. Controleer de kwaliteit van de optische signalen. Re-vlekken op de weefsel indien nodig.
- Werk de rest van de ontworpen experimentele protocol voor een studie.
- Zet op de kamer licht en neem een foto van het hart met het gezichtsveld. Haal het hart uit de kamer. Giet alle oplossingen. Was de perfusie-systeem in de volgorde van de DI-water, 70% reagens alcohol (Fisher Scientific) en DI water.
- Data-analyse bevat metingen van APD, CV, calcium voorbijgaande duur (CaTD), de vertraging tussen AP ophaal en Cat stijgen, de stijgtijd van het calcium van voorbijgaande aard, en de tijd constante van een monoexponential pasvorm van de CAT verval.
Representatieve resultaten:
Figuur 1. Representatieve resultaten van een Langendorff-doorbloed konijn experiment met behulp van de panoramische optische mapping systeem. (A) De voorste uitzicht over de konijn hart en de gereconstrueerde konijn hart geometrie in de vorm van een drie-dimensionale mesh-grid oppervlak. (B) Thij ongeopende epicardiale oppervlak kleur gecodeerd door de fase (verkregen uit de fase vlak-analyse 18) met vermelding van het golffront in rood aangegeven tijdens een aanval van tachycardie. (C) De optische actiepotentiaal opnames van vijf locaties in de fase van singulariteit gekenmerkt wordt door 1-5 in panel B. (D) Acht foto's van activering golffront (rode kleur) propagatie tijdens een cyclus van een stabiele reentrant aritmie. Het golffront cirkels met de klok mee rond een singulariteit fase, die zichtbaar is op de voorste oppervlak van het hart. De kleur voor de repolarisatie (blauw) is ingesteld om te worden gedeeltelijk doorzichtig, zodat de achterste golffront zichtbaar is (bijvoorbeeld op 80ms, 100ms, 120ms en). Een filmpje van deze re-entry aritmie is voorzien in de aanvullende video 1. De methoden voor geometrie wederopbouw, signaal registratie, berekening van de fase-kaart, en oppervlakte uitpakken worden beschreven in de details elders 6.
Figuur 2. Representatieve resultaten van een Langendorff-doorbloed konijn hart experiment met de dubbele mapping systeem (gelijktijdig in kaart brengen van actiepotentiaal en calcium van voorbijgaande aard). (A) De voorste oppervlak van het hart met het in kaart brengen gezichtsveld onder de zwarte stippen. (B) Een close-up bekijken van opnames van een site. (C) Voorbeeld sporen van actiepotentiaal (blauw) en calcium van voorbijgaande aard (rood) uit een serie van gelijkmatig verdeelde locaties gekenmerkt door de zwarte stippen in paneel A. Merk op dat niet alle pixels opnames worden getoond en de ruimtelijke resolutie is 200μm.
Discussion
Gebaseerd op onze ervaring, de sleutel voor een succesvolle Langendorff-doorbloed konijn hart experiment zijn goed voorbereid Tyrodes 'oplossing, snelle oogst van het hart, goed onderhouden perfusiedruk, en passende pH van de zuurstof oplossing in de perfusie-systeem. Om het signaal met de hoogste mogelijke signaal-ruisverhouding te nemen, moeten we factoren, waaronder de lichtbron, optische filters, met de nadruk optica, fotodetectoren, etc 19 overwegen. Details van deze aspecten worden elders 19 besproken. Jonge konijnen (leeftijd: 4-5 maanden; gewicht: 7-9 pond) kunnen worden gebruikt om de epicardiale vet, die het signaal afneemt tot ruis verhouding van de optische signalen te vermijden.
Het signaal opgenomen door elke pixel is een gewogen integratie van het uitgestraalde licht van een volume van weefsel. De diepte van het weefsel volume hangt af van de excitatie en emissie golflengtes van de gebruikte kleurstof. Voor di-4-ANEPPS, als voorbeeld, de geschatte indringdiepte is 300μm in het konijn hart 20. Daarom moet de interpretatie van het optische signaal worden gedaan met de nodige voorzichtigheid bij de lokale heterogeniteit van de elektrische functie aanwezig zijn in sinusknoop, atrioventriculaire knoop, en tijdens de ventriculaire aritmie 1,21,22.
Een beperking van de optische mapping techniek in vergelijking met elektrode opname is dat de repolarisatie fase van de optische actiepotentiaal vaak wordt vervormd door beweging artefacten veroorzaakt door cardiale contractie. Mechanische beperking kan worden gebruikt om het artefact te verminderen, maar kan niet volledig te elimineren. Ter vergelijking, farmacologische excitatie-contractie uncouplers zijn effectief in het verwijderen van de bewegingsartefacten. Echter, kunnen deze uncouplers (bijv. 2,3-butaandion Monoxime) hebben significant elektrofysiologische bijwerkingen. Blebbistatin was aangetoond dat geen nadelige bijwerkingen op de elektrofysiologie van het hart in het normale hart 23 hebben, en is dus een veelbelovend ontkoppelrail voor optische mapping. Opgemerkt moet worden dat de versnelling van oedeem als gevolg van de afschaffing van de contractie ook kan de elektrofysiologie beïnvloeden.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
NIH geeft R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, 21-33 (2004).
- Panfilov, A. V. Is heart size a factor in ventricular fibrillation? Or how close are rabbit and human hearts? Heart Rhythm. 3, 862-864 (2006).
- Maier, L. S., Bers, D. M., Pieske, B. Differences in Ca(2+)-handling and sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-content in isolated rat and rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol. 32, 2249-2258 (2000).
- Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 1382-1391 (2000).
- Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J Biomed Opt. 12, 044019-044019 (2007).
- Lou, Q., Ripplinger, C. M., Bayly, P. V., Efimov, I. R. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
- Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 1219-1229 (2004).
- Li, W., Ripplinger, C. M., Lou, Q., Efimov, I. R. Multiple monophasic shocks improve electrotherapy of ventricular tachycardia in a rabbit model of chronic infarction. Heart Rhythm. 6, 1020-1027 (2009).
- Ripplinger, C. M., Lou, Q., Li, W., Hadley, J., Efimov, I. R. Panoramic imaging reveals basic mechanisms of induction and termination of ventricular tachycardia in rabbit heart with chronic infarction: implications for low-voltage cardioversion. Heart Rhythm. 6, 87-97 (2009).
- Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts (abstract). Circulation. 90, 632-632 (1994).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Fast, V. G., Ideker, R. E. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures. J Cardiovasc Electrophysiol. 11, 547-556 (2000).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, 2053-2060 (2001).
- Choi, B. R., Burton, F., Salama, G. Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome. J Physiol. 543, 615-631 (2002).
- Hwang, G. S. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Lou, Q., Efimov, I. R. Enhanced susceptibility to alternans in a rabbit model of chronic myocardial infarction. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4527-4530 (2009).
- Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochem Biophys Res Commun. 320, 1020-1025 (2004).
- Bray, M. A., Wikswo, J. P. Considerations in phase plane analysis for nonstationary reentrant cardiac behavior. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 65, 051902-05 (2002).
- Fast, V. Recording action potentials using voltage-sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).
- Knisley, S. B. Transmembrane voltage changes during unipolar stimulation of rabbit ventricle. Circ Res. 77, 1229-1239 (1995).
- Bishop, M. J. The role of photon scattering in optical signal distortion during arrhythmia and defibrillation. Biophys J. 93, 3714-3726 (2007).
- Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, 255-271 (2010).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, 619-626 (2007).
