Summary
В этой статье описаны основные процедуры проведения оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика использованием панорамной системы визуализации, а также двойное (напряжение и кальция) изображения модальности.
Abstract
Оптическое изображение и флуоресцентных зондов существенно передовые методологии исследования в области сердечной электрофизиологии способами, которые не могли быть выполнены другими приближается к 1. С помощью кальция и напряжения чувствительных красителей, оптические отображение позволяет измерять трансмембранных потенциалов действия и кальция переходные процессы с высоким пространственным разрешением без физического контакта с тканью. Это делает измерения электрической активности сердечной возможно при многих условиях, когда использование электродов неудобно или невозможно 1. Например, оптические записи предоставлять точную морфологические изменения мембранного потенциала во время и сразу после стимуляции и дефибрилляции, в то время как обычные методы электрода страдают от стимул-индуцированной артефакты во время и после стимулов из-за поляризации электродов 1.
Langendorff-перфузии сердца кролика является одним из наиболее изученных моделей человеческой физиологии и патофизиологии сердца. Многие виды аритмии наблюдались клинически могут быть обобщены в модели сердца кролика. Было показано, что волновые паттерны в сердца кролика при желудочковой аритмии, определяется эффективный размер сердца и длины волны спускаемого, очень похожи на том, что в человеческом сердце 2. Было также показано, что критические аспекты возбуждения-сжатия (ЕС) связи в миокарде кролика, такие как относительный вклад саркоплазматического ретикулума (СР), очень похожи на человеческие связи ЕС 3. Здесь мы приводим основные процедуры оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика, в том числе системы Langendorff перфузии установки, оптические картографические системы установки, изоляции и катетеризации сердца, перфузии и красителя окрашивание сердца, возбуждение-сокращение расстыковки и сбор оптических сигналов. Эти методы могут быть также применены к сердцу от видов, кроме кролика с корректировкой расхода, оптика, растворов и др.
Два оптических систем отображения описаны. Панорамная система отображения используется для отображения всей эпикарда из сердца кролика 4-7. Эта система обеспечивает глобальный взгляд на эволюцию возвратных схем во время arrhythmogenesis и дефибрилляции, и был использован для изучения механизмов развития аритмий и antiarrhythmia терапии 8,9. Двойная система отображения используется для сопоставления потенциала действия (AP) и кальция переходных (КПП) одновременно с того же поля зрения 10-13. Такой подход расширил наше понимание важной роли кальция в электрических альтернации и индукции аритмии 14-16.
Protocol
1. Подготовка
- Подготовка недавно решение сделаны Tyrodes '(в мм, 128,2 NaCl, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 4 PO, 1,05 2 MgCl, 20,0 NaHCO 3, и 11,1 глюкозы). Для ускорения ежедневно приготовления растворов, подготовить два растворы заранее и хранить их при температуре +4 ° С холодильник: (1) Фото со я (в g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) и (2) Фото со II (в g/2L, 84,01 NaHCO 3). Для того, чтобы 2L решения Tyrodes "достаточный для одного эксперимента принять 1840mL деионизированной воды и смешать в ней 80 мл на месте я, 80 мл на месте II, и 4 г глюкозы.
- Подготовка исходных растворов красителей и разобщители: (1) возбуждение-сокращение разобщающий агент blebbistatin маточного раствора (Tocris Bioscience, 2mg/mL решение в ДМСО), (2) напряжение-чувствительных красителя ди-4-ANEPPS маточного раствора (Invitrogen, 1mg/mL раствор в ДМСО), (3) напряжение чувствительных красителей RH 237 маточного раствора (Invitrogen, 1.25mg/ml решение в ДМСО); (4) кальция индикатор Rhod-2 утра маточного раствора (Invitrogen, 1mg/ml решение в ДМСО). Одного эксперимента кролика требует примерно 30 мкл ди-4-ANEPPS маточный раствор, 30 мкл RH237 маточного раствора и 200 мкл Rhod-2 утра маточного раствора. Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания, мы храним 100 мкл аликвоты ди-4-ANEPPS при температуре -20 ° C. Другие красители также хранятся при температуре -20 ° C. Магазин растворенного blebbistatin в холодильнике +4 ° C.
- До уборки сердце, перекачки раствора Tyrodes "в 2 л бутылки и поместите его в водяной бане (Fisher Scientific), который поддерживает температуру раствора при температуре 37 ° C. Решение кислородом с 95% O 2 - 5% СО 2. РН поддерживается на уровне 7,35 ± 0,05, регулируя уровень оксигенации. Решение распространяется в системе перфузии Langendorff и фильтруется нейлона чистый фильтр (размер пор: 11μm, Millipore), помещенные в перфузии линии до канюли.
- Подготовка оборудования для мониторинга до уборки сердце. Датчик давления (WPI) используется для контроля аортального давления во время эксперимента. Базовый из датчика давления регулируется нулю мм рт.ст., когда сердце не прикреплен к перфузионной системы. Псевдо-ЭКГ электроды помещаются в камеру приблизить Ведущий I, II, III и из Эйнтховен треугольник ЭКГ.
2. Заготовка и перфузии сердца кролика
- Fix кролика кролика фиксатор. Эвтаназии кролика внутривенного введения натрия фенобарбитала (50 мг / кг) с 2000 гепарин U. Когда кролик полностью эвтаназии, которая определяется отсутствием боли рефлекс, грудной полости быстро открывается и сердце и легкие вырезали.
- Сделайте разрез в верхней части восходящей аорты перед всеми ветвями дуги аорты. Промойте воздух из восходящей аорты, а затем быстро вводить иглу сердце 16 мм, канюля, которая была ранее подключенную к пузырь охотника, что очень важно для поддержания воздух из коронарных артерий. Как только сердце ретроградно перфузии не в рециркуляционной системе перфузии Langendorff, сделать разрез, чтобы открыть перикарда быстро.
- Удалить легких, трахеи, жира и соединительной ткани, в то время как кровь смывается от перфузии.
- Очень важно! Силиконовые трубки (~ 3 см в длину и 2 мм в диаметре) вводится через легочную вену и митральный клапан в левый желудочек (LV) и держат там в течение всего эксперимента. Эта трубка релизы решение, которое удерживается в LV. Без обращения в течение нескольких часов во время Langedorff-перфузионных эксперимент в механически иммобилизованных сердце, она, скорее всего, причиной тяжелой ишемии в полости ЛЖ и производить аритмии.
- Перемещение сердца с канюлей для рециркуляции Langendorff-перфузионной системы с оптической аппаратуры отображения.
3. Проведение экспериментов с использованием Панорамный Оптические картографической системы
- Место в сердце на заказ шестиугольник камеры и подключить канюли для перфузии системы. Поддерживать аортального давления при температуре 60 ± 5 мм рт.ст., регулируя скорость потока перфузионного насоса. Монитор привести я псевдо-ЭКГ. Поддержание рН в пределах 7,35 ± 0,05.
- Выключите комнате свет, потому что это blebbistatin photoinactivated УФ и нижний конец (450-490 нм), 17 из видимой части спектра. Медленно вводить blebbistatin маточного раствора через инъекции порт в воздухе пузырь охотника расположенный над канюли. Медленно вводят 0,1 мл на каждые blebbistatin болюсной инъекции. Подождите, пока давление стабилизироваться до следующей инъекции.
- Аккуратно ходить электрод на место специфичные для вашего эксперимента.
- Фокус изображения сердца в матовое стекло расположено на плоскости изображения каждого фотодиод массив (PDA) из трехравномерно расположенных углы вокруг сердца. Отрегулируйте положение канюли и расстояния между КПК и сердце, чтобы вписаться в сердце поля-обзора всех трех КПК. Возьмите картину каждого сфокусированное изображение в матовом стекле.
- Медленно вводят 10 ~ 20 мкл ди-4-ANEPPS маточного раствора через инъекции порт в воздухе пузырь ловушка, в перфузии раствором. Подождите 1 ~ 3 минуты, прежде чем принимать оптические записи.
- Для первой записи, включить зеленый цвет светодиода (без фильтра возбуждения, светодиодные FLOOD, Lumileds), возьмите оптические записи одновременно с трех КПК связано с заказной системой сбора данных, 5 и выключать светодиод. Проверьте качество сигналов от различных пикселях всех трех КПК. Добавить 0,1 ~ 0,2 мл blebbistatin маточного раствора, если артефакты движения в оптический потенциал действия заметили. Добавьте еще 5 мкл ди-4-ANEPPS маточного раствора, если сигнал-шум низкий.
- Готово разработан экспериментальный протокол для функционального исследования. Повторное пятно сердца с дополнительными 5 мкл ди-4-ANEPPS маточного раствора, если сигнал ухудшается во время экспериментов из-за фотообесцвечивания или вымывания.
- Включите комнате свет после завершения функциональные исследования. Сфотографируйте сердце из 36 равномерно распределенных точек зрения. Это достигается с помощью вращающихся сердца с шагом 10 ° с помощью цифровой камеры фиксируется на месте одного КПК.
- Возьмите сердце из камеры. Слейте все решения. Вымойте перфузии системы в последовательности DI воды, 70% реагента алкоголя, и снова DI воды.
- Анализ данных включает в себя реконструкцию сердцу геометрию из 36 цифровых фотографий, регистрации оптического сигнала на поверхность реконструированы геометрии, и количественная оценка длительности потенциала действия (АПД), скорости проведения (CV), фазы и т. д. 6
4. Проведение экспериментов с использованием двойного картографической системы
- (Продолжить после часть 2) Место канюлированные сердца в камере стекла (Radnoti) и подключить канюли для перфузии системы. Придавить сердце кремния нижней камере при желудочковой вершины и предсердия.
- Выключите комнате свет. Медленно вводить blebbistatin маточного раствора (15 ~ 20 минут до достижения 10 мкм) с помощью инъекции порта до перфузии канюли для иммобилизации сердце.
- Положите пластиковой чашке Петри, или другое покрытие оконных стекол, выше эпикардиальных поверхность, чтобы уменьшить движение поверхности раствора.
- Фокус два CMOS-камер в двойную систему отображения (Ultima-L, SciMedia) на одном поле зрения. Излучаемого флуоресценции отделяется дихроичных зеркала (635 отсечки, Омега оптический), и фильтруется 700 нм longpass фильтр (Thorlabs) для сигналов напряжения и 590/30 нм полосовой фильтр (Омега оптический) для кальция сигналов.
- Цель световоды из двух галогеновых ламп (Newport Oriel Instruments, Стратфорде, штат Коннектикут; SciMedia, Коста Меса, Калифорния) в сторону отображение поля зрения, чтобы достичь еще освещения. Возбуждение фильтры (531/40 нм, SemRock) используются.
- Пятно сердца с напряжением чувствительных красителей RH 237 маточного раствора (10 ~ 30 мкл) с помощью инъекции порт.
- Смешайте Rhod-2 утра (0,2 мл) стандартного раствора с Pluronic F-127 (Invitrogen, 1:1 смеси). Разрушать ультразвуком в течение 1 мин в водяной бане sonicator. Inject смесь через порт пузырь охотника. Подождите примерно 20 минут, чтобы де-этерификации Rhod-2 утра до отображения начинается.
- Для одной записи, выключите superfusion насос, чтобы избежать движения на поверхности раствора; включите источник возбуждающего света (галогенные лампы); принимать оптические записи на основе обеих камер, подключенных к системе сбора данных (Ultima-L, SciMedia) ; отключить возбуждающего света, а также включить superfusion насоса. Проверьте качество оптических сигналов. Повторная окраска тканей, если это необходимо.
- Готово остальной разработан экспериментальный протокол для исследования.
- Включите комнате свет и сфотографировать сердце, содержащей поле зрения. Возьмите сердце из камеры. Слейте все решения. Вымойте перфузии системы в последовательности DI воды, 70% реагента спирт (Fisher Scientific), Д. И. водой.
- Анализ данных содержит измерений APD, CV, кальция переходных продолжительность (CaTD), задержка между AP движении вверх и CaT расти, время нарастания переходной кальция, а постоянная времени monoexponential приступе CaT распада.
Представитель Результаты:
Рисунок 1. Представителю результаты Langendorff-перфузии кроликов эксперимент с использованием панорамной оптической системы отображения. (А) спереди сердца кролика и реконструировано геометрии сердце кролика в виде трехмерной сетки сетки поверхности. (В) Тон развернул эпикардиальных поверхности цветные по фазе (полученные из анализа фазовой плоскости 18) с указанием волнового фронта отображается красным цветом во время эпизода тахиаритмия. (С) оптического потенциала действия записи из пяти местах вокруг фазовой сингулярности отмечен 1-5 в панели Б. (D) восемь снимков активации волнового фронта (красный цвет) распространения во время цикла стабильного повторно аритмией. Волнового фронта круги по часовой стрелке вокруг фазовой сингулярности, который виден на передней поверхности сердца. Цвет для реполяризации (синий) установлен быть частично прозрачными, так что задний фронт волны видимого (например, в 80 мс, 100 мс, 120 мс, а). Фильм об этой аритмии повторно представлена в дополнительном видео 1. Методы геометрии реконструкции, регистрации сигналов, расчета фазовых карте, а поверхность развертки подробно описаны в другом месте 6.
Рисунок 2. Представителю результаты Langendorff-перфузии сердца кролика эксперимент с использованием двойной системы отображения (одновременное отображение потенциала действия и кальция переходных). (А) передней поверхности сердца с отображением поля зрения покрыты черными точками. (B) крупным планом записей с одного сайта. (C) Образцы следы потенциала действия (синий) и кальция переходных (красный) из массива равномерно расположенных местах отмечены черными точками в примечании панели А., что не все записи пикселей показаны и пространственным разрешением 200 мкм.
Discussion
Основываясь на нашем опыте, ключи для успешной Langendorff-перфузии эксперимент сердце кролика включают хорошо подготовленный Tyrodes "решение, быстрый урожай сердце, ухоженные перфузионного давления, а также соответствующие рН кислородом раствора в перфузионной системе. Для записи сигнала с максимально возможной сигнал-шум, мы должны рассмотреть факторы, включая источник света, оптические фильтры, фокусирующей оптикой, фотоприемников и т.д. 19. Подробная информация об этих аспектах, обсуждаются в другом месте 19. Молодые кролики (возраст: 4-5 месяцев, вес: 7-9 фунтов) могут быть использованы, чтобы избежать эпикардиальных жира, что снижает отношение сигнал-шум в оптических сигналов.
Сигнал записан каждый пиксель представляет собой взвешенное интеграции излучаемого света от объема ткани. Глубина этой ткани объем зависит от возбуждения и излучения длиной волны красителя. Для ди-4-ANEPPS, как, например, оценкам глубина проникновения 300μm в сердца кролика 20. Таким образом, интерпретация оптического сигнала должно быть сделано с большой осторожностью, когда местные неоднородности электрических функции присутствуют в синусового узла, атриовентрикулярная узла, а во время желудочковой аритмии 1,21,22.
Одним из ограничений оптической техники отображение по сравнению с электродом записи является то, что фазы реполяризации оптического потенциала действия часто distored движением артефакт вызван сердечного сокращения. Механические ограничения могут быть использованы для уменьшения артефактов, но не может полностью устранить его. Для сравнения, фармакологические возбуждение-сокращение разобщители эффективны в удалении движения артефакт. Однако эти разобщители (например, 2,3-бутандион Monoxime) может иметь значительные электрофизиологических побочных эффектов. Blebbistatin был продемонстрирован иметь никаких негативных побочных эффектов на сердечно электрофизиологии в нормальное сердце 23, и, таким образом, перспективным разобщающий агент для оптического отображения. Следует отметить, что ускорение отеков, вызванных отменой сокращение может также повлиять на электрофизиологии.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
NIH гранты R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, 21-33 (2004).
- Panfilov, A. V. Is heart size a factor in ventricular fibrillation? Or how close are rabbit and human hearts? Heart Rhythm. 3, 862-864 (2006).
- Maier, L. S., Bers, D. M., Pieske, B. Differences in Ca(2+)-handling and sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-content in isolated rat and rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol. 32, 2249-2258 (2000).
- Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 1382-1391 (2000).
- Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J Biomed Opt. 12, 044019-044019 (2007).
- Lou, Q., Ripplinger, C. M., Bayly, P. V., Efimov, I. R. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
- Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 1219-1229 (2004).
- Li, W., Ripplinger, C. M., Lou, Q., Efimov, I. R. Multiple monophasic shocks improve electrotherapy of ventricular tachycardia in a rabbit model of chronic infarction. Heart Rhythm. 6, 1020-1027 (2009).
- Ripplinger, C. M., Lou, Q., Li, W., Hadley, J., Efimov, I. R. Panoramic imaging reveals basic mechanisms of induction and termination of ventricular tachycardia in rabbit heart with chronic infarction: implications for low-voltage cardioversion. Heart Rhythm. 6, 87-97 (2009).
- Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts (abstract). Circulation. 90, 632-632 (1994).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Fast, V. G., Ideker, R. E. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures. J Cardiovasc Electrophysiol. 11, 547-556 (2000).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, 2053-2060 (2001).
- Choi, B. R., Burton, F., Salama, G. Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome. J Physiol. 543, 615-631 (2002).
- Hwang, G. S. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Lou, Q., Efimov, I. R. Enhanced susceptibility to alternans in a rabbit model of chronic myocardial infarction. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4527-4530 (2009).
- Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochem Biophys Res Commun. 320, 1020-1025 (2004).
- Bray, M. A., Wikswo, J. P. Considerations in phase plane analysis for nonstationary reentrant cardiac behavior. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 65, 051902-05 (2002).
- Fast, V. Recording action potentials using voltage-sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).
- Knisley, S. B. Transmembrane voltage changes during unipolar stimulation of rabbit ventricle. Circ Res. 77, 1229-1239 (1995).
- Bishop, M. J. The role of photon scattering in optical signal distortion during arrhythmia and defibrillation. Biophys J. 93, 3714-3726 (2007).
- Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, 255-271 (2010).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, 619-626 (2007).
