Summary
Den här artikeln beskrivs grundläggande rutiner för optisk kartläggning experiment i Langendorff-perfusion kanin hjärta med panoramautsikt bildsystem, och de dubbla (spänning och kalcium) avbildning modalitet.
Abstract
Optisk avbildning och fluorescerande prober har åstadkommit betydande framsteg forskningsmetodik inom hjärtats elektrofysiologi på ett sätt som inte hade kunnat uppnås genom andra metoder 1. Med hjälp av kalcium-och spänning-känsliga färgämnen, gör optisk kartläggning mätning av potentialer transmembrana åtgärder och transienter kalcium med hög rumslig upplösning utan fysisk kontakt med vävnad. Detta gör mätningar av hjärtats elektriska aktivitet möjligt under många förhållanden där användning av elektroderna är obekvämt eller omöjligt 1. Till exempel optiska inspelningar tillhandahålla korrekt morfologiska förändringar av membran potential under och omedelbart efter stimulering och defibrillering, medan konventionell elektrod tekniker lider av stimulans-inducerad artefakter under och efter stimuli pga elektrod polarisering 1.
Den Langendorff-perfusion kanin hjärta är en av de mest studerade modeller av mänskligt hjärta fysiologi och patofysiologi. Många typer av arytmier sågs kliniskt kunde skall redovisas i kanin hjärtat modell. Det visade sig att vågen mönster i kanin hjärtat under ventrikulära arytmier, bestäms av effektiva storleken på hjärtat och våglängd av återinträde, är mycket lik den i människans hjärta 2. Det var också visat att kritiska aspekter av excitation-kontraktion (EG) kopplingen i kanin hjärtmuskeln, till exempel den relativa betydelsen av sarkoplasmatiska retiklet (SR), är mycket lik människans EG koppling 3. Här presenterar vi de grundläggande förfarandena för optisk kartläggning experiment i Langendorff-perfusion kanin hjärtan, inklusive Langendorff perfusionen systeminställningsprogrammet den optiska kartläggning setup, isolering och kanylering av hjärtat, perfusion och färg-färgning av hjärtat, excitation-kontraktion frånkoppling, och insamling av optiska signaler. Dessa metoder kan också tillämpas på hjärtat från andra arter än kanin med justeringar av flöden, optik, lösningar etc.
Två optiska kartläggning beskrivs. Det panoramautsikt kartläggning system används för att kartlägga hela epikardiet av kaninen hjärtat 4-7. Detta system ger en övergripande bild av utvecklingen av reentrant kretsar under arrhythmogenesis och defibrillering, och har använts för att studera mekanismerna för arytmier och antiarrhythmia terapi 8,9. Det dubbla kartläggning system används för att kartlägga aktionspotentialens (AP) och kalcium övergående (CAT) samtidigt från samma synfält 10-13. Detta tillvägagångssätt har fördjupat vår förståelse av den viktiga roll som kalcium i elektriska alternans och framkallande av arytmi 14-16.
Protocol
1. Förberedelser
- Förbered nybakade Tyrodes "lösning (i mm, 128,2 NaCl, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3 och 11,1 glukos). För att påskynda den dagliga beredning av lösningar, förbereda två stamlösningar i förväg och lagra dem på +4 ° C kylskåp: (1) Stock Jag (i g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) och (2) Lager II (i g/2L, 84,01 NaHCO 3). För att göra 2L av Tyrodes "lösning tillräckligt för ett experiment tar 1840mL avjoniserat vatten och blanda i det 80 ml på lager I, 80 ml på lager II, och 4g av glukos.
- Bered stamlösningar av färgämnen och uncouplers: (1) excitation-kontraktion uncoupler blebbistatin stamlösning (Tocris Bioscience, 2mg/mL lösning i DMSO), (2) spänningskänsliga dye di-4-ANEPPS stamlösning (Invitrogen, 1mg/ml lösning i DMSO), (3) spänningskänsliga färgämne RH 237 stamlösning (Invitrogen, 1.25mg/ml lösning i DMSO), (4) kalcium indikator Rhod-2:00 stamlösning (Invitrogen, 1mg/ml lösning i DMSO). En enda kanin experiment kräver cirka 30 mikroliter av di-4-ANEPPS stamlösning, 30 mikroliter av RH237 stamlösning och 200 mikroliter av Rhod-2:00 stamlösning. För att undvika upprepad frysning och upptining, lagrar vi 100 mikroliter alikvoter av di-4-ANEPPS vid -20 ° C. Andra färger är också förvaras vid -20 ° C. Förvara upplöst blebbistatin i +4 ° C kylskåp.
- Före skörd hjärtat, överföring Tyrodes "lösning i 2L flaska och placera den i ett vattenbad (Fisher Scientific) som upprätthåller den lösning temperaturen vid 37 ° C. Lösningen är syresatt med 95% O 2 - 5% CO 2. PH-värdet hålls på 7,35 ± 0,05 genom att justera syresättning nivå. Lösningen cirkuleras i Langendorff perfusionen systemet och filtreras genom ett nylonnät filter (porstorlek: 11μm, Millipore) placeras i perfusionen linje innan kanylen.
- Förbered övervakningsutrustning före skörd hjärtat. En tryckgivare (WPI) används för att övervaka aorta trycket under experimentet. Baslinjen för tryckgivaren justeras till noll mmHg när hjärtat inte är ansluten till perfusion systemet. Pseudo-EKG-elektroder placeras i kammaren att närma Lead I, II och III i Einthoven triangeln EKG.
2. Skörd och perfusion av Rabbit Hjärtan
- Fäst kanin i kanin restrainer. Euthanize kaninen av en intravenös injektion av natrium pentobarbital (50 mg / kg) med 2000 U heparin. När kaninen är helt avlivas, som bestäms av bristen av smärta reflex är brösthålan snabbt öppnas och hjärtat och lungorna är censurerade.
- Gör ett snitt i den övre delen av aorta ascendens innan alla grenar av aortabågen. Spola ut luften från aorta ascendens och sedan snabbt cannulate hjärtat till en 16-gauge kanyl, som tidigare har fäst en bubbla trapper som är mycket viktigt för att hålla luften ur hjärtinfarkt. När hjärtat är retrogradely perfusion i en icke-recirkulerande Langendorff perfusion systemet, gör ett snitt för att öppna hjärtsäcken snabbt.
- Ta bort lunga, luftstrupe, fett och bindväv, medan blodet spolas ut av perfusion.
- Mycket viktigt! En silikonslang (~ 3cm långa och 2 mm i diameter) förs in genom en pulmonell ven och mitralisklaffstenos i vänster kammare (LV) och hålls kvar där under hela försöksperioden. Detta röret släpper den lösning som är fångade i LV. Utan cirkulation i timmar under Langedorff-perfusionen experiment i ett mekaniskt immobiliserade hjärtat, är det sannolikt att orsaka allvarlig ischemi i LS hålrum och producera arytmi.
- Flytta hjärtat med kanylen till recirkulerande Langendorff-perfusion system med den optiska kartläggning apparaten.
3. Utför experiment med hjälp av Panorama Optisk Mapping System
- Placera hjärta i en skräddarsydd sexhörning kammare och ansluta kanylen till perfusion systemet. Upprätthålla aorta trycket vid 60 ± 5 mmHg genom att justera flödet av perfusion pumpen. Övervaka leda Jag pseudo-EKG. Bibehålla pH på omkring 7,35 ± 0,05.
- Stäng av rumsljus eftersom blebbistatin är photoinactivated av UV-och låga änden (450-490 nm) 17 av den synliga delen av spektrumet. Injicera långsamt blebbistatin stamlösning genom injektion hamnen i luften-bubblan trapper ovanför kanylen. Injicera långsamt 0,1 ml blebbistatin för varje bolusinjektion. Vänta tills trycket att stabilisera före nästa injektion.
- Placera försiktigt pacing elektroden på plats är specifika för din experimentell design.
- Fokusera bild av hjärtat i frostat glas ligger på bildplanet för varje foto-diod array (PDA) från trejämnt fördelade vinklar som omger hjärtat. Justera positionen av kanylen och avstånden mellan varje PDA och hjärtat för att passa hjärtat i fält-of-view av alla tre handdatorer. Ta en bild av varje fokuserad bild i frostat glas.
- Injicera långsamt 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS stamlösning genom injektion hamnen i luften-bubbelfälla i perfusion lösningen. Vänta 1 ~ 3 minuter innan optiska inspelningar.
- För den första inspelningen, vrid den gröna lysdioden (ingen excitation filter, ledde översvämning, Lumileds) på, ta optiska inspelningar samtidigt från tre handdatorer kopplade till skräddarsydda datainsamlingssystem, 5 och stänga av LED-ljus. Kontrollera kvaliteten på de signaler från olika pixlar av alla tre handdatorer. Lägg till 0,1 ~ 0,2 mL lösning blebbistatin bestånd om artefakterna i det optiska aktionspotentialens märks. Lägg till ytterligare 5 mikroliter di-4-ANEPPS stamlösning om signal-brusförhållandet är låg.
- Avsluta utformade försöksprotokoll för funktionella studier. Re-fläcken hjärtat med ytterligare 5μL di-4-ANEPPS stamlösning om signalen försämras under försöken på grund av fotoblekning eller fiasko.
- Slå på rummet ljus efter slutförandet av den funktionella studien. Ta bilder av hjärtat från 36 jämnt fördelade vinklar. Detta uppnås genom att vrida på hjärtat vid ett steg på 10 ° med en digitalkamera fast på platsen för en handdator.
- Ta hjärtat ur kammaren. Töm alla lösningar. Tvätta perfusionen systemet i sekvens av DI-vatten, 70% reagens alkohol, och igen DI-vatten.
- Dataanalys innefattar ombyggnad av hjärtat geometri från 36 digitala fotografier, registrering av den optiska signalen på ytan av den rekonstruerade geometri, och kvantifiering av aktionspotentialens duration (APD), överledning hastighet (CV), fas, etc. 6
4. Genomföra försök med Dual Mapping System
- (Fortsätt efter del 2) Placera kanylerade hjärtat i ett glas kammare (Radnoti) och anslut kanylen till perfusion systemet. Pin ner hjärtat till kisel botten av kammaren vid ventrikulär apex och Atria.
- Stäng av ljuset i rummet. Injicera långsamt blebbistatin stamlösningen (15 ~ 20 min att nå 10μM) genom injektion hamnen innan perfusion kanyl att immobilisera hjärtat.
- Sätt en plast petriskål eller annat glas fönster täcka, ovanför epicardial yta för att minska rörelsen av lösningen ytan.
- Fokus två CMOS-kameror i det dubbla kartsystem (Ultima-L, SciMedia) i samma synfält. Avgiven fluorescens är åtskilda av en dikroisk spegel (635nm cutoff, Omega optisk), och filtreras genom ett 700 nm longpass filter (Thorlabs) för spänningssignaler och med 590/30 nm bandpassfilter (Omega optisk) för kalcium signaler.
- Rikta ljusledare av två halogenlampor (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) mot kartläggning synfältet för att uppnå jämn belysning. Excitation filter (531/40 nm, SemRock) används.
- Fläck hjärtat med spänningskänsliga färgämne RH 237 stamlösningen (10 ~ 30 mikroliter) genom injektion porten.
- Blanda Rhod-2:00 (0,2) stamlösning med Pluronic F-127 (Invitrogen, 1:1 blandning). Sonikera 1min i ett vattenbad sonicator. Injicera blandningen genom bubblan trapper hamn. Vänta ca 20 minuter så att de-esterifiering av Rhod-2:00 innan kartläggning startar.
- För en inspelning, stänga av superfusion pumpen för att undvika rörelse på ytan av lösningen, slå på excitation ljuskällan (det halogenlampor), ta optiska inspelningar med båda kamerorna är anslutna till det informationsinsamlande systemet (Ultima-L, SciMedia) , stänga av excitation ljus, och slå på superfusion pumpen. Kontrollera kvaliteten på de optiska signaler. Re-fläck vävnaden vid behov.
- Slutför resten av utformats försöksprotokoll för en studie.
- Slå på rummet ljus och ta ett fotografi av hjärtat innehåller synfält. Ta hjärtat ur kammaren. Töm alla lösningar. Tvätta perfusionen systemet i sekvens av DI-vatten, 70% reagens alkohol (Fisher Scientific) och DI-vatten.
- Dataanalys innehåller mätningar av APD, CV, kalcium övergående varaktighet (CaTD), fördröjningen mellan AP upstroke och Cat stiga, stigtiden av kalcium övergående och tidskonstanten för en monoexponentiellt passa på CAT förfall.
Representativa resultat:
Figur 1. Representant resultaten av en Langendorff-perfusion kanin experimentera med panoramautsikt optiska kartsystem. (A) främre bild av kanin hjärtat och rekonstruerade kanin hjärtat geometri i form av en tredimensionell mesh-nät yta. (B) THan oöppnade epicardial ytan färgkodade från fas (från fas planet analys 18) anger vågfront visas i rött under en episod av takyarytmi. (C) Den optiska aktionspotentialens inspelningar från fem platser runt om i fas singulariteten markerade med 1-5 i panel B. (D) Åtta ögonblicksbilder av aktivering vågfront (röd färg) utbredning under en cykel på en stabil reentrant arytmi. Den vågfront cirklar medsols runt en fas singularitet, som är synlig på den främre ytan av hjärtat. Färgen för repolarisering (blå) är inställd på att vara delvis transparent så att bakre vågfront är synlig (t ex på 80 ms, 100 ms och 120 ms). En film av denna reentrant arytmi finns i kompletterande video 1. Metoderna för geometri återuppbyggnad, signal registrering, beräkning av fas karta och yta uppackning beskrivs i detalj på annat håll 6.
Figur 2. Representant resultat från en Langendorff-perfusion kanin hjärtat experimentera med dubbla kartsystem (samtidig kartläggning av aktionspotentialens och kalcium övergående). (A) främre ytan av hjärtat med kartläggningen synfält som täcks av svarta prickar. (B) En närbild av inspelningar från en webbplats. (C) Exempel spår av aktionspotentialens (blå) och kalcium övergående (röd) från en mängd jämnt fördelade platser markerade med svarta prickar i panel A Observera att inte alla pixlar inspelningar visas och den rumsliga upplösningen är 200μm.
Discussion
Baserat på våra erfarenheter, nycklarna till en framgångsrik Langendorff-perfusion kanin hjärtat experiment inkluderar vällagad Tyrodes "lösning, snabb skörd av hjärtat, välskött perfusionstryck och lämpligt pH-värde syresatt lösningen i perfusion systemet. För att spela in signalen med högsta möjliga signal-brus-förhållande, måste vi överväga faktorer som ljuskälla, optiska filter, med fokus optik, fotodetektorer, etc. 19. Information om dessa aspekter diskuteras på annat håll 19. Unga kaniner (ålder: 4-5 månader, Vikt: 7-9 pounds) skulle kunna användas för att undvika epicardial fett, vilket minskar signal-brus-förhållandet mellan den optiska signaler.
Signalen registreras av varje pixel är ett vägt integration av utsänt ljus från en mängd vävnad. Djupet i denna vävnad volym beror på excitation och emissionsvåglängder den använda färgen. För di-4-ANEPPS, som ett exempel, är det uppskattade inträngningsdjup 300μm på kanin hjärtat 20. Därför bör tolkning av den optiska signalen göras med försiktighet när den lokala heterogenitet elektrisk funktion finns i sinoatriellt nod, atrioventrikulärt nod, och under ventrikulär arytmi 1,21,22.
En begränsning av den optiska kartläggning tekniken jämfört med elektrod inspelning är att repolarisering fasen av optiska aktionspotentialens ofta distored av rörelse artefakt orsakad av hjärtats sammandragning. Mekanisk begränsning skulle kunna användas för att minska artefakt, men kan inte helt eliminera den. I jämförelse farmakologiska excitation-kontraktion uncouplers är effektiva för att ta bort rörelseartefakt. Däremot kan dessa uncouplers (t.ex. 2,3-Butanedione Monoxime) har betydande elektrofysiologiska biverkningar. Blebbistatin visade sig ha några negativa biverkningar på den hjärtats elektrofysiologi i det normala hjärtat 23, och är därmed en lovande uncoupler för optisk kartläggning. Det bör noteras att accelerationen av ödem på grund av avskaffandet av nedgången också kan påverka elektrofysiologi.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
NIH bidrag R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| Di-4-ANEPPS | Invitrogen | D1199 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, 21-33 (2004).
- Panfilov, A. V. Is heart size a factor in ventricular fibrillation? Or how close are rabbit and human hearts? Heart Rhythm. 3, 862-864 (2006).
- Maier, L. S., Bers, D. M., Pieske, B. Differences in Ca(2+)-handling and sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-content in isolated rat and rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol. 32, 2249-2258 (2000).
- Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 1382-1391 (2000).
- Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart. J Biomed Opt. 12, 044019-044019 (2007).
- Lou, Q., Ripplinger, C. M., Bayly, P. V., Efimov, I. R. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
- Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 1219-1229 (2004).
- Li, W., Ripplinger, C. M., Lou, Q., Efimov, I. R. Multiple monophasic shocks improve electrotherapy of ventricular tachycardia in a rabbit model of chronic infarction. Heart Rhythm. 6, 1020-1027 (2009).
- Ripplinger, C. M., Lou, Q., Li, W., Hadley, J., Efimov, I. R. Panoramic imaging reveals basic mechanisms of induction and termination of ventricular tachycardia in rabbit heart with chronic infarction: implications for low-voltage cardioversion. Heart Rhythm. 6, 87-97 (2009).
- Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts (abstract). Circulation. 90, 632-632 (1994).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Fast, V. G., Ideker, R. E. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures. J Cardiovasc Electrophysiol. 11, 547-556 (2000).
- Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, 2053-2060 (2001).
- Choi, B. R., Burton, F., Salama, G. Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome. J Physiol. 543, 615-631 (2002).
- Hwang, G. S. Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Circulation. 114, 2595-2603 (2006).
- Lou, Q., Efimov, I. R. Enhanced susceptibility to alternans in a rabbit model of chronic myocardial infarction. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4527-4530 (2009).
- Kolega, J. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Biochem Biophys Res Commun. 320, 1020-1025 (2004).
- Bray, M. A., Wikswo, J. P. Considerations in phase plane analysis for nonstationary reentrant cardiac behavior. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 65, 051902-05 (2002).
- Fast, V. Recording action potentials using voltage-sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).
- Knisley, S. B. Transmembrane voltage changes during unipolar stimulation of rabbit ventricle. Circ Res. 77, 1229-1239 (1995).
- Bishop, M. J. The role of photon scattering in optical signal distortion during arrhythmia and defibrillation. Biophys J. 93, 3714-3726 (2007).
- Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping. Circ Res. 106, 255-271 (2010).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4, 619-626 (2007).
