Summary
一个明确的，标准化的方法是在多个发育阶段的斑马鱼的心脏解剖和隔离。注释和定量分析技术进行了讨论。
Abstract
斑马鱼已成为一种有益和实用的模式生物，胚胎心脏发育的研究 （见1-6最近的评论），但是，工作研究通过成人心脏发育的胚胎后一直有限7-10。研究改变形态的成熟和老化的心脏被限制缺乏技术可用于分期和隔离，少年和成人的心。为了分析对鱼的寿命心脏的发展，我们在许多阶段剖析斑马鱼的心和照片作进一步的分析 11 。心脏的形态特征，可以很容易地被量化和个人的心，可以进一步分析的标准方法。斑马鱼生长在浮动利率和成熟的相关性更好，鱼比年龄大小，因此，固定后，我们作为衡量鱼成熟的鱼照片和测量长度。该协议解释两个不同的，对斑马鱼的大小而定清扫技术，从幼虫3.5mm标准长度（SL）不等，心中100μm的心室长度（VL），成年人，SL为30mm和VL1毫米或更大。幼虫和成鱼有相当不同的身体和器官形态。幼虫不仅明显变小，他们较少有色素和各器官的是视觉上很难辨别。出于这个原因，我们使用不同的夹层技术。
我们用解剖前的固定程序，我们发现，解剖后，euthanization直接的心中有一个变数较多的形态很松散，像气球心房相比，删除以下固定的心中。鱼固定剥离之前，保留在体内的形态和商会位置（数据未显示） 。此外，用于演示目的，我们采取的心脏（心肌）的具体GFP转基因TG（myl7 GFP）的优势twu34（12），这使我们看到整个心脏，并在早期阶段，特别是在发展有用的心脏时，形态是从周围组织明显。解剖的心脏原位杂交，免疫组织化学，RNA提取或其他分析方法在后胚胎斑马鱼更容易在心脏的发展和成熟使用的基本细胞和分子生物学的进一步分析。该协议将提供一个有价值的技术心脏发育成熟和老化的研究。
Protocol
斑马鱼提出了使用标准协议，在皇后学院动物设施13在28 ° C 。鱼对或组交配应预制和清洗由此产生的胚胎，并在29 ° C培养箱中。鱼类的健康，应每天检查。在受精后5天（DPF），鱼应分为坦克在10-15鱼的密度和进入鱼设施育苗。这里介绍的协议，斑马鱼幼虫通过收集成人阶段：15，30，45，60，90，180 DPF。
1。斑马鱼的主题收集和固定
- 卸下鱼栖息地槽，在0.2％Tricaine的净和地方麻醉。
- 放置15分钟，安乐死在冰水中麻醉的鱼。
- 在1x新鲜的4％多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 收集在4％煤灰的鱼在室温下1-2小时，然后过夜孵育4 ° C在培养皿封口膜包裹。这样可以使鱼的单位和以后清扫容易得多。
- 固定后，在PBS冲洗两次吐温（PBT）。鱼可保持在4 ° C至10天，在PBT。
2。鱼和解剖测量
- 一条鱼放入培养皿的一半填充用新鲜PBS躺在其右侧。
- 鱼类从吻端至尾基（尾柄）测量长度，不包括尾鳍，使用数字毫米卡尺（图1）。这是标准的长度（SL）。
- 每条鱼可分配数字/字母的组合，让个别鱼类和导致心脏解剖，要为以后的分析跟踪。输入到电子表格中的数据，包括父母的库存数量，在固定，SL测量年龄，组织基于这些标签上。
- 前清扫，标签PCR分配跟踪号码管带材和填充PBT或其他适当的解决方案作进一步的分析。
- 东方鱼腹侧方在培养皿中，而稳定与身体之间的眼睛和鳃（图2）头钳。
较小的鱼（大于12mm SL小）：
- a）使用尖锐镊子，或微针在针座，除去身体揭示心脏胸肌和鳍。在剥离过程中钳不断议案可能会导致移动的鱼在PBT的电流。特别是对于较小的鱼从而微针可以用来清除胸肌和鳍和打开体腔，这是问题。
- 一）轻轻地使用镊子舀腔心脏从心房下。另外，在一些鱼，你可能会能够消除轻轻拉动球根出和心脏的其余部分将遵循的心脏。小心，如果使用这种技术，因为它很容易被破坏的中庭的位置。如果有额外的心脏，即罚款，并可以清除后的组织。
- a）如果鱼含有心脏一种荧光标记，如TG（myl7 GFP）的twu34，解剖使用荧光灯的范围，并确认切除心脏花期（图3）。
- 一次）的心脏腔中删除，使用镊子举行的心脏和微针，消除心脏外额外的非心肌组织和心外膜衬砌。
更大的鱼（大于12mm SL）：
- b）使用弹簧处理的微型剪刀，三不大于1mm深的切口：1 - 横向穿过腮2 - 横向切割前腹3 - 腹端连接都削减矢状切（图4）。
- b）使用尖锐镊子清除体内的胸肌和鳍打开体腔，并揭示了银色心包组织（图5A）。删除这个心包组织和心脏，将成为可见（图5B）。
- b）使用的微型剪刀切断连接到球根动脉，位于优越的心脏动脉。一旦动脉被切断，下庭钳提示，使用镊子舀腔心脏。如果有额外的心脏，即罚款的，可以删除后的组织。
- b）一旦心脏是从腔中删除，用两个镊子举行的心脏，并删除多余的组织，或一对镊子举行的心脏和微针，删除多余的，非心脏组织。心外膜衬砌，其黑色的色素沉着明显，可去除心脏外，如果需要，轻轻刮组织。
3。摄影心中
- 准备23克/ L，营养琼脂培养皿中，用PBS覆盖凝固的琼脂。
- 使用镊子，在琼脂，使心脏在休息所需的方向，为拍摄好。
- 祛瘀E的PCR管钳牢牢球根的一角，从心脏。将在琼脂培养皿的心脏。
- 东方的心脏在琼脂照片。样本可旋转图片后，每到所有可能的方向（图6）。
- 使用开销轻和短的曝光时间拍摄的心。轻质量的调整，如要获得最好的照片使用曝光。
4。代表性的成果：
良好的清洁心脏解剖的一个例子是多个方向在图6所示。每个心脏有一定的差异，在整体形态，但心脏应该是完整的，包含一个完整的心室，心房和球根动脉。这种整体形态变化的一些例子，如图7所示。黑色斑点外膜组织，也可以从心脏中删除。
图1：测量从吻端至尾柄使用数字毫米卡尺的鱼。
图2。握住钳之间的眼睛和鳃鱼。
图3心脏特异荧光的转基因标记（如Tg 的 myl7：绿色荧光蛋白）。twu34，在这里显示，可以帮助在可视化较小的鱼，从解剖的心中。
图4三切口，去除胸鳍的肌肉和皮肤：1 -横向穿过腮2 -横向切割前腹3 -上矢状切开腹端连接都削减 。
图5：黑色字母标签的心脏腔：球根动脉（BA），心室（V），和庭（一）。
一个上身腔是开放的，以显示心包银色组织。
B超取出后心包，心脏是可见的，容易去除。
显示的心脏图6。不同的方向。黑色字母标签的心脏腔：球根动脉（BA），心室（V），和庭（一）。灰色箭头表示参考其在体内的正常位置的心脏的位置和方向：（一）前，后（P），背（四），腹（五），左（L）和右（R）。比例尺表示400μm。
一个心脏的腹面观
B超背的心脏
从左侧的C -侧视
从右侧的D -侧视
图7，不同大小的心的形态显示。黑色字母标签的心脏腔：球根动脉（BA），心室（V），和庭（一）。比例尺表示400微米。
AC心SL形式的鱼不大于12mm
DF -红桃SL形成鱼大于12mm
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Discussion
后胚胎鱼斑马鱼的心脏解剖这些方法使一个完好的心脏彻底清除。虽然这种技术很简单，并提供外部的削减，这将防止心脏损害的指导，一个稳定的手较小的鱼。
在夹层中的一个关键步骤是识别银色心包，心脏是直接在此囊。心包可视化提供了一个寻找和最终消除心脏形式腔体内的重要标志。此外，切割优于球根动脉的动脉将防止其他心脏的球根无意搬迁。在较大的鱼，它有时是必要的，以消除身体的下半部分包含在剥离过程中心脏稳定，以保持头部和上身。这是可以做到持续较低的横向切割，通过体腔和脊柱用剪刀。
斑马鱼的心脏解剖不仅是有用的类似的研究，我们自己的成熟度分析，但可能有用的斑马鱼，RNA在心脏的隔离，和其他分析研究利用心脏疾病状态的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
玛丽Birne，Areti Tsiola，Jaymie埃斯特韦斯和Arelys乌里韦感谢。这项工作是支持部分由纽约市立大学研究基金会和霍华德休斯医学研究所资助大学生的暑期计划（SPUR）和NIH RO3 41702-00-01。研究也支持由皇后学院和一些实验成像皇后学院，细胞和分子生物学的核心设施设备进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
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