Summary
Une méthode claire et standardisée pour la dissection et l'isolement du cœur poisson zèbre à de multiples stades de développement sont décrits. Techniques d'annotation et de quantification sont également discutés.
Abstract
Le poisson zèbre sont devenus un organisme modèle utile et pratique pour l'étude du développement embryonnaire, le cœur (voir commentaires récents 1-6), cependant, le travail examinant post-embryonnaire par le développement cardiaques adultes a été limité 7-10. Examiner la morphologie changeante du coeur de maturation et le vieillissement sont limitées par le manque de techniques disponibles pour la stadification et isoler les cœurs juvéniles et adultes. Afin d'analyser le développement cardiaque sur la durée de vie du poisson, nous disséquons coeurs poisson zèbre à de nombreux stades et les photographier pour une analyse ultérieure 11. Les caractéristiques morphologiques du cœur peuvent être facilement quantifiés et des coeurs individuels peuvent être analysés ultérieurement par une foule de méthodes standard. Zebrafish croître à des taux variables et de la maturation meilleure corrélation avec la taille des poissons que l'âge, donc, après la fixation, la longueur du poisson, nous photographier et mesurer comme un indicateur de la maturation des poissons. Ce protocole explique deux distincts, la taille de techniques de dissection à charge pour le poisson-zèbre, allant de 3,5 mm de longueur standard des larves (SL) avec des coeurs de la longueur du ventricule 100 microns (VL), aux adultes, avec SL de 30mm et VL 1mm ou plus. Poissons larvaires et adultes ont le corps bien distincts et la morphologie d'organes. Les larves ne sont pas seulement beaucoup plus petit, ils ont moins de pigments et de chaque organe est visuellement très difficiles à identifier. Pour cette raison, nous utilisons des techniques de dissection distinctes.
Nous avons utilisé des procédures pré-dissection de fixation, comme nous avons découvert que les cœurs disséqués directement après l'euthanasie ont une morphologie plus variable, avec ballon très lâche et comme oreillettes rapport avec des coeurs enlevés après fixation. Le poisson fixés avant la dissection, de conserver la morphologie in vivo et la position de chambre (données non présentées). En outre, à des fins de démonstration, nous profitons du coeur (infarctus) spécifiques GFP transgéniques Tg (myl7: GFP) twu34 (12), ce qui nous permet de visualiser le cœur entier et est particulièrement utile aux premiers stades de développement lorsque les cardiaques morphologie est moins distinctes à partir des tissus environnants. Dissection du cœur fait une analyse plus approfondie de la biologie cellulaire et moléculaire sous-jacente de développement du cœur et de la maturation en utilisant l'hybridation in situ, immunohistochimie, l'extraction d'ARN ou d'autres méthodes analytiques plus facile en post-embryonnaire du poisson zèbre. Ce protocole fournira une technique précieuse pour l'étude de la maturation et le vieillissement de développement cardiaque.
Protocol
Le poisson zèbre ont été soulevées en utilisant des protocoles standard de 13 dans l'installation de Queens College animaux à 28 ° C. Paires de poissons individuels ou de groupe accouplements doivent être préformés et les embryons ainsi obtenus nettoyés et stockés dans un incubateur à 28 ° C. La santé des poissons doivent être examinés quotidiennement. Lors de la fécondation après 5 jours (DPF), les poissons devraient être séparés dans des réservoirs à une densité de 10 à 15 poissons et est entré dans la nurserie de poissons installation. Pour le protocole présenté ici le poisson-zèbre ont été collectées à travers la larve stades adultes: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF.
1. Collecte de l'objet et la fixation de poisson zèbre
- Retirer le poisson du réservoir de l'habitat en utilisant net et le lieu de 0,2% tricaïne à anesthésier.
- Placer le poisson dans l'eau glacée anesthésié pendant 15 minutes à euthanasier.
- Faire frais paraformaldéhyde à 4% (PFA) en 1x tampon phosphate salin (PBS).
- Incuber les poissons recueillis dans 4% des PFA pendant 1-2 heures à température ambiante puis une nuit à 4 ° C dans une boîte de Pétri enveloppées dans du parafilm. Cela maintient le plat de poisson et rend la dissection plus tard, beaucoup plus facile.
- Après fixation, rincer deux fois dans du PBS avec du Tween (PBT). Le poisson peut être garder en PBT à 4 ° C pour un maximum de 10 jours.
2. Mesure de poisson et de la dissection
- Placer le poisson dans la seule moitié boîte de Pétri remplie de PBS frais et déposez-le sur son côté droit.
- Mesurer la longueur des poissons du museau à la base de la queue (le pédoncule caudal), non compris ailerons de queue, en utilisant un appareil photo numérique mm étrier (figure 1). Il s'agit de la longueur standard (SL).
- Chaque poisson peut être attribué un numéro / lettre combinaison afin de permettre un poisson et le cœur résultant disséqués pour être suivis pour une analyse ultérieure. Les données, y compris le numéro de stock parental, l'âge à la fixation, les mesures de SL, ont été saisies dans un tableur et organisée en fonction de ces étiquettes.
- Avant la dissection, bandes étiquette du tube PCR avec numéro de suivi attribué et remplir de PBT ou autre solution appropriée pour une analyse ultérieure.
- Orienter le côté ventral du poisson en boîte de Pétri tout en stabilisant le corps avec des pinces tenant la tête entre les yeux et les branchies (figure 2).
Les petits poissons (plus petite que 12mm SL):
- a) En utilisant une pince forte, ou une micro-aiguille dans un porte-broches, retirez les muscles pectoraux et les ailettes du corps pour révéler le cœur. Le mouvement constant de la pince lors de la dissection peut causer des courants dans les PBT qui déplacent les poissons. Ceci est particulièrement problématique pour les petits poissons, donc une micro-aiguille peut être utilisé pour enlever les pectoraux et les nageoires et ouvrir la cavité abdominale.
- a) l'utilisation de la pince doucement pour ramasser le cœur hors de la cavité sous l'atrium. Alternativement, dans certains poissons que vous pourrez peut-être retirer le coeur en tirant doucement sur le bulbe et le reste du coeur va suivre. Soyez prudent sur l'emplacement de l'atrium si vous utilisez cette technique car elle peut être facilement endommagé. S'il ya des tissus supplémentaire qui vient avec le cœur, c'est très bien et peut être effacé après.
- a) Si le poisson contient un marqueur fluorescent cardiaques telles que Tg (myl7: GFP) twu34, utilisez la portée fluorescentes pour la dissection et de vérifier l'ablation du cœur par la fluorescence (figure 3).
- a) Une fois que le cœur est enlevé de la cavité, utilisez la pince pour tenir le cœur et une micro-aiguille pour enlever supplémentaires non cardiaque tissus et la doublure épicardiques de l'extérieur du cœur.
Les gros poissons (plus de 12mm SL):
- b) En utilisant le printemps manipulé des micro-ciseaux, faire trois incisions de moins de 1mm de profondeur: 1 - transversale coupé à travers les 2 branchies - coupe transversale au ventre antérieur 3 - coupe sagittale sur la face ventrale reliant les deux coupes (figure 4).
- b) En utilisant une pince forte retirer les muscles pectoraux et les ailettes du corps pour ouvrir la cavité du corps et de révéler les tissus argentés du péricarde (figure 5A). Retirer ce tissu péricardique et le cœur va devenir visible (figure 5B).
- b) Utiliser les ciseaux pour couper les micro-l'artère reliée au bulbe artériel, situé au cœur supérieure. Une fois que cette artère est coupée, mettre les conseils pince sous l'atrium, utilisez la pince pour ramasser le cœur hors de la cavité. S'il ya des tissus supplémentaire qui vient avec le cœur, c'est très bien et peut être retiré plus tard.
- b) Une fois que le cœur est enlevé de la cavité, utiliser les deux pinces pour tenir le cœur et enlever le tissu supplémentaire, ou une paire de pince pour tenir le cœur et une micro-aiguille pour retirer supplémentaire, non cardiaque tissulaire. La doublure épicardiques, évidente par sa pigmentation noire, peut être enlevé de l'extérieur du coeur si désiré en grattant doucement le tissu.
3. Photographie des cœurs
- Préparer une 23g / L d'agar nutritif boîte de Pétri et la couverture d'agar solidifié avec du PBS.
- Utilisation de la pince, faire un puits dans la gélose qui permet au cœur de se reposer dans l'orientation désirée pour photographier.
- Remove au coeur du tube de PCR en tenant l'extrémité de la bulbe avec la pince fermement. Placez le coeur dans le plat d'agar.
- Orienter le cœur dans l'agar à photographier. L'échantillon peut être tourné après chaque image pour toutes les orientations possibles (figure 6).
- Utilisez le temps d'exposition généraux légère et courte pour photographier les cœurs. Faire des ajustements pour la qualité de lumière en utilisant l'exposition que nécessaire pour obtenir la meilleure photo.
4. Les résultats représentatifs:
Un exemple d'un cœur bien disséqué propre est montré dans de multiples orientations dans la figure 6. Chaque coeur aura quelques différences dans la morphologie générale, mais le cœur doit être complet, contenant un ventricule intact, atrium et artériel bulbe. Quelques exemples de cette variation dans la morphologie globale sont présentés dans la figure 7. Les taches noires épicardiques tissus peuvent également enlever du cœur.
Figure 1. Mesurer le poisson du museau au pédoncule caudal en utilisant un appareil photo numérique mm étrier.
Figure 2. Tenez le poisson avec une pince entre les yeux et les branchies.
Figure 3 Un cardiaques spécifiques marqueur fluorescent transgéniques telles que Tg (myl7: GFP). Twu34, montré ici, peut aider à visualiser les cœurs disséqués par des poissons plus petits.
Figure 4 trois incisions pour enlever les muscles pectoraux et de la peau: 1 - coupe transversale à travers les branchies 2 - coupe transversale au ventre antérieur 3 - coupe sagittale sur la face ventrale reliant les deux coupes..
. Figure 5 lettres noires le label cavités du cœur: bulbe artériel (BA), ventricule (v), et l'atrium (a).
A-La cavité supérieure du corps est ouverte pour montrer le tissu argenté du péricarde.
B-Après avoir enlevé le péricarde, le cœur est visible et facile à enlever.
Orientations Figure 6. Différents du cœur sont affichés. Lettres noires le label cavités du cœur: bulbe artériel (BA), ventricule (v), et l'atrium (a). Flèches grises indiquent l'emplacement et l'orientation du cœur en référence à son emplacement normal dans l'organisme: antérieure (A), postérieure (P), dorsale (D), ventrale (V), gauche (L) et droite (R). La barre d'échelle indique 400 microns.
A-ventrale vue sur le coeur
B-vue dorsale du cœur
C-latérale du côté gauche
D-latérale du côté droit
Figure 7. Morphologie des coeurs de différentes tailles est montré. Lettres noires le label cavités du cœur: bulbe artériel (BA), ventricule (v), et l'atrium (a). La barre d'échelle indique 400 um.
Poissons sous forme AC-Coeurs avec SL moins 12mm
Poissons forment DF-Coeurs avec SL supérieure à 12mm
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Discussion
Ces méthodes pour la dissection du cœur du poisson zèbre post-embryonnaire des poissons permet l'élimination complète d'un cœur en bon état. Bien que cette technique est simple et fournit des guides pour des coupes externes qui permettra d'éviter d'endommager le cœur, une main ferme est essentiel pour les petits poissons.
Une étape clé lors de la dissection est d'identifier le péricarde argentée comme le cœur est directement dans ce sac. Visualiser le péricarde fournit un marqueur important pour trouver et finalement enlever la forme du cœur de la cavité corporelle. De plus, la coupe de l'artère supérieure à la artériel bulbeuse empêche la suppression accidentelle de l'bulbeuse du reste du cœur. Dans les grands poissons, il est parfois nécessaire d'enlever la partie inférieure du corps pour garder le corps de la tête et le haut contenant le coeur stables pendant la dissection. Cela peut être fait par la poursuite de la baisse coupe transversale à travers la cavité du corps et la colonne vertébrale avec des ciseaux.
Dissection du cœur poisson zèbre n'est pas seulement utile pour des études semblables à notre analyse de maturation, mais peut être utile dans l'étude des états de maladie du poisson-zèbre, d'isolement d'ARN dans le cœur, et dans d'autres travaux de recherche analytique en utilisant le coeur.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Merci à Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez et Arelys Uribe. Ce travail a été soutenu en partie par CUNY Research Foundation et Howard Hughes Medical Institute Programme d'été de subvention pour les étudiants (Spur) et NIH RO3 41702-00-01. La recherche a été également soutenue par Queens College et quelques-unes des expériences ont été effectuées sur l'équipement de la Core Facility for Imaging, biologie cellulaire et moléculaire au Queens College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
