Summary
שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.
Abstract
דג הזברה הפכו אורגניזם מודל מועיל ומעשי ללימוד התפתחות הלב העוברי (ראה הסקירות האחרונות 1-6), לעומת זאת, העבודה בוחנת שלאחר עובריים באמצעות פיתוח מבוגר לב הוגבל 7-10. בחינת המורפולוגיה שינוי של הלב התבגרות והזדקנות מוגבלים על ידי חוסר של טכניקות עבור הבימוי ובידוד לבבות צעירים ומבוגרים. על מנת לנתח את התפתחות הלב על תוחלת החיים של הדגים, אנו לנתח לבבות דג הזברה בשלבים רבים לצלם אותם לניתוח נוסף 11. המאפיינים המורפולוגיים של הלב יכול בקלות לכימות ולבבות בודדים ניתן לנתח עוד יותר על ידי שורה של שיטות סטנדרטיות. דג הזברה לצמוח בקצב משתנה התבגרות בקורלציה טובה עם גודל הדג לגיל, וכך, לאחר קיבוע, אנחנו מצלמים ולמדוד אורך דגים כמדד של התבגרות הדג. פרוטוקול זה מסביר two ברורים, טכניקות גודל לנתיחה תלוי על דג הזברה, החל אורך הזחלים 3.5mm סטנדרטית (SL) עם לבבות של אורך החדר 100μm (VL), על מבוגרים, עם SL של 30mm ו VL 1mm או גדולים יותר. דגים הזחל למבוגרים יש גוף שונה לגמרי ומורפולוגיה איברים. הזחלים הם לא רק קטן יותר באופן משמעותי, יש להם פחות פיגמנט כל איבר הוא ויזואלית קשה מאוד לזהות. מסיבה זו, אנו משתמשים בטכניקות שונות לנתיחה.
השתמשנו מראש לנתיחה קיבעון הליכים, כפי שגילינו כי לבבות גזור ישירות לאחר euthanization יש מורפולוגיה משתנה יותר, עם בלון רופף מאוד כמו אטריה בהשוואה לבבות להסיר קיבוע הבאה. הדגים קבוע לפני לנתיחה, לשמור במורפולוגיה vivo ואת המיקום קאמרית (מידע לא מוצג). בנוסף, למטרות הדגמה, אנו מנצלים את הלב (שריר הלב) ספציפי GFP מהונדס Tg (myl7: GFP) twu34 (12), אשר מאפשר לנו לדמיין את הלב כולו והוא שימושי במיוחד בשלבים הראשונים בהתפתחות כאשר הלב מורפולוגיה היא ברורה פחות הרקמות הסובבות. Dissection הלב עושה ניתוח נוסף של התא וביולוגיה מולקולרית הבסיסית לפיתוח לב התבגרות משתמש הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה, מיצוי RNA או שיטות אנליטיות אחרות קל יותר דג הזברה שלאחר עובריים. פרוטוקול זה יספק טכניקה ערך לחקר הזדקנות התבגרות התפתחות הלב.
Protocol
דג הזברה הועלו באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 13 במתקן בעלי חיים בקווינס קולג' ב 28 ° C. זוגות בודדים או דגים הזדווגויות קבוצה צריכה להיות preformed ואת עוברי כתוצאה ניקה מאוחסנים 28 ° C חממה. בריאות דגים יש לבחון מדי יום. בשלב ההפריה 5 ימים פוסט (DPF), דגים צריכים להיות מופרדים לתוך טנקים בצפיפות 10-15 דג ונכנס לחדר הילדים מתקן דגים. בשביל הפרוטוקול המובא כאן דג הזברה נאספו זחל דרך שלבים מבוגר: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF.
1. דג הזברה אוסף הנושא קיבעון
- הסר דגים מטנק הגידול באמצעות נטו מקום 0.2% Tricaine להרדים.
- מקום דגים הרדים במי קרח למשך 15 דקות להרדים.
- הפוך את paraformaldehyde 4% טרי (PFA) ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
- דגירה דגים שנאספו PFA 4% עבור 1-2 שעות RT אז לילה בשעה 4 ° C בצלחת פטרי עטוף parafilm. זה שומר את הדירה דגים עושה מאוחר יותר דיסקציה הרבה יותר קל.
- לאחר קיבוע, לשטוף פעמיים PBS עם Tween (PBT). דגים אפשר לשמור PBT ב 4 ° C עד 10 ימים.
2. מדידת דגים לנתיחה
- דגים מקום יחיד לתוך חצי צלחת פטרי מלאות PBS טרי ולהניח אותה על צדה הימני.
- מדידת אורך הדג מהחרטום לבסיס של הזנב (peduncle הזנב), לא כולל סנפירי הזנב, באמצעות דיגיטלי מ"מ קליפר (איור 1). זהו אורך סטנדרטי (SL).
- כל דג ניתן להקצות מספר / אות על מנת לאפשר שילוב דגים בודדים לב גזור וכתוצאה מכך להיות במעקב לצורך ניתוח מאוחר יותר. הנתונים, לרבות מספר המניות הורית, גיל קיבעון, מדידות SL, נכנסו לתוך גיליון אלקטרוני ומאורגן על התוויות הללו.
- לפני, דיסקציה תווית צינור רצועות PCR עם מספר מעקב מוקצה ולמלא עם PBT או פתרון אחר המתאים לניתוח נוסף.
- המזרח צד דגים הגחון עד בצלחת פטרי תוך ייצוב הגוף עם מלקחיים מחזיק את הראש בין העיניים הזימים (איור 2).
דגים קטנים יותר (יותר מאשר SL 12mm):
- א) באמצעות מלקחיים חדות, או מחט מיקרו בעריסה סיכה, להסיר את שרירי החזה ועל הסנפירים מהגוף כדי לחשוף את הלב. בתנועה מתמדת של מלקחיים במהלך דיסקציה יכול לגרום זרמים PBT כי המהלך דגים. זה בעייתי במיוחד עבור דגים קטנים יותר, ובכך מחט מיקרו ניתן להשתמש כדי להסיר את שרירי החזה ועל הסנפירים ולפתוח את חלל הגוף.
- א) בעדינות להשתמש במלקחיים כדי לגרוף את הלב מתוך חלל מתחת אטריום. לחלופין, דגים מסוימים ייתכן שתוכל להסיר את הלב על ידי משיכתו בעדינות החוצה בולבוסי ושאר הלב יבואו בעקבותיו. היזהרו במיקום של אטריום אם באמצעות טכניקה זו כפי שהוא יכול להיפגע בקלות. אם יש רקמה נוספת שמגיע עם הלב, זה בסדר, ניתן לפנות לאחר.
- א) אם הדג מכיל סמן לב ניאון כגון Tg (myl7: GFP) twu34, היקף השימוש פלורסנט לנתיחה כדי לוודא הסרה של הלב על ידי בתפרחת (איור 3).
- א) כאשר מסירים את הלב מחלל, להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלב מחט מיקרו להסיר רקמה נוספת שאינה לב רירית epicardial מבחוץ של הלב.
דגים גדולים (יותר מ SL 12mm):
- ב) שימוש באביב טיפל מיקרו מספריים, לעשות שלושה חתכים בעומק של פחות מ 1 מ"מ 1 - חתך רוחבי דרך הזימים 2 - חתך רוחבי על בטן קדמית 3 - לחתוך sagittal בצד הגחון חיבור שני חתכים (איור 4).
- ב) באמצעות מלקחיים חדה להסיר את שרירי החזה ועל הסנפירים מהגוף כדי לפתוח את חלל הגוף וחושפים את רקמת כסוף של קרום הלב (איור 5 א). הסר רקמות קרום הלב והלב יהיה גלוי (איור 5 ב).
- ב) השתמש מיקרו עם מספריים בכדי לחתוך את העורק מחובר arteriosus בולבוסי, הממוקם מעולה ללב. ברגע זה הוא חתך עורק, הניח את קצות מלקחיים תחת אטריום, להשתמש במלקחיים כדי לגרוף את הלב מתוך חלל. אם יש רקמה נוספת שמגיע עם הלב, זה בסדר גמור וניתן להסירו מאוחר יותר.
- ב) לאחר לב יוסר חלל, להשתמש בשני מלקחיים להחזיק את הלב ולהסיר רקמה נוספת, או זוג אחד של מלקחיים להחזיק את הלב מיקרו מחט כדי להסיר תוספת, ללא רקמת לב. רירית epicardial, ניכר על ידי פיגמנט שחור שלה, ניתן להסיר מבחוץ של הלב אם הרצוי על ידי מגרד בעדינות את הרקמה.
3. צילום של לבבות
- הכן 23g / L מזין צלחת פטרי אגר אגר הקרושה ולכסות עם PBS.
- בעזרת מלקחיים, לעשות היטב אגר המאפשר ללב לנוח בכיוון הרצוי עבור הצילום.
- Removהדואר הלב מהצינור PCR ידי החזקת קצה בולבוסי עם מלקחיים בתוקף. מניחים את הלב בצלחת אגר.
- המזרח לב אגר לצלם. המדגם ניתן לסובב אחרי כל תמונה לכל אוריינטציות אפשרי (איור 6).
- השתמש בזמן חשיפה לאור תקורה קצר לצלם את הלבבות. בצע התאמות עבור איכות האור באמצעות חשיפה כנדרש בכדי להשיג את התמונה הטובה ביותר.
4. נציג תוצאות:
דוגמה לב היטב גזור לנקות מוצג אוריינטציות מרובים באיור 6. בלב כל אחד יהיה כמה הבדלים במורפולוגיה הכללית, אבל הלב צריך להיות מלא, המכיל החדר אטריום שלם, arteriosus בולבוסי. כמה דוגמאות של וריאציה זו במורפולוגיה הכולל מוצגים באיור 7. הרקמה כתמים שחורים epicardial יכול להסיר גם מהלב.
באיור 1. מדדו את הדג מהחרטום עד הזנב peduncle באמצעות מ"מ קליפר דיגיטלי.
איור 2. החזיקו את הדג עם מלקחיים בין העיניים הזימים.
איור 3 סמן לב ספציפית מהונדס ניאון כגון Tg (myl7: GFP). Twu34, המוצג כאן, יכול לסייע חזותי לבבות גזור מן הדגים הקטנים.
איור 4 שלושה חתכים כדי להסיר את שרירי החזה והעור: 1 - חתך רוחבי דרך הזימים 2 - חתך רוחבי על בטן קדמית 3 - לחתוך sagittal בצד הגחון חיבור שני חתכים..
. איור 5 אותיות שחור תווית לתאי הלב: arteriosus בולבוסי (BA), החדר (v), ואת אטריום (א).
A-חלל הגוף העליון פתוח להראות את הרקמה כסוף של קרום הלב.
B-לאחר הסרת קרום הלב, הלב גלוי להסיר בקלות.
איור 6. אוריינטציות שונות של הלב מוצגים. אותיות שחור תווית לתאי הלב: arteriosus בולבוסי (BA), החדר (v), ואת אטריום (א). החצים מצביעים גריי המיקום והכיוון של הלב התייחסות למיקום הטבעי בגוף: קדמית (A), האחורי (P), הגב (ד), הגחון (V), שמאלה (L), ומימין (R). בר מציין סולם 400μm.
A-הגחון נוף של הלב
B-הגבי נוף של הלב
C-לרוחב לצפות מהצד השמאלי
D-לרוחב לצפות מהצד הימני
איור 7. מורפולוגיה של לבבות בגדלים שונים מוצג. אותיות שחור תווית לתאי הלב: arteriosus בולבוסי (BA), החדר (v), ואת אטריום (א). בר סולם הצביעו 400 מיקרומטר.
AC-Hearts טופס דגים עם SL פחות 12mm
DF-Hearts טופס דגים עם SL יותר 12mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אלה שיטות לניתוח הלב דג הזברה של דגים שלאחר עובריים מאפשר הסרה מלאה של הלב ניזוק. אמנם שיטה זו היא פשוטה, ומספק מדריכים עבור חתכים חיצוניים שימנעו פגיעה בלב, יד יציבה חיונית דגים קטנים יותר.
צעד מרכזי במהלך דיסקציה היא לזהות את קרום הלב כסוף כמו הלב ישירות בתוך השק הזה. לדמיין את קרום הלב מהווה סמן חשוב למציאת ובסופו של דבר הוצאת טופס בלב חלל הגוף. יתר על כן, חיתוך העורק מעולה arteriosus בולבוסי ימנע את הסרת מכוונת של בולבוסי מיתר בלב. בדגים גדולים יותר זה לפעמים יש צורך להסיר את החלק התחתון של הגוף כדי לשמור על הגוף הראש העליון המכיל את הלב יציב במהלך לנתיחה. ניתן לעשות זאת על ידי המשך הקיצוץ הרוחבי התחתון דרך חלל הגוף ועמוד השדרה במספריים.
Dissection הלב דג הזברה הוא לא רק שימושי עבור מחקרים דומים לניתוח ההתבגרות שלנו, אבל עשוי להיות שימושי במחקר של מדינות מחלה של דג הזברה, בידוד RNA בלב, וכן מחקר אנליטי אחרים ניצול לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
תודה מארי Birne, ארטי Tsiola, Jaymie אסטבס Arelys אוריבה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CUNY Research Foundation ו - הווארד יוז רפואי מכון גרנט תוכנית קיץ לסטודנטים לתואר ראשון (השלוחה) ו-NIH RO3 41702-00-01. המחקר נתמך גם על ידי בקווינס קולג' וחלק הניסויים נעשו על ציוד ממתקן Core for Imaging, ביולוגיה תאית ומולקולרית בקווינס קולג'.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
