Summary
Um método, claro padronizados para dissecção e isolamento do coração zebrafish em vários estágios de desenvolvimento são descritos. Técnicas de anotação e quantificação também são discutidos.
Abstract
Peixe-zebra tornou-se um organismo modelo benéfico e prático para o estudo do desenvolvimento embrionário do coração (ver comentários recentes 1-6), no entanto, o trabalho de examinar pós-embrionário, através do desenvolvimento adulto cardíaca tem sido limitada 7-10. Examinar a morfologia mudança do coração amadurecimento e envelhecimento são restritas pela ausência de técnicas disponíveis para o estadiamento e isolar os corações juvenis e adultos. A fim de analisar o desenvolvimento do coração mais tempo de vida do peixe, dissecamos corações zebrafish em estágios numerosos e fotografá-los para posterior análise 11. As características morfológicas do coração podem ser facilmente quantificadas e corações individuais podem ser posteriormente analisado por uma série de métodos standard. Zebrafish crescer a taxas variáveis e maturação se correlaciona melhor com o tamanho do peixe do que a idade, assim, pós-fixação, nós comprimento dos peixes fotografia e medida como um indicador de maturação dos peixes. Este protocolo explica duas distintas, tamanho técnicas de dissecção dependente de peixe-zebra, que vão desde larvas de comprimento padrão de 3,5 mm (SL) com corações de comprimento ventrículo 100μm (VL), para adultos, com SL de 30mm e 1mm VL ou maior. Larvas de peixes e adultos têm corpo bastante distintos e morfologia do órgão. Larvas não são apenas significativamente menor, eles têm menos pigmentos e cada órgão é visualmente muito difíceis de identificar. Por este motivo, usamos técnicas de dissecção distintas.
Usamos pré-dissecção procedimentos de fixação, como descobrimos que os corações dissecados imediatamente após a eutanásia tem uma morfologia mais variável, com balão muito solto e, como átrios em comparação com os corações retirados fixação seguintes. O peixe fixadas antes dissecção, manter vivo na morfologia e posição de câmara (dados não mostrados). Além disso, para fins de demonstração, aproveitamos do coração (miocárdio) específicos GFP transgênicos Tg (myl7: GFP) twu34 (12), o que nos permite visualizar todo o coração e é particularmente útil nos primeiros estágios de desenvolvimento quando o cardíaco morfologia é menos distinta dos tecidos adjacentes. Dissecção do coração faz uma análise mais aprofundada da biologia celular e molecular subjacentes ao desenvolvimento e maturação do coração utilizando hibridização in situ, imuno-histoquímica, extração de RNA ou outros métodos de análise mais fácil no pós-embrionário zebrafish. Este protocolo irá proporcionar uma técnica valiosa para o estudo da maturação de desenvolvimento cardíacas e envelhecimento.
Protocol
Peixe-zebra foram levantadas utilizando protocolos padrão 13 no Biotério Queens College a 28 ° C. Pares de peixes individuais ou acasalamentos grupo deve ser pré-formados e os embriões resultantes limpos e armazenados em um 28 ° C incubadora. Saúde dos peixes deve ser examinado diariamente. Em cinco dias pós-fertilização (DPF), o peixe deve ser separado em tanques a uma densidade de peixes 10-15 e entraram na creche facilidade de peixe. Para o protocolo aqui apresentados foram coletados em zebrafish larva por estágios adultos: 15, 30, 45, 60, 90, 180 dpf.
1. Peixe-zebra coleção assunto e fixação
- Retire o peixe do tanque de habitat usando net e coloque em 0,2% tricaina para anestesiar.
- Coloque os peixes anestesiados em água gelada por 15 minutos para euthanize.
- Faça paraformaldeído a 4% fresco (PFA) em 1x tampão fosfato (PBS).
- Incubar peixes coletados em PFA 4% por 1-2 horas à temperatura ambiente, em seguida, durante a noite a 4 ° C numa placa de Petri envolto em parafilme. Isso mantém o plano de peixe e depois faz a dissecação muito mais fácil.
- Após a fixação, lavar duas vezes em PBS com Tween (PBT). Peixe pode ser manter em PBT, a 4 ° C por até 10 dias.
2. Medição de peixes e dissecção
- Peixes único lugar em meia petri prato cheio de PBS fresco e colocá-lo em seu lado direito.
- Medida de comprimento de peixes do focinho à base da cauda (o pedúnculo caudal), não incluindo aletas de cauda, utilizando um paquímetro digital de milímetro (Figura 1). Este é o comprimento padrão (SL).
- Cada peixe pode ser atribuído um número / combinação de letras para permitir que um indivíduo eo coração, resultando dissecados para ser rastreados para análise posterior. Dados, incluindo o número de ações dos pais, a idade de fixação, medições SL, foram inseridos em uma planilha e organizado com base nesses rótulos.
- Antes da dissecação, etiqueta tiras tubo de PCR com o número de rastreamento atribuído a preencher com PBT ou outra solução apropriada para análise posterior.
- Orient lado ventral do peixe em placa de petri, enquanto a estabilização do corpo com pinças segurando a cabeça entre os olhos e as guelras (Figura 2).
Peixes menores (menores que 12 milímetros SL):
- a) Utilizando uma pinça afiada, ou uma micro-agulha em um suporte de pino, retire os músculos peitorais e as aletas do corpo para revelar o coração. O movimento constante do fórceps durante a dissecção pode causar correntes no PBT que movem o peixe. Isto é particularmente problemático para peixes menores, portanto, um micro-agulha pode ser usado para remover músculos peitorais e barbatanas e abrir a cavidade do corpo.
- a) delicadamente usar a pinça para colher o coração para fora da cavidade debaixo do átrio. Alternadamente, em alguns peixes que você pode ser capaz de remover o coração puxando para fora bulboso eo resto do coração se seguirão. Tenha cuidado com a localização do átrio, se usar esta técnica, pois ele pode ser facilmente danificada. Se houver tecido extra que vem com o coração, que é fino e pode ser apagada depois.
- a) Se o peixe contém um marcador fluorescente cardíacos, tais como Tg (myl7: GFP) twu34, use âmbito fluorescentes para dissecção e verificar a remoção do coração pelo florescimento (Figura 3).
- a) Uma vez que o coração é removido da cavidade, use a pinça para segurar o coração e uma micro-agulha para remover o tecido não-cardíacas extra e do revestimento do epicárdio de fora do coração.
Peixes maiores (mais de SL 12mm):
- b) Usando Primavera tratado micro-tesoura, faça três incisões de menos de 1mm de profundidade: 1 - corte transversal através do 2 brânquias - corte transversal no ventre anterior 3 - corte sagital no lado ventral conectando dois cortes (Figura 4).
- b) Utilizando uma pinça afiada remove os músculos peitorais e as aletas do corpo para abrir a cavidade do corpo e revelar o tecido prateado do pericárdio (Figura 5A). Remover este tecido de pericárdio eo coração se tornará visível (Figura 5B).
- b) Use a tesoura para cortar micro-artéria ligado ao arteriosus bulbosa, situada superior ao coração. Uma vez que esta artéria é cortada, coloque as pontas fórceps sob o átrio, use a pinça para colher o coração para fora da cavidade. Se houver tecido extra que vem com o coração, que é fino e pode ser removido mais tarde.
- b) Uma vez que o coração é removido da cavidade, use os dois pinça para segurar o coração e remover o tecido extra, ou um par de pinças para segurar o coração e uma micro-agulha para remover extra, o tecido não-cardíacas. O forro do epicárdio, evidente pela sua pigmentação preta, pode ser retirado a partir do exterior do coração, se desejar delicadamente raspando o tecido.
3. Fotografia de corações
- Prepare uma 23g / L de ágar nutriente placa de petri e cubra ágar solidificado com PBS.
- Usando a pinça, faça um buraco no agar que permite que o coração para descansar na orientação desejada para fotografar.
- Remove o coração do tubo de PCR, segurando a ponta do bulbo com a pinça com firmeza. Coloque o coração no prato agar.
- Orientar o coração em agar para fotografar. A amostra pode ser rodado depois de cada imagem para todas as orientações possíveis (Figura 6).
- Use o tempo de exposição de luz sobrecarga e curto para fotografar o coração. Fazer ajustes para a qualidade da luz usando a exposição necessário para obter a melhor fotografia.
4. Resultados representativos:
Um exemplo de um coração bem dissecados limpa é mostrado em orientações múltiplas na Figura 6. Cada coração vai ter algumas diferenças na morfologia geral, mas o coração deve ser completa, contendo um ventrículo intacto, átrio e arteriosus bulbosa. Alguns exemplos desta variação na morfologia geral são mostrados na Figura 7. O preto manchado tecido epicárdico também pode removido do coração.
Figura 1. Meça os peixes do focinho à pedúnculo caudal usando uma câmera digital milímetros paquímetro.
Figura 2. Segure o peixe com uma pinça entre os olhos e guelras.
A Figura 3 cardíaca marcador fluorescente específica transgênicos, como Tg (myl7: GFP). Twu34, mostrado aqui, pode auxiliar na visualização corações dissecados de peixes menores.
Figura 4 Três incisões para remover os músculos peitorais e da pele: 1 - corte transversal através das brânquias 2 - corte transversal no ventre anterior 3 - corte sagital no lado ventral conectando ambas as cortes..
. Figura 5 letras Black Label as câmaras do coração: arteriosus bulbosa (ba), ventrículo (v), e no átrio (a).
A-A cavidade superior do corpo está aberto para mostrar o tecido prateado do pericárdio.
B-Após a remoção do pericárdio, o coração é visível e facilmente removidos.
Figura 6. Orientações diferentes do coração são mostrados. Letras pretas rótulo as câmaras do coração: arteriosus bulbosa (ba), ventrículo (v), e no átrio (a). Setas indicam Cinzento localização e orientação do coração, em referência à sua localização normal no corpo: anterior (A), posterior (P), dorsal (D), ventral (V), esquerda (L) e direito (R). Barra de escala indica 400 micras.
A-ventral vista do coração
B-dorsal vista do coração
C-lateral vista do lado esquerdo
D-lateral vista do lado direito
Figura 7. Morfologia de corações de tamanhos diferentes é mostrada. Letras pretas rótulo as câmaras do coração: arteriosus bulbosa (ba), ventrículo (v), e no átrio (a). Barra de escala indicada 400 m.
AC-Hearts peixes formulário com menos de 12 milímetros SL
DF-Hearts peixes formulário com SL maior que 12 mm
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Discussion
Estes métodos para dissecção do coração do peixe zebra pós-embrionário de peixes permite a remoção completa de um coração danificado. Embora essa técnica é simples e fornece guias para cortes externos que irão evitar danos ao coração, uma mão firme é essencial para peixes menores.
Um passo fundamental durante a dissecção é identificar o pericárdio prateado como o coração está diretamente dentro desse saco. Visualizando o pericárdio fornece um importante marcador para encontrar e, finalmente, retirar a forma do coração da cavidade do corpo. Além disso, o corte da artéria superior ao arteriosus bulbosa vai impedir a remoção inadvertida da bulbosa do resto do coração. Em peixes maiores às vezes é necessário remover a parte inferior do corpo para manter o corpo cabeça e parte superior que contém o coração estável durante a dissecção. Isto pode ser feito, continuando a menor corte transversal através da cavidade do corpo e da coluna com uma tesoura.
Dissecção do coração zebrafish é não só útil para estudos semelhantes à nossa análise própria maturação, mas pode ser útil no estudo de estados de doença do peixe-zebra, o isolamento do RNA no coração, e na investigação analítica utilizando o coração.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Graças à Marie Birne, Tsiola Areti, Estevez Jaymie e Uribe Arelys. Este trabalho foi financiado em parte pela CUNY Research Foundation e Instituto Médico Howard Hughes Grant Programa de Verão para Estudantes de Graduação (SPUR) e RO3 NIH 41702-00-01. A pesquisa foi apoiada também por Queens College e alguns dos experimentos foram feitos em equipamentos a partir do Núcleo Facility for Imaging, Biologia Celular e Molecular no Queens College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
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