Summary
Birden fazla gelişim evreleri zebrafish kalp diseksiyonu ve izolasyon için açık, standart bir yöntem açıklanmıştır. Annotation ve miktar teknikler de tartışılmaktadır.
Abstract
Zebra balığı çalışma (son değerlendirmeleri görmek 1-6) embriyonik kalp gelişimi için yararlı ve pratik bir model organizma haline gelmiştir, ancak 7-10 sınırlı kalmıştır yetişkin kalp geliştirilmesi yoluyla post-embriyonik inceleyerek işe . Olgunlaşan ve yaşlanma kalp değişen morfoloji incelenmesi, genç ve yetişkin kalpleri evreleme ve izole etmek için uygun teknikler eksikliği ile sınırlıdır. Balığın ömrü boyunca kalp gelişimini analiz etmek için, çeşitli aşamalarda zebrafish kalpleri incelemek ve onları daha fazla analiz için 11 fotoğraf. Kalbin morfolojik özellikleri kolayca sayısal ve bireysel kalpleri daha bir dizi standart yöntemler ile analiz edilebilir. Zebra balığı değişken oranlı büyüme ve olgunlaşma, dolayısıyla balık olgunlaşma bir göstergesi olarak post-fiksasyon, fotoğraf ve ölçü balık uzunluğu, yaş daha balık boyutu ile daha fazla ilişkili. Bu protokol ile 30mm ve VL 1mm SL veya daha büyük, yetişkin 100μm ventrikül uzunluğu (VL) kalplerini larva 3.5mm standart uzunluğu (SL) arasında değişen iki ayrı zebrafish için, boyut bağımlı diseksiyon teknikleri, açıklar. Larva ve ergin balıklar oldukça farklı bir vücut ve organ morfolojisi vardır. Larva sadece daha küçük değil, daha az pigment ve her organ görsel olarak tespit etmek çok zordur. Bu nedenle, biz farklı diseksiyon teknikleri kullanır.
Euthanization sonra doğrudan disseke kalpleri kulakçıklar gibi çok gevşek ve balon ile aşağıdaki fiksasyon kaldırıldı kalpleri ile karşılaştırıldığında, daha değişken bir morfoloji olduğunu keşfettiği gibi, pre-diseksiyonu fiksasyon yöntemleri kullanılır. Balık, in vivo morfolojisi ve oda pozisyonlar (veriler gösterilmemiştir) korumak diseksiyon önce sabit . Buna ek olarak, gösteri amaçlı, kalp (miyokard) belirli GFP transgenik Tg (myl7 GFP) yararlanmak için bize tüm kalp görüntülemenizi sağlar ve geliştirme erken aşamalarında özellikle yararlıdır twu34 (12), kalp morfolojisi çevre dokulara daha az belirgindir. Kalp Diseksiyon in situ hibridizasyon, immunohistokimya, RNA ekstraksiyonu veya diğer post-embriyonik zebrafish kolay analitik yöntemler kullanarak kalp gelişme ve olgunlaşma altında yatan hücre ve moleküler biyoloji daha fazla analiz yapar. Bu protokol, kalp gelişim olgunlaşma ve yaşlanma çalışma için değerli bir teknik sağlayacaktır.
Protocol
Zebra balığı 28 Queens College Hayvan Tesis 13 standart protokoller ° C ile yetiştirildik Bireysel balık çift veya grup çiftleşmelerin preformed ve Oluşan embriyolar temizlenmeli ve 28 ° C inkübatör saklanan olmalıdır. Balık sağlık günlük muayene edilmelidir. 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf), 10-15 balık yoğunlukta balık tanklarının içine ayrılmış olmalıdır ve balık tesisi kreş girdi. 15, 30, 45, 60, 90, 180 dpf'e: Burada sunulan protokolü için zebrafish ergin aşamalardan larva toplanmıştır.
1. Zebra balığı konu toplama ve fiksasyon
- Uyutmak için% 0.2 Tricaine net ve yerinde kullanarak balık habitatı tankı çıkarın.
- Euthanize için 15 dakika boyunca buzlu suda anestezi balık yerleştirin.
- 1x taze% 4 paraformaldehid (PFA) Fosfat-tamponlu salin (PBS).
- 4 gece boyunca oda sıcaklığında 1-2 saat süreyle% 4 PFA toplanan balık inkübe ° C parafilm sarılmış bir petri. Bu balık düz tutar ve daha sonra diseksiyon çok daha kolay hale getirir.
- Fiksasyon sonra, Tween (PBT) ile iki kez PBS içinde yıkayın. Balık 10 gün, 4 ° C'de PBT tutmak olabilir.
2. Ölçüm balık ve diseksiyon
- Petri yarısını içine yerleştirin tek balık, taze PBS ile dolu ve sağ tarafta yatıyordu.
- Burnu baz kuyruk (kuyruk sapı) balık Tedbir uzunluğu, kuyruk yüzgeçleri, dijital mm kaliper (Şekil 1) kullanarak da dahil olmak üzere değil. Bu standart uzunluk (SL).
- Her balık bir rakam / harf kombinasyonu, daha sonraki analiz için izlenebilir için tek bir balık ve çıkan disseke kalp izin atanabilir. Ebeveyn stok numarası, fiksasyon yaşı, SL ölçümleri de dahil olmak üzere veriler, bir elektronik tablo içine girildi ve bu etiketlerin göre düzenlenir.
- Diseksiyonu, etiket PCR tüp atanan takip numarası ile şeritler ve PBT veya daha fazla analiz için uygun başka bir çözüm ile doldurmadan önce.
- Orient petri balık ventral yüzü yukarı, gözleri ve solungaçları (Şekil 2) arasında kafa tutan forseps ile vücut stabilize.
Küçük balık (12mm SL daha küçük):
- a) bir iğne tutucu keskin forseps, ya da bir mikro iğne kullanarak, kalbin ortaya vücudun göğüs kasları ve yüzgeçleri çıkarın. Diseksiyon sırasında forseps sürekli hareket balık taşımak PBT akımları neden olabilir. Bu dolayısıyla bir mikro-iğne, göğüs kasları ve yüzgeçleri çıkarın ve vücut boşluğu açmak için kullanılabilir küçük balık, özellikle sorunlu.
- a) yavaşça avlunun altındaki boşluktan kalp oymak için forseps kullanabilir. Alternatif olarak, bazı balık hafifçe soğanlı çekerek ve kalbin geri kalanı takip edecek kalp kaldırmak mümkün olabilir. Kolayca zarar görebilir, bu tekniği kullanarak, atrium yerini dikkatli olun. , Kalp, ince ve sonra silinebilir ile gelir ekstra bir doku vardır.
- balık Tg (myl7 gibi bir floresan kalp işareti içeriyorsa: a) GFP) twu34 diseksiyon için floresan kapsamı ve floresans (Şekil 3) ile kalp kaldırma doğrulamak.
- a) Bir kere kalp boşluğuna kaldırılır, kalbin dışarıdan ekstra kardiyak olmayan doku ve epikardiyal astar kaldırmak için bir kalp ve bir mikro-iğne tutmak için forseps kullanabilir.
Büyük balık (12mm SL daha fazla):
- enine kesilmiş solungaçları üzerinden 2 - 3 ön göbek enine kesme keserek bağlayan ventral tarafta sagital kesme (Şekil 4): 1 b) ele mikro-makas yay kullanarak, 1mm derin daha az üç insizyon olun.
- b) keskin forseps kullanarak vücut boşluğunda açık ve perikard gümüş doku (Şekil 5A) ortaya çıkarmak için vücudun göğüs kasları ve yüzgeçleri kaldırmak. Bu perikardiyal doku çıkarın ve kalp görünür hale gelecektir (Şekil 5B).
- b) kalp üstün bulunan soğanlı arteriozus, bağlı arter kesmek için mikro-makas kullanın. Bu arter kesilir sonra, avlunun altındaki forseps ipuçları koymak, kalp boşluğuna oymak için forseps kullanabilir. , Kalp, ince ve daha sonra silinebilir ile gelir ekstra bir doku vardır.
- b) kalp boşluğuna kaldırıldıktan sonra, iki kalp tutmak için forseps kullanabilir ve kalp tutmak için ekstra doku, ya da forseps bir çift kaldırmak ve bir mikro iğne ekstra, non-kardiyak doku kaldırmak için. Doku hafifçe kazıma tarafından istenirse siyah pigmentasyon belirgin epikardiyal astar, kalp dışına çıkarılmalıdır.
3. Fotoğraf: kupa
- 23g / L besin agar petri hazırlayın ve PBS ile pekiştirdi agar kapağı.
- Forseps kullanarak, kalp, fotoğraf çekimi için istenilen yönde dinlenmesini sağlar agar iyi olun.
- Remove soğanlı ucu forseps ile sıkıca tutarak PCR tüp kalp. Agar çanak kalp yerleştirin.
- Orient fotoğraflamak için agar kalbinde. Örnek olası tüm yönelimleri (Şekil 6) her bir resim sonra döndürülebilir.
- Kalbini çekmek için üstten hafif ve kısa pozlama süresi kullanın. , En iyi fotoğraf elde etmek için gerekli poz kullanarak ışık kalitesi için ayarlamalar yapın.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 6 'da birden fazla yönelimleri, iyi disseke temiz kalp bir örnek gösterilmiştir. Her kalp genel morfolojisi bazı farklılıklar var, ancak kalp sağlam bir ventrikül, atrium ve soğanlı arteriozus içeren, tam olmalıdır. Genel morfolojisi bu varyasyon bazı örnekler Şekil 7 de gösterilmiştir. Siyah benekli epikardiyal kalp dokusu da kaldırılır.
Şekil 1: burnu bir dijital mm kaliper kullanarak kaudal sapı balık ölçün.
Şekil 2, gözleri ve solungaçları arasında forseps ile balık tutun .
Şekil 3 Tg olarak kardiyak spesifik floresan transgenik işaretleyici (myl7 GFP) Burada gösterilen twu34, küçük balık disseke kalpleri görselleştirme yardımcı olabilir.
Şekil 4 pektoral kaslar ve cilt kaldırmak için üç insizyon: 1 - 2 ile solungaçları enine kesilmiş ön göbek enine kesilmiş 3 - hem de keser bağlayan ventral tarafta sagital kesim.
Soğanlı arteriosus (ba), ventrikül (v) ve atrium (a): Şekil 5 Siyah harfler kalp odaları etiket.
A-üst vücut boşluğu perikard gümüşi doku göstermek için açık.
B-sonra perikard kaldırarak, kalp görünür ve kolayca temizlenebilir.
Şekil 6 farklı yönelimleri kalp gösterilmiştir. : Siyah harfler kalp odaları soğanlı arteriosus (ba), ventrikül (v) ve atrium (a) etiket. Anterior (A), (P), sırt, arka (D), ventral (V), sol (L) ve sağ (R): Gri oklar yeri ve yönü, kalbin vücudun normal konuma referans gösterir. Ölçek çubuğu 400μm gösterir.
Kalp A-ventral
B-kalp dorsal
C-lateral sol tarafında
Sağ tarafında D-lateral
Şekil 7 farklı boyutlarda kalplerin Morfoloji gösterilmiştir. : Siyah harfler kalp odaları soğanlı arteriosus (ba), ventrikül (v) ve atrium (a) etiket. Ölçek çubuğu 400 mikron belirtti.
12mm daha az SL AC-Hearts formu balık
12mm daha büyük SL ile DF-Hearts formu balık
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Post-embriyonik balık zebrafish kalp diseksiyonu için bu yöntemleri hasarsız bir kalp tümüyle kaldırılmasını sağlar. Bu teknikte basittir ve dış kesimler için kalbin zarar görmesini önlemek kılavuzları sağlarken, sürekli bir yandan küçük balıklar için önemlidir.
Diseksiyonu sırasında bir önemli adım kalp bu kese içinde doğrudan gümüş perikard belirlemektir. Perikard görselleştirme vücut boşluğunda bulma ve sonuçta kalp formunu kaldırarak önemli bir göstergesi sağlar. Ayrıca, soğanlı arteriozus üstün arter kesme, soğanlı kalbin geri kalanından yanlışlıkla kaldırılmasını önlemek. Büyük balık, diseksiyon sırasında kalp istikrarlı içeren baş ve vücudun üst tutmak için vücudun alt kısmını kaldırmak için bazen gereklidir. Bu alt enine kesim makas ile vücut boşluğunda ve omurga ile devam ederek yapılabilir.
Zebrafish kalp diseksiyonu sadece kendi olgunlaşma analizine benzer çalışmalar için yararlıdır, ama Zebra balığı, RNA izolasyonu, kalp ve diğer analitik araştırma kalp kullanan hastalık durumlarında çalışma yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez ve Arelys Uribe teşekkür ederiz. Bu çalışma CUNY Araştırma Vakfı ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Hibe Lisans Öğrencileri için Yaz Programı (SPUR) ve NIH RO3'ü 41702-00-01 kısmen desteklenmiştir. Araştırma ayrıca, Queens College ve bazı deneyler Görüntüleme, Queens College'da Hücresel ve Moleküler Biyoloji Core Tesisi ekipman yapıldı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMD Millipore | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Micro-scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Micro-needles | Fine Science Tools | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific, Inc. | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
