Summary
Cette vidéo montre la préparation chirurgicale et les procédures nécessaires pour étudier les réponses contractiles du muscle gastrocnémien de rat préparation médial
Abstract
Il existe de nombreux cas où il est souhaitable d'obtenir la réponse contractile du muscle squelettique dans des circonstances physiologiques: circulation normale, intacte muscle entier, à la température corporelle. Cela comprend l'étude des réponses contractiles comme potentialisation, escalier posttetanic et la fatigue. En outre, les conséquences du traitement des maladies, la désuétude, de blessure, de la formation et de drogues peut être d'intérêt. Cette vidéo montre des procédures appropriées pour mettre en place et utiliser cette préparation musculaire précieux.
Pour mettre en place cette préparation, l'animal doit être anesthésié, et le muscle gastrocnémien médial est chirurgicalement isolé, à l'origine intact. Des précautions doivent être prises pour maintenir le sang et les fournitures nerveuses. Une longue section du nerf sciatique est effacée du tissu conjonctif, et rompu proximale. Toutes les branches de la souche distale qui ne innervent le muscle gastrocnémien médial sont coupés. Le moignon du nerf distal est insertionted dans une coiffe bordée de fils en acier inoxydable stimulantes. Le calcanéum est coupé, laissant un petit morceau d'os encore attaché au tendon d'Achille. Sonométriques cristaux et / ou des électrodes pour EMG peut être inséré. Immobilisation par des sondes en métal sur le fémur et du tibia empêche le déplacement de l'origine du muscle. Le tendon d'Achille est fixé au transducteur de force et de la peau desserrée est tiré vers le haut sur les côtés pour former un récipient qui est rempli avec de l'huile de paraffine chauffée. L'huile répartit uniformément la chaleur et minimise la perte de chaleur par évaporation. Une lampe chauffante est dirigé sur le muscle et le muscle et le rat sont autorisés à se réchauffer à 37 ° C. Bien qu'il se réchauffe, la tension maximale et la longueur optimale peut être déterminée. Ce sont d'importantes conditions initiales pour toute expérience sur le muscle entier intact. L'expérience peut inclure la détermination des standards propriétés contractiles, comme la relation force-fréquence, force-longueur relation et la relation force-vitesse. Avec des soins chirurgicaux dans l'isolement, l'immobilisation de l'origine du muscle et de l'alignement de l'unité muscle-tendon avec le capteur de force, et une bonne analyse des données, les mesures de haute qualité peut être obtenue avec cette préparation musculaire.
Protocol
1. Introduction
- Le laboratoire MacIntosh a utilisé la préparation de muscle gastrocnémien médial pendant plusieurs années, et avant cela, la préparation de muscle gastrocnémien ensemble, tel que développé avec le Dr Phil Gardiner 1.
2. Anesthésie
- Adultes Sprague-Dawley (200-300 g) sont généralement utilisés dans notre laboratoire pour l'étude des propriétés contractiles in situ. Le rat peut être contraint dans un dispositif en plexiglas, disponible dans le commerce, ou en couvrant avec une serviette, et la tenue.
- Nous utilisons la kétamine / xylazine, (100 mg · ml -1, chaque) mélangé à 85:15, et administrer 0,1 ml par 100 g de poids chez le rat par voie intramusculaire 2,3. Le pentobarbital sodique (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) ou à l'isoflurane (2-3,5%, par inhalation) peut également être utilisé 4.
- Alors que l'anesthésie prend effet, un poids précis peut être obtenu et la gauche des membres postérieurs rasé. C'est aussi une bonne time pour être sûr toute l'électronique est sous tension et prêt. Cela comprend les ordinateurs, amplificateur de jauge de contrainte, chauffe l'huile et d'autres.
- Vérifiez le retour de la réponse réflexe périodiquement et compléter l'anesthésie si nécessaire (0,05 à 0,1 ml par 100 g).
3. Lancement de la chirurgie
- Nous utilisons une plate-forme sur laquelle plexiglas pour immobiliser le rat pour la chirurgie. Ruban de masquage simple fait le travail. Assurez-vous que l'animal est étirée à partir de patte arrière gauche au membre antérieur droit. Ajouter une goutte de lubrifiant pour les yeux. Nous utilisons l'huile de paraffine. Sinon, les yeux se dessèchent avec anesthésie à la kétamine.
- Une petite lumière chirurgicale est utile. Celui-ci émet suffisamment de chaleur pour aider à garder l'animal au chaud. Alternativement, une couverture chauffante eau peut être utilisée. Assurez-vous que les réflexes cornéens ou d'un orteil-pincement sont absents avant de poursuivre. Technique stérile n'est pas nécessaire, parce que cette procédure est aiguë. L'animal ne peut reprendre de l'anesthésie. Nous euthanasier le rat avec un anesthésiquesurdosage (0,2 ml, intracardiaque) lorsque toutes les procédures sont terminées.
- La première incision à travers la peau du talon à la colonne vertébrale. Nous utilisons des ciseaux, car la profondeur de la coupe peut être contrôlée et les ciseaux sont utilisés pour séparer la peau des tissus sous-jacents. Les rats ont hémostase excellente, tant et aussi longtemps que vous évitez les gros vaisseaux sanguins, de saignements sera limité. Gardez les surfaces exposées recouvertes d'une solution saline isotonique gaze imprégnée, chaque fois que possible.
- Après que la peau est séparée du tissu conjonctif sous-jacent, la couche superficielle du muscle est coupé. Soyez sûr de ne pas aller trop profond, vous ne voulez pas endommager le nerf sciatique ou des vaisseaux sanguins, ou le muscle concerné. Commencez sur le muscle gastrocnémien et couper proximale, le long de la même ligne que l'incision cutanée. Peek-dessous pour localiser et éviter le nerf sciatique. Une fois que vous voyez le nerf, vous pouvez suivre son chemin avec votre incision, mais restent bien au-dessus du nerf. Il ya une couture nette entre muscles. Localiser ce, et couper le long de cette couture vers le genou. Surveiller et éviter les vaisseaux sanguins.
4. Préparer trou dans le fémur pour la broche osseuse
- Couper à travers la couche mince de muscle au cours de la partie caudale du fémur, ce qui expose l'os à nu. L'utilisation d'un outil à main rotatif, forage, ou vice broches, (0,9 mm en acier au carbone fraise), faire un petit trou pilote dans le cortex, et juste dans la moelle. Ne pas percer trop profondément, ou des saignements excessifs en résultera. Ce trou sera utilisé plus tard pour placer une pointe en os à immobiliser le fémur sur la base myographe.
5. Isoler innervation du muscle gastrocnémien médial
- L'étape suivante nécessite un microscope à dissection. Repérez l'endroit où le nerf poplité disparaît derrière le muscle gastrocnémien médial. Écartez doucement les différentes branches et couper tout ce qui ne innervent le muscle gastrocnémien médial. Innervation peut être déterminée par microstimulation. Au thistade de s, aussi assurez-vous que les branches superficielles du nerf sciatique sont coupés.
- Maintenant, effacer le tissu conjonctif loin du nerf sciatique, de sorte qu'il peut être glissé dans le bracelet nerveux (plus tard). Assurez-vous de traiter le nerf doucement. Toute portion du nerf peut conduire à inexcitabilité, et terminez votre expérience prématurément.
6. Isoler le tendon d'Achille et le muscle jumeau
- Dissection, avec l'aide occasionnelle de ciseaux, peuvent être utilisés pour séparer le muscle gastrocnémien d'autres tissus. Le tendon du plantaire peut être sorti de sous le tendon d'Achille, attaché et coupé. Le lien est simplement utilisé pour aider à maintenir le tendon et peut être coupé juste après le tendon est coupé et le plantaire est séparé du muscle gastrocnémien pendant une durée substantielle. Placez une ligature de soie n ° 1 autour du tendon d'Achille, et une cravate dans un noeud carré. Ne tirez pas trop fort, ou le tendon d'être endommagé. Nous utilisons rongeurs d'os à couper le Calcan eus, en laissant un petit morceau d'os encore attaché au tendon d'Achille. Gardez les surfaces de coupe horizontaux pour s'assurer que l'os est coupé, et pas seulement le tendon. Cela garantit que le tendon d'Achille peut être apposée sur le myographe plus tard.
- Le long de la face inférieure du gastrocnémien, soléaire peut être vu. Encore une fois, la dissection mousse peut être utilisé pour séparer le muscle soléaire du muscle gastrocnémien. Nous voulons isoler les gastrocnémien médial, il est donc le seul muscle encore attaché au tendon d'Achille. Couper le tendon soléaire, à proximité de l'extrémité distale. Ensuite, vous pouvez séparer les muscles gastrocnémiens médial et latéral, et couper le tendon latéral, laissant juste le muscle gastrocnémien médial attaché au tendon d'Achille. Tirer le muscle gastrocnémien latéral loin de la médiane, le long de près de 50% de sa longueur. Au-delà de cette longueur, les fibres se croisent et se traduira par des dommages de plus de traction. Assurez-vous que le muscle est exempt de tissu conjonctif.
- Placez une ligature autour de la tige, juste au-dessus du point médian. Cela doit être serré, sans couper dans le tissu. Une seconde boucle avant la vente liée contribue éviter de glisser. Encore une fois utiliser un noeud carré pour le fixer.
- En utilisant une petite scie, couper le bas de la jambe loin. Cette coupe doit être à mi-chemin le long du tibia.
- Insérez une sonde pointue dans la moelle du tibia. Cette sonde sera utilisé pour immobiliser le tibia sur la base myographe.
- Fixez les 2 élastiques de la peau, à l'aide des clips Michel. Ces élastiques et supplémentaires seront utilisés pour maintenir la peau autour du muscle pour former un récipient qui sera rempli avec de l'huile de paraffine chaude.
[FACULTATIF]
8. Insérez cristaux sonométriques (étape optionnelle) 5
- Placez l'animal sur un coussin chauffant à basse température. Une sonde rectale, s'il n'est pas déjà insérée peut être introduite à ce stade. Utilisez une petite goutte d'huile de paraffine pour lubrifier.
- Utilisant microstimulation, identifier les extrémités d'un fascicule dans le muscle. Enfoncer une aiguille de calibre 21 dans le site de l'origine et à l'insertion du muscle.
- Faites glisser un cristal sonométriques dans le trou fait par l'aiguille et joint avec vet-joint de colle chirurgicale. Utilisez une très petite goutte de colle; faire en sorte qu'il soit placé juste au-dessus du cristal. L'application de la colle sur une feuille de papier coupé avec un angle aigu contribue à l'application de la colle avec précision. Nous plaçons un cristal supplémentaire à l'insertion du fascicule qui a été identifié par microstimulation.
[CONTINUER]
9. Montez dans l'appareil (voir figure 1)
- Positionner le rat sur la base myographe, avec la sonde tibial orientée vers le levier. Placer la sonde dans le support, pour immobiliser la jambe.
- Tirez la peau vers le haut sur les côtés, pour former un récipient et le fixer avec des élastiques.
- Définir trépan (pouces 1/16 ème) dans le fémur, en utilisant le pilotetrou qui a été créé lors de la préparation chirurgicale. Assurez-vous que vous soutenez le fémur sur la partie antérieure que vous placez la mèche (dans un étau broches), une rupture du fémur peut entraîner, mettre fin à l'expérience prématurément. Fixez le vice-broches à une barre transversale pour immobiliser le fémur.
- Placer le moignon distal du nerf sciatique par le bracelet nerveux stimulant (cathode vers le muscle) et rentrer de nouveau près de l'origine du muscle. Branchez le stimulateur à ces fils.
- Attacher le tendon d'Achille au levier, qui comporte des capteurs à jauges de contrainte sur celui-ci. Attachez câlins, mais laissez un peu de place pour l'ajustement ultérieur. S'assurer que l'alignement du muscle est perpendiculaire au levier.
- Remplir le récipient formé par la peau avec de l'huile de paraffine chauffée.
- Allumez la lampe de la chaleur et de boucliers de position faites de papier d'aluminium sur la tête de l'animal, et le capteur de force. Boucliers feuilles supplémentaires peuvent être nécessaires pour assurer la température centrale de l'animal ne Exceed 38 ° C. La longueur du muscle peut être ajusté jusqu'à ce que mou de la chaîne est retirée de la connexion entre les gastrocnémien médial et le capteur de force.
10. Régler la tension maximale et la longueur de référence
- Alors que le muscle se réchauffe, mis en place le stimulateur et tester la tension de stimulation. Il est important de s'assurer que la stimulation est fixé à durée d'impulsion très brève. Nous utilisons 50 ms. Tension maximale doit être inférieure à 1 V. À partir de 0,5 V, augmenter la tension jusqu'à ce que l'amplitude contraction n'augmente pas. Tension maximale est la plus faible tension qui active toutes les unités motrices. Nous stimulent généralement au double de la tension maximale, ou 3 V le plus élevé.
- En règle générale, les expériences commencent par le muscle à la longueur qui donne la plus forte contraction contraction. Une contraction est obtenue avec une seule impulsion de stimulation. La longueur du muscle est augmentée d'environ 1 mm pour une autre secousse. Cette opération est répétée aussi longtemps que l'amplitude contractionaugmente. Une fois contraction diminue l'amplitude, la durée sera retourné à celui qui a donné la contraction plus grande amplitude.
- Après ce réglage initial de longueur, nous testons le système avec ce que nous appelons une "contraction tétanique conditionné". Le stimulateur est réglé pour délivrer des impulsions à 200 Hz pendant 500 ms. La livraison de cette stimulation se traduira par une contraction tétanique complètement fondu. La force générée par le muscle va resserrer toutes les connexions, y compris les noeuds sur le muscle. Après un repos convenable pour la dissipation de la potentialisation 4, la longueur de référence du muscle est remis à zéro (voir la partie 9.2). Habituellement, la contraction tétanique conditionné aura permis à certains raccourcissement de la longueur fascicule, le muscle devra être étirée un peu pour revenir à la longueur qui donne la contraction plus forte amplitude contraction.
11. Initier l'expérience
- Une expérience typique comprendra ajustem longueurent et / ou une stimulation avec une variété de modes de stimulation. La collecte des données peut simplement signifier la force ou la force, la longueur, la longueur fascicule et un électromyogramme.
[FACULTATIF]
12. Force-fréquence relation 2
- Réglez la durée du train assez long pour atteindre un plateau de force à n'importe quelle fréquence d'intérêt. La force maximale isométrique est atteint dans le muscle gastrocnémien médial à 200 Hz. Durée du train doit être d'au moins 200 ms; est plus préférable pour les basses fréquences, mais se traduira par une certaine fatigue si quelques contractions sont utilisés pour déterminer la gamme complète de la relation force-fréquence. Nous utilisons généralement des contractions à 0, 20, 40, 60, 80, 100 et 200 Hz. Cette gamme de fréquences va permettre à l'ensemble de la relation force-fréquence à décrire. Un appui approprié entre les contractions doivent être permis d'éviter la fatigue (1-10 min).
13. Force-longueur RELATIONSIP 6
- Avec la longueur optimale estimée précédemment établi, une relation force-longueur peut être déterminée par réglage de la longueur systématiquement du muscle de -4 à 4 mm mm en utilisant un appareil de servo-moteur. Cela devrait être fait en utilisant une stimulation maximale (200 Hz), mais nous avons constaté que les contractions très brèves donnera la même longueur réelle optimal 7. Contractions sous-maximales, comme des secousses, peuvent être utilisés, mais cela donnera une longueur différente-dépendance entre la force 8.
- Un aspect important de la détermination de la relation force-longueur est la nécessité d'estimer la force passive à la longueur fascicule au cours de laquelle se produit la force mesurée. Force active est calculée comme la différence entre la force totale et la force appropriée passive. Étant donné que les structures élastiques parallèles supporter la force passive et ceux-ci sont en série avec les structures élastiques de la série, la contribution de la force de la force totale passif doit diminuer à mesure que la série elastructures STIC sont étirés au cours d'une contraction de 3. Une fois que la force passive est connue pour toutes les longueurs musculaires concernés, la force appropriée passif peut être estimée avec la mesure en continu de la longueur à l'aide fascicule sonomicrométrie, ou en estimant la conformité du système de mesure et les structures dans la série de l'unité muscle-tendon. Si cela n'est pas fait, la longueur optimale des forces de préparation et de pointe, sont sous-estimés.
14. Relation force-vitesse 9
- Si vous souhaitez déterminer la relation force-vitesse, vous aurez besoin d'attacher les capteurs de force à un système qui permet de contrôler soit la charge ou la vitesse de changement de longueur. La méthode la plus simple et la plus rentable est d'utiliser la pression d'air pour limiter le raccourcissement à une charge contrôlée. Dans notre système, le muscle est fixé au levier d'un côté du point d'appui et la pression de l'air empêche le changement de longueur de l'autre côté. Un capteur de longueur needs être employé afin que vous soyez en mesure de détecter le changement de longueur du muscle pendant les contractions isotoniques. Cette disposition permet de contractions afterloaded avec résistance pneumatique. Deux réservoirs peut permettre une contraction isométrique avec une libération à une charge isotonique. Un total de contractions 15-20 devrait être obtenue, avec des charges allant de presque vide à la force isométrique maximale. Lors du montage des données à une équation, des charges supérieures à 90% des isométrique ne doit pas être utilisé 9.
15. Les résultats représentatifs:
Contractions exemples sont présentés dans la figure 2. Ces contractions ont été obtenus pour illustrer la relation force-fréquence. Calcul de la force maximale active de ces contractions, et de tracer la force active de la fréquence, les rendements Figure 3, la relation force-fréquence. Les données présentées dans la figure 2 peut être monté à l'équation: FA = c / (1 + e ((AF) / b) + d); AF est la force active, F est la fréquence et un, b, c et d sont des constantes.
Pour le muscle gastrocnémien médial rat, la fréquence moitié du maximum de stimulation est typiquement 50-60 Hz en non-fatigue musculaire 2. Les résultats seront épouser la ligne décrite par l'équation ci-dessus.
Figure 1 Appareils et musculaire set-up:. Pneumatique set-up est affiché sur la gauche, isométrique sur la droite. Le système de levier indiqué sur la gauche est attachée à la table de traduction lorsque les contractions dynamiques sont souhaitées (adapté de 13). Le moteur pas à pas est commandé par un ordinateur (d'après 14).
. Figure 2 superposés contractions isométriques: 20, 40, 60, 80 Hz, 100 et 200. L'amplitude de la contraction de 200 Hz est 8.13 N.
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. Figure 3 Force fréquence relation: la force active des contractions de la figure 2 sont tracées et la ligne représente la ligne de meilleur ajustement.
Discussion
Résultats de bonne qualité contractiles peuvent être obtenues avec soin dans la préparation chirurgicale, bonne fixation dans l'appareil et de l'électronique de bonne qualité. Quand un élève est d'apprendre ce type de chirurgie, quelques boutures communs incluent: étirement du nerf sciatique, ce qui perturbe le flux sanguin et le saignement excessif. Le nerf doit être manipulé avec soin pour éviter tout dommage. Vous saurez que vous avez endommagé le nerf si la force maximale tétanique à la longueur optimale est sensiblement inférieure à celle indiquée dans la figure 3, ou si la tension de stimulation nécessaire pour activer toutes les unités au maximum du moteur est supérieure à 5 volts. Il est relativement facile d'éviter les vaisseaux sanguins qui servent de ce muscle pendant la chirurgie. Perturbation de ces navires peuvent se produire lorsque l'outil de forage est placé dans la surface caudale du fémur. Si le trou n'est pas sur la surface plate du fémur, le forage peut glisser. Lorsque cela se produit, il ya une possibilité que les vaisseaux poplités se perturbé. Sile sang s'accumule dans le muscle après mise en place, c'est un signe que vous avez perturbé ces navires. Saignement excessif peut également se produire si une grosse veine est coupée et non liées. Grosses veines à surveiller sont celles autour de la cheville.
Le muscle en préparation in situ est une approche intéressante pour l'étude des propriétés musculaires contractiles. Unités motrices individuelles peuvent être activées 10, mais en général, toutes les unités motrices sont activées de façon synchrone. Ceci est un inconvénient par rapport à l'activation asynchrone normal qui se produit par le recrutement d'unité motrice volontaire, constitue une limitation. Cependant, du côté positif, l'activation synchrone permet la quantification d'une réponse moyenne de toutes les unités motrices.
Il existe deux approches qui ont été utilisées pour éviter l'activation synchrone. La première consiste à utiliser un brassard électrode avec plusieurs paires de fils stimulantes. Ce qui permet l'activation d'une partie des unités motrices à chaque paire,et la stimulation peut tourner par l'intermédiaire des paires de réaliser l'activation asynchrone. Cette méthode d'activation peut être combiné avec le bloc anodique 11 pour tenter d'activer les unités motrices dans la séquence appropriée en fonction de la taille 12 principe. Dans cette approche, tous les blocs moteurs sont activés avec une paire d'électrodes proximale, et un bloc de stimulation est imposée avec un courant continu. L'amplitude de stimulation pour le bloc peut être modulée pour inhiber unités motrices pour l'activation qui n'est pas souhaité. Apparemment, le bloc affecte axones grands à la tension la plus basse, et affecte plus en plus petites unités.
Le rat dans la préparation du muscle gastrocnémien situ est une approche précieuse physiologique à l'étude de la contraction des muscles squelettiques et les propriétés biochimiques de la santé et dans la maladie.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
La recherche soutenue par la science naturelles et en génie du Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clippers | Good quality pet clippers | ||
| Surgical lamp | Dyna-Lume | Any of several will do | |
| Myograph | Custom built | ||
| Stimulator | Grass Technologies | S-88 | Any of several will do |
| Strain gauge amplifier | CWE, Inc. | PM-1000 | |
| Telethermometer | YSI | YSI-400 | |
| Robotic platform | Arrick Robotics | MD-2 | |
| Sonometric amplifier | Sonometrics | Sonolab | |
| Computer and data collection | PC with NI board | Custom software (labview) | |
| Block heater | Labline Instruments | Multi-block | |
| Nerve cuff | Custom made | ||
| Microstimulator | Custom made |
References
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