Summary
Este vídeo demonstra a preparação cirúrgica e os procedimentos necessários para estudar as respostas contráteis da preparação músculo gastrocnêmio medial de ratos
Abstract
Há muitas circunstâncias em que é desejável para se obter a resposta contráctil do músculo esquelético, em circunstâncias fisiológicas: a circulação normal, todo músculo intacto, à temperatura do corpo. Isso inclui o estudo das respostas contráteis como posttetanic potenciação escada, e fadiga. Além disso, as conseqüências do tratamento da doença, desuso, lesão de treinamento e de drogas pode ser de interesse. Este vídeo demonstra procedimentos adequados para configurar e usar esta preparação muscular valioso.
Para configurar essa preparação, o animal deve ser anestesiado, e do músculo gastrocnêmio medial é cirurgicamente isolada, com a origem intacta. Cuidados devem ser tomados para manter o sangue e suprimentos nervosas. A secção comprida do nervo ciático é limpa de tecido conectivo, e cortou proximalmente. Todos os ramos do coto distal que não inervam o músculo gastrocnêmio medial são cortadas. O coto distal do nervo é inserted a uma braçadeira revestida com fios de aço inoxidável de estimulação. O calcâneo é cortada, deixando um pequeno pedaço de osso ainda ligado ao tendão de Aquiles. Sonometric cristais e / ou eléctrodos de electromiografia pode ser inserido. Imobilização por sondas de metal no fêmur e tíbia impede o movimento da origem muscular. O tendão de Aquiles é ligado ao transdutor de força e a pele solta é puxado para cima nos lados para formar um recipiente que é preenchido com óleo de parafina aquecida. O óleo distribui o calor uniformemente e minimiza a perda de calor por evaporação. A lâmpada de calor é dirigido para o músculo, e o músculo e de rato são deixada a aquecer até 37 ° C. Durante o aquecimento, a tensão máxima e comprimento óptimo pode ser determinado. Estes são importantes condições iniciais para qualquer experiência no músculo todo intacto. O experimento pode incluir a determinação do padrão de contração, como a relação força-freqüência, força-comprimento relacionamento, e força-velocidade relacionamento. Com cuidado no isolamento cirúrgico, a imobilização da origem do músculo e do alinhamento da unidade musculotendínea com o transdutor de força, e a análise de dados adequado, as medições de elevada qualidade podem ser obtidas com esta preparação de músculo.
Protocol
1. Introdução
- O laboratório MacIntosh vem utilizando a preparação do músculo gastrocnêmio medial durante vários anos, e antes disso, a preparação do músculo gastrocnêmio inteiro, desenvolvido com o Dr. Phil Gardiner. 1
2. Anestesia
- Adult Sprague-Dawley (200-300 g) são tipicamente usados no nosso laboratório para o estudo das propriedades contrácteis in situ. A ratazana pode ser restringida em um dispositivo de plexiglass, disponível comercialmente, ou por revestimento com uma toalha, e segurando.
- Usamos cetamina / xilazina, (100 mg · ml -1, cada) misturado em 85:15, e administrar 0,1 ml por 100 g de peso de ratos por via intramuscular 2,3. Pentobarbital de sódio (50-60 mg kg -1, intraperiteneal) ou isoflurano (2-3,5%, inalada) também podem ser utilizados 4.
- Embora o anestésico é com efeito, um peso preciso pode ser obtido e a esquerda do membro posterior-raspada. Esta é também uma boa time para ter certeza de todos os aparelhos eletrônicos estão ligados e prontos. Isso inclui computadores, amplificador calibre de tensão, aquecedor de óleo e outros.
- Verificar se há retorno de resposta reflexa periodicamente e completar a anestesia, conforme necessário (0,05 a 0,1 ml por 100 g).
3. Iniciando Cirurgia
- Nós usamos uma plataforma sobre a qual plexiglass para imobilizar o rato para a cirurgia. Fita adesiva simples faz o trabalho. Certifique-se de que o animal é esticado de pata traseira esquerda para membro anterior direito. Adicionar uma gota de lubrificante para os olhos. Nós usamos óleo de parafina. Caso contrário, os olhos vão secar com anestesia cetamina.
- Uma pequena luz cirúrgico é útil. Este emite calor suficiente para ajudar a manter o animal aquecido. Alternativamente, uma manta de aquecimento de água pode ser usada. Certifique-se de reflexos da córnea ou do pé pinch-estão ausentes antes de prosseguir. Técnica estéril não é necessário, pois este procedimento é agudo. O animal não vai se recuperar da anestesia. Nós eutanásia do rato com anestésicooverdose (0,2 ml, intracardíaca), quando todos os procedimentos.
- A primeira incisão através da pele é a partir do calcanhar à coluna vertebral. Nós usamos uma tesoura, porque a profundidade do corte pode ser controlada e as tesouras são usadas para separar a pele dos tecidos subjacentes. Os ratos têm hemostase excelente, por isso, enquanto você evitar grandes vasos sanguíneos, hemorragia será limitado. Manter as superfícies expostas cobertos com gaze embebida com solução salina isotônica, sempre que possível.
- Depois da pele é separada do tecido conectivo subjacente, a camada de músculo superficial é cortada. Tenha cuidado para não ir muito fundo, você não quer prejudicar o nervo ciático ou vasos sanguíneos, ou o músculo de interesse. Comece sobre o músculo gastrocnêmio e cortar proximalmente, ao longo da mesma linha que a incisão na pele. Debaixo do auge para localizar e evitar o nervo ciático. Depois de ver o nervo, você pode seguir seu caminho com sua incisão, mas ficar bem acima do nervo. Existe uma costura clara entre musculos. Localizar este e cortado ao longo de costuras que para o joelho. Prestar atenção e evitar vasos sanguíneos.
4. Prepare buraco piloto em fêmur de pino ósseo
- Corte através da fina camada de músculo sobre o aspecto caudal do fêmur, expondo o osso. Usando uma ferramenta de mão giratório, broca, ou vice-pin, (0,9 mm broca de aço carbono), faça um furo pequeno piloto através do córtex, e apenas para a medula. Não faça muito profundamente, ou sangramento excessivo irá resultar. Este buraco vai ser usado mais tarde para colocar um pino ósseo para imobilizar o fêmur na base myograph.
5. Isolar inervação do músculo gastrocnêmio medial
- O passo seguinte necessita de um microscópio de dissecação. Localizar o local onde o nervo poplíteo desaparece atrás do músculo gastrocnêmio medial. Delicadamente espalhar vários ramos, e cortar tudo o que não inervam o músculo gastrocnêmio medial. Inervação pode ser determinada por microestimulação. No thifase s, também certificar-se os ramos superficiais do nervo ciático são cortadas.
- Agora limpar o tecido conjuntivo de distância a partir do nervo ciático, de modo que pode ser deslizado para o manguito nervo (mais tarde). Certifique-se de tratar o nervo suavemente. Qualquer trecho do nervo pode levar a inexcitability, e terminar o seu estudo prematuramente.
6. Isolar o tendão de Aquiles e músculo gastrocnêmio
- Dissecção romba, com a ajuda ocasional de tesoura, pode ser usado para separar o músculo do gastrocnémio de outros tecidos. O tendão do plantar pode ser puxado para fora sob o tendão de Aquiles, amarrado e cortado. O laço é meramente usada para ajudar a segurar o tendão e podem ser cortados logo após o tendão é cortado eo plantaris é separada do músculo do gastrocnémio de um comprimento substancial. Coloque uma ligadura de seda n º 1 ao redor do tendão de Aquiles, e gravata em um nó quadrado. Não puxe com muita força, ou o tendão será danificado. Usamos fórceps para cortar o osso calcan eus, deixando um pequeno pedaço de osso ainda ligado ao tendão de Aquiles. Manter as superfícies de corte horizontal para garantir que o osso é cortado, e não apenas o tendão. Isso garante que o tendão de Aquiles, pode ser afixada à myograph mais tarde.
- Ao longo do lado de baixo do gastrocnémio, o sóleo pode ser visto. Novamente, dissecção romba pode ser usado para separar o músculo soleus do músculo gastrocnémio. Queremos isolar os gastrocnêmio medial, por isso é o único músculo ainda está ligado ao tendão de Aquiles. Cortar o tendão sóleo, perto da extremidade distal. Depois, você pode separar os músculos gastrocnêmios medial e lateral, e cortou o tendão lateral, deixando apenas o músculo gastrocnêmio medial ligado ao tendão de Aquiles. Puxar o músculo gastrocnêmio lateral longe do medial, ao longo de cerca de 50% do seu comprimento. Para além deste comprimento, que as fibras se cruzam e danos resultarão ainda puxar. Verifique se o músculo está livre de tecido conjuntivo.
- Colocar uma ligadura em torno da haste, imediatamente acima do ponto médio. Isto precisa de ser apertado, sem cortar o tecido. A segunda volta antes de amarrar ajuda a evitar escorregar. Mais uma vez usar um nó quadrado para fixar.
- Usando uma serra de pequena, cortar a perna de distância. Este corte deve ser no meio do caminho ao longo da tíbia.
- Introduza uma sonda afiada na medula da tíbia. Esta sonda será utilizada para imobilizar a tibia na base myograph.
- Anexar dois elásticos para a pele, usando grampos Michel. Estes elásticos e adicional será usada para manter a pele em torno do músculo de modo a formar um recipiente que vai ser preenchido com óleo de parafina aquecida.
[OPCIONAL]
8. Insira cristais sonometric (etapa opcional) 5
- Coloque o animal em uma almofada de aquecimento em baixa definição. Uma sonda rectal, se já não estiver inserido pode ser inserida neste momento. Use uma pequena gota de óleo de parafina para lubrificar.
- Usando microestimulação, identificar as extremidades de um fascículo dentro do músculo. Picar uma agulha de calibre 21 para dentro do local da a origem e inserção do músculo.
- Deslize um cristal sonometric no furo feito pela agulha, e de vedação com uma ligação vet-cola cirúrgica. Use uma queda muito pequena de cola, certificando-se de que ele é colocado para a direita sobre o cristal. Aplicando a cola para um pedaço de papel cortado com um ângulo agudo ajuda a aplicar a cola com precisão. Estamos colocando um cristal adicional na inserção do fascículo que foi identificado por microestimulação.
[CONTINUA]
9. Montar no aparelho (ver figura 1)
- Posicione o rato sobre a base de myograph, com a sonda tibial orientada para a alavanca. Coloque a sonda no suporte, para imobilizar a perna.
- Puxe a pele para cima nos lados, para formar um recipiente e fixar com elásticos.
- Definir broca (polegada de 1/16 ª) no fêmur, com o pilotoburaco que foi criado durante a preparação cirúrgica. Certifique-se de apoiar o fêmur na porção anterior como você colocar a broca (em um vice-pin), como a quebra do fêmur pode resultar, encerra o estudo prematuramente. Apor vice-o pino a uma barra transversal para imobilizar o fêmur.
- Coloque o coto distal do nervo isquiático através do manguito nervo estimulante (cátodo para o músculo) e dobra para trás próximo da origem do músculo. Ligue o estimulador para esses fios.
- Fixe o tendão de Aquiles para a alavanca, que tem sensores strain gauge nele. Amarre snuggly, mas deixar algum espaço para o ajuste mais tarde. Certifique-se o alinhamento do músculo é perpendicular com a alavanca.
- Encher o recipiente formado pela pele com óleo de parafina aquecida.
- Ligue a lâmpada de calor e escudos de posição feitas de papel alumínio sobre a cabeça do animal, eo transdutor de força. Escudos folha adicional pode ser necessário para assegurar que a temperatura do núcleo do animal não exceed 38 ° C. O comprimento do músculo pode ser ajustada até que a folga da corda é removido a partir da conexão entre as gastrocnêmio medial e do transdutor de força.
10. Definir tensão máxima e comprimento de referência
- Enquanto o músculo está aquecendo, configurar o estimulador e testar a tensão de estimulação. É importante ter certeza que a estimulação é de duração de pulso muito breve. Nós usamos 50 us. Voltagem máxima deve ser inferior a 1 V. A partir de 0,5 V, a tensão aumenta até a amplitude twitch não aumenta. Tensão máxima é a mais baixa tensão que ativa todas as unidades motoras. Nós normalmente estimular o dobro da tensão máxima, ou 3 V for maior.
- Normalmente, as experiências começará com o músculo no comprimento que dá a contração maior contração. Um tique é obtido com um único pulso de estimulação. O comprimento do músculo é aumentada em cerca de 1 mm para a outra contração. Isto é repetido enquanto amplitude twitchestá a aumentar. Uma vez que se contorcer diminui de amplitude, o comprimento será devolvido para o que deu o twitch maior amplitude.
- Após essa configuração inicial de extensão, nós testar o sistema com o que chamam de uma "contração tetânica condicionado". O estimulador é definido para fornecer pulsos de 200 Hz para 500 ms. Entrega de esta estimulação resultará numa contração tetânica completamente fundidas. A força gerada pelo músculo vai apertar todas as ligações, incluindo os nós no músculo. Depois de um descanso adequado para a dissipação de potenciação 4, o comprimento de referência do músculo é reiniciado (ver parte 9.2). Normalmente, a contração tetânica condicionado irá ter permitido algum encurtamento comprimento fascículo, de modo que o músculo terá de ser esticado um pouco para voltar para o comprimento que dá a maior contracção twitch amplitude.
11. Iniciar o experimento
- A experiência típica incluirá adjustm comprimentoent e / ou estimulação de uma variedade de padrões de estimulação. A coleta de dados pode envolver apenas uma força, ou força, com comprimento de comprimento, fascículo e eletromiograma.
[OPCIONAL]
12. Força-frequência relação 2
- Definir a duração do trem longo o suficiente para atingir um patamar de força em qualquer freqüência de interesse. A força isométrica máxima é atingida no músculo gastrocnêmio medial a 200 Hz. Duração comboio deve ser pelo menos de 200 ms, já é melhor para as frequências mais baixas, mas irá resultar em alguma fadiga se contrações vários são utilizados para determinar a gama da relação força-frequência. Nós normalmente usam contrações a 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 200 Hz. Esta gama de frequências irá permitir que a gama de frequência de a relação força-de ser descritos. Um descanso adequado entre as contrações devem ser autorizados a evitar a fadiga (1-10 min).
13. Força-comprimento relationship 6
- Com o comprimento estimado óptimo estabelecido anteriormente, uma relação força-comprimento pode ser determinada de forma sistemática ajustar o comprimento do músculo de mm -4 a +4 mm usando um aparelho de servo-motor. Isto deve ser feito utilizando a estimulação máxima (200 Hz), mas verificou-se que as contracções muito breves irá produzir o mesmo comprimento real óptima 7. Contracções submáximas, como espasmos, podem ser utilizados, mas isso irá originar um diferente comprimento de dependência de força 8.
- Um aspecto importante da determinação da relação força-comprimento é a necessidade de calcular a força passiva no comprimento fascículo em que a força medida ocorre. Força activa é calculada como a diferença entre a força total e a força adequada passiva. Uma vez que as estruturas elásticas paralelas suportar a força passiva e estes são, em conjunto com as estruturas elásticas da série, a contribuição força passiva a força total deve diminuir à medida que a série de ELAstic estruturas são esticadas durante uma contracção 3. Uma vez que a força passiva é conhecida por todos os comprimentos musculares relevantes, a força apropriada passivo pode ser estimado com medição contínua de comprimento fascículo usando sonomicrometry, ou estimando a conformidade do sistema de medição e as estruturas em série da unidade músculo-tendão. Se isto não for feito, o tamanho ideal das forças de preparação e de pico, são subestimadas.
14. Força-velocidade relacionamento 9
- Se você gostaria de determinar a relação força-velocidade, você precisará anexar os transdutores de força a um sistema, que permite o controle de qualquer carga ou taxa de mudança comprimento. O método mais fácil e mais rentável é utilizar a pressão do ar para restringir a um encurtamento de carga controlada. No nosso sistema, o músculo está ligado à alavanca de um lado do fulcro e a alteração de pressão de ar impede o comprimento do outro lado. Um sensor de comprimento needs a ser empregada de modo que você é capaz de detectar a mudança no comprimento do músculo durante as contrações isotônicas. Este arranjo permite que as contracções afterloaded com resistência pneumática. Tanques duplos podem permitir contração isométrica com a liberação de uma carga de isotônico. Um total de 15-20 contracções devem ser obtidas, com as cargas que vão de cerca de descarregado a força isométrica máxima. Quando do ajuste dos dados a uma equação, cargas acima de 90% do isométrica não deve ser utilizado 9.
15. Resultados representativos:
Contracções de exemplo são apresentados na Figura 2. Estas contrações foram obtidas para ilustrar a relação força-freqüência. Cálculo do pico de força ativa destas contrações, e planejar a força ativa contra a frequência, os rendimentos Figura 3, a relação força-freqüência. Os dados apresentados na Figura 2 podem ser ajustadas à equação: AF = c / (1 + e-((AF) / b) + d); AF é a força activa, F é a frequência e a, b, c e d são constantes.
Para o músculo gastrocnêmio medial de ratos, a freqüência média-máxima de estimulação é tipicamente 50-60 Hz em não-fatigados músculo 2. Os resultados irão encaixar estreitamente à linha descrita pela equação acima.
Figura 1 Aparelho e músculo configuração:. Pneumatic configuração é mostrada à esquerda, à direita isométrica. O sistema de alavanca mostrado à esquerda está ligado à tabela de tradução quando contrações dinâmicas são desejados (adaptado a partir de 13). O motor de passo é controlado por um computador (adaptado a partir de 14).
. Figura 2 sobrepostos contrações isométricas: 20, 40, 60, 80 Hz, 100 e 200. A amplitude da contracção Hz 200 é 8,13 N.
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. Figura 3 relação Força-freqüência: a força ativa de contrações na figura 2 são traçados ea linha representa a linha de melhor ajuste.
Discussion
Resultados de boa qualidade contráteis podem ser obtidas com cuidado na preparação cirúrgica, montagem segura no aparelho e eletrônicos de boa qualidade. Quando um aluno está aprendendo esta cirurgia, alguns deslizes comuns incluem: estiramento do nervo ciático, interrompendo o fluxo de sangue, e sangramento excessivo. O nervo deve ser manuseado com cuidado para evitar danos. Poderá verificar que danificaram o nervo, se a força tetânica máxima no comprimento óptimo é substancialmente menor do que o mostrado na Figura 3, ou se a tensão de estimulação necessários para activar ao máximo todas as unidades motoras é maior do que 5 volts. É relativamente fácil para evitar que os vasos sanguíneos servindo este músculo durante a cirurgia. Interrupção desses vasos pode ocorrer quando a broca está a ser colocada na superfície do caudal do fémur. Se o orifício piloto não está sobre a superfície plana do fémur, a broca pode deslizar. Quando isto acontece, há uma possibilidade de que os vasos poplíteos são interrompidos. Sepiscinas de sangue ao redor do músculo após o set-up, é um sinal de que você tenha interrompido esses vasos. Sangramento excessivo também pode ocorrer se uma grande veia é cortada e não vinculado. Grandes veias que atente para são aqueles ao redor do tornozelo.
A preparação de músculo situ é uma abordagem útil para o estudo das propriedades contrácteis do músculo. Unidades motoras individuais podem ser ativados 10, mas geralmente todas as unidades motoras são ativadas de forma síncrona. Esta é uma desvantagem em relação à activação assíncrono normal que ocorre através do recrutamento voluntário da unidade motora, por isso representa uma limitação. No entanto, no lado positivo, a activação síncrona permite a quantificação da resposta média de todas as unidades motoras.
Existem duas abordagens que têm sido usados para evitar a activação síncrona. Uma é a utilização de um eléctrodo de manguito com vários pares de fios de estimulantes. Isto permite a activação de uma parte das unidades motoras com cada par,e estimulação pode girar através dos pares para conseguir a ativação assíncrona. Este método de activação pode ser combinado com o bloco anódico 11 para tentar activar unidades motoras na sequência apropriada de acordo com o princípio do tamanho 12. Nesta abordagem, todas as unidades motoras são activados com um par de eléctrodos proximal, e um bloco é imposta com a estimulação de corrente directa. A amplitude do estímulo para o bloco pode ser modulada de modo a inibir as unidades motoras para o qual a activação não é desejada. Aparentemente, o bloco afeta grandes axônios ao menor tensão, e afeta progressivamente unidades menores.
A preparação in situ do músculo gastrocnémio de ratos é uma ferramenta valiosa para o estudo fisiológico de contração do músculo esquelético e propriedades bioquímicas na saúde e na doença.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisa apoiada pelo Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clippers | Good quality pet clippers | ||
| Surgical lamp | Dyna-Lume | Any of several will do | |
| Myograph | Custom built | ||
| Stimulator | Grass Technologies | S-88 | Any of several will do |
| Strain gauge amplifier | CWE, Inc. | PM-1000 | |
| Telethermometer | YSI | YSI-400 | |
| Robotic platform | Arrick Robotics | MD-2 | |
| Sonometric amplifier | Sonometrics | Sonolab | |
| Computer and data collection | PC with NI board | Custom software (labview) | |
| Block heater | Labline Instruments | Multi-block | |
| Nerve cuff | Custom made | ||
| Microstimulator | Custom made |
References
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