Summary
Denna video visar kirurgiska förberedelser och förfaranden som behövs för att studera de kontraktila svar råttans medial gastrocnemius förberedelse
Abstract
Det finns många omständigheter då det är önskvärt att erhålla det kontraktila svaret av skelettmuskel under fysiologiska förhållanden: normal cirkulation, intakt hel muskel, vid kroppstemperatur. Detta inkluderar studier av kontraktila svar som posttetanic potentiering, trappa och trötthet. Dessutom kan konsekvenserna av sjukdom, glömska, skada, utbildning och läkemedelsbehandling vara av intresse. Denna video demonstrerar lämpliga förfaranden för att inrätta och använda denna värdefulla muskel preparat.
För att ställa in detta preparat, måste djuret vara sövd, och den mediala gastrocnemiusmuskeln är kirurgiskt isolerad, med ursprung intakt. Försiktighet måste vidtas för att upprätthålla blod och förnödenheter nerv. En lång sektion av ischiasnerven rensas från bindväv, och kapas proximalt. Alla grenar av den distala stumpen som inte innerverar den mediala gastrocnemiusmuskeln är avskurna. Den distala nerv stumpen är INSERTed till en manschett fodrad med rostfritt stål stimulerande ledningar. Calcaneus avskiljs, lämnar en liten bit av ben fortfarande fäst till hälsenan. Sonometric kristaller och / eller elektroder för elektromyografi kan införas. Immobilisering av metall sonder i lårben och skenben förhindrar rörelse muskeln ursprung. Hälsenan är fäst vid kraftgivare och det lossade huden dras upp vid sidorna för att bilda en behållare som är fylld med uppvärmt paraffinolja. Oljan sprider värmen jämnt och minimerar avdunstning värmeförlusten. En värmelampa riktas på muskeln, och muskeln och råtta fick värmas upp till 37 ° C. Medan den värms, kan maximal spänning och optimal längd bestämmas. Detta är viktiga initiala förhållanden för alla experiment på intakt hela muskeln. Experimentet kan omfatta bestämning av vanliga kontraktila egenskaper, såsom kraft-frekvensen relation, kraft-längd förhållande, och kraft-hastighet relation. Med vård i kirurgisk isolering,, fixering av ursprung muskler och inriktningen av muskel-sena enhet med kraftgivare, och rätt dataanalys kan högkvalitativa mätningar erhållas med denna muskel preparat.
Protocol
1. Inledning
- Macintosh lab har använt den mediala gastrocnemiusmuskeln förberedelse för flera år och dessförinnan, hela gastrocnemius förberedelse som utvecklats med Dr Phil Gardiner. 1
2. Anestesi
- Vuxna Sprague-Dawley-råttor (200-300 g) används typiskt i vårt labb för studium av kontraktila egenskaper in situ. Råttan kan begränsas i en plexiglas-enhet, kommersiellt tillgänglig, eller genom att täcka med en handduk, och hålla.
- Vi använder ketamin / xylazin, (100 mg · ml -1, vardera) blandades i 85:15, och administrera 0,1 ml per 100 g råtta vikt intramuskulärt 2,3. Natriumpentobarbital (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) eller isofluran (2-3,5%, inhalerade) kan också användas 4.
- Medan bedövningsmedlet tar effekt kan en exakt vikt erhållas och den vänstra bakben-lem rakat. Detta är också en bra time för att vara säker på att alla elektronik är påslagna och redo. Detta inkluderar datorer, trådtöjningsgivare förstärkare, olja värmare och andra.
- Kontrollera om återlämnande av reflex svaret regelbundet och komplettera anestesi efter behov (0,05 till 0,1 ml per 100 g).
3. Initiera Kirurgi
- Vi använder en plexiglasskiva plattform att immobilisera råttan för kirurgi. Enkel maskeringstejp gör jobbet. Se till att djuret sträckte sig från vänster bakben till höger framben. Tillsätt en droppe smörjmedel till ögonen. Vi använder paraffinolja. Annars kommer ögonen torka ut med ketamin anestesi.
- En liten kirurgisk ljus är användbar. Den här avger tillräckligt med värme för att hålla djuret varmt. Alternativt, kan en vatten värmefilt används. Kontrollera att vara säker hornhinnan eller toe-nypa reflexer är frånvarande innan du fortsätter. Steril teknik är inte nödvändig, eftersom detta förfarande är akut. Djuret kommer inte återhämta sig från anestesi. Vi avliva råttan med bedövningsmedelöverdosering (0,2 ml, intrakardiella) när alla förfaranden är slutförda.
- Den första snittet är genom huden från hälen till ryggraden. Vi använder sax, eftersom djupet av snittet kan styras och saxen används för att separera huden från de underliggande vävnaderna. Råttor har utmärkt hemostas, så länge du undvika stora blodkärl, kommer blödningar begränsas. Håll exponerade ytor täckta med isoton saltlösning-indränkt gasbinda, när så är möjligt.
- Efter huden separeras från den underliggande bindväv, är den ytliga muskelskiktet skärs. Var noga med att inte gå för djupt, du vill inte skada ischiasnerven eller blodkärl, eller muskeln av intresse. Börja över gastrocnemiusmuskeln och skär proximalt, längs samma linje som huden snitt. Peek under för att lokalisera och undvika ischiasnerven. När du ser nerven kan du följa sin väg med snitt, men stanna väl över nerven. Det finns en tydlig söm mellan muslarna. Leta detta, och skär längs den söm mot knäet. Uppmärksamma och undvika blodkärl.
4. Förbered pilothål i lårbenet för benstift
- Skär igenom det tunna lagret av muskler över den bakre aspekten av lårbenet, utsätta den nakna ben. Med hjälp av en handhållen roterande verktyg, borr, eller stift vice, (0,9 mm kolstål bur), göra en liten pilot hål genom cortex, och bara in i märgen. Borra inte för djupt, eller kraftig blödning som följd. Detta hål kommer att användas senare för att placera ett ben stift att immobilisera lårbenet på myograph basen.
5. Isolera innervation av den mediala gastrocnemiusmuskeln
- Nästa steg kräver ett dissektionsmikroskop. Leta reda på platsen där Poplietallymfknutor nerv försvinner bakom den mediala gastrocnemiusmuskeln. Försiktigt sprida ut de olika grenarna, och skär allt som inte innerverar den mediala gastrocnemiusmuskeln. Innervation kan bestämmas genom microstimulation. På this skede också se de ytliga grenar av ischiasnerven skärs.
- Nu rensa bindväv från ischiasnerven, så att det kan glida in i nerven manschetten (senare). Var noga med att behandla nerven försiktigt. Varje sträcka av nerven kan leda till inexcitability och avsluta experimentet i förtid.
6. Isolera hälsenan och gastrocnemiusmuskeln
- Trubbig dissektion, med tillfällig hjälp av sax, kan användas för att separera gastrocnemius från andra vävnader. Senan av plantaris kan dras ut från under hälsenan, bunden och skär. Slips används endast för att hjälpa till att hålla senan och kan skäras bort direkt efter senan skärs och plantaris separeras från gastrocnemius för en betydande längd. Placera en # 1 silkesligatur runt hälsenan och slips i en fyrkantig knut. Dra inte för hårt, eller senan kommer att skadas. Vi använder ben rongeurs att klippa calcan EUS, lämnar en liten bit av ben fortfarande fäst till hälsenan. Håll styckningsytor horisontella för att vara säker på att benet skärs, inte bara senan. Detta säkerställer att hälsenan kan fästas på myograph senare.
- Längs undersidan av gastrocnemius, kan soleus ses. Återigen kan trubbig dissektion kan användas för att separera soleusmuskeln från gastrocnemiusmuskeln. Vi vill isolera mediala gastrocnemius, så det är den enda muskeln fortfarande sitter hälsenan. Skär soleus senan, nära den distala änden. Sedan kan du skilja de mediala och laterala gastrocnemius muskler och skär den laterala senan och lämna den mediala gastrocnemiusmuskeln fäst hälsenan. Dra den laterala gastrocnemiusmuskeln bort från den mediala, tillsammans cirka 50% av sin längd. Utöver denna längd, fibrerna korsar och skador kommer att leda till att ytterligare dra. Kontrollera att vara säker muskeln är fri från bindväv.
- Placera en ligatur runt skaftet, strax ovanför mittpunkten. Detta måste vara tät, utan att skära in i vävnaden. En andra slinga innan kopplingsförbehåll förebygger halka. Återigen använder en fyrkantig knut för att säkra.
- Med hjälp av en liten såg, skär underbenet bort. Denna nedskärning bör vara ungefär halvvägs längs skenbenet.
- Sätt en skarp sond i märgen av skenbenet. Denna prob kommer att användas för att immobilisera skenbenet på myograph basen.
- Fäst 2 resårband på huden, med Michel clips. Dessa och ytterligare resårer skall användas för att hålla huden upp runt muskeln att bilda en behållare som ska fyllas med uppvärmd paraffinolja.
[Valfritt]
8. Sätt sonometric kristaller (valfritt steg) 5
- Placera djuret på en värmedyna på låg inställning. En rektal sond, kan om den inte redan isatt införas vid denna tidpunkt. Använd en liten droppe paraffinolja för att smörja.
- Med hjälp av microstimulation, identifiera ändarna på en fascicle i muskeln. Peta en 21 gauge nål i stället för både ursprung och insättning av muskeln.
- Skjut en sonometric kristall i hålet som gjorts av nålen och tätning med veterinär-obligation kirurgiskt lim. Använd en liten droppe lim, se till att den är placerad rätt över kristallen. Applicera lim till ett papper skuren med en spetsig vinkel hjälper tillämpningen limmet noggrant. Vi ställer en ytterligare kristall vid införandet av fascicle som identifierades genom microstimulation.
[FORTSÄTT]
9. Montera i apparater (se figur 1)
- Placera råttan på myograph bas med den tibiala sonden orienterad mot spaken. Placera sonden i hållaren, för att immobilisera benet.
- Dra huden upp på sidorna, för att bilda en behållare och säkra med resår.
- Ställ borr (1/16: e tum) i lårbenet, med pilotenhål som skapades under kirurgisk beredning. Se till att du stöder lårbenet på den främre delen som du placerar borren (i ett stift vice) som brott av lårbenet kan leda, avslutar experimentet i förtid. Fäst tappen vice till ett tvärstag för att immobilisera lårbenet.
- Placera den distala stumpen av ischiasnerven genom nervstimulerande manschetten (katod mot muskel) och tuck tillbaka nära ursprunget av muskeln. Anslut stimulatorn till dessa trådar.
- Fäst hälsenan till hävarmen, som har sensorer töjningsgivarelement på den. Tie snuggly, men lämna lite utrymme för senare justering. Kontrollera att inriktningen av muskeln är vinkelrät med spaken.
- Fyll behållaren bildas av huden med uppvärmda paraffinolja.
- Sätt på värmelampa och sköldar ställning gjorda av aluminiumfolie över huvudet av djuret, och kraften givaren. Ytterligare folie sköldar kan vara nödvändiga för att säkerställa kärntemperatur djuret inte ExceED 38 ° C. Längden av muskeln kan justeras tills slacket i strängen avlägsnas från anslutningen mellan de mediala gastrocnemius och kraftgivare.
10. Ställ maximal spänning och referens längd
- Medan muskeln värms upp, ställa in stimulatorn och testa stimulans spänning. Det är viktigt att vara säker på att stimuleringen är inställd på mycket kort pulsvaraktighet. Vi använder 50 ps. Maximal spänning bör vara mindre än 1 V. Från 0,5 V, öka spänningen tills rycka amplitud inte ökar. Maximal spänning är den lägsta spänning som aktiverar alla motoriska enheter. Vi stimulerar vanligtvis på dubbla den maximala spänningen, eller 3 V vilket som är högre.
- Vanligtvis kommer experiment börjar med muskeln vid den längd som ger det största rycka kontraktion. En ryckning erhålls med en enda stimuleringspuls. Muskeln längd ökas med ca 1 mm för en annan rycka. Detta upprepas så länge som rycka amplitudökar. När rycka amplitud minskar, kommer längden att returneras till den som gav den största amplituden rycka.
- Efter denna inledande inställning av längd, testar vi systemet med vad vi kallar en "konditionering tetanic kontraktion". Stimulatorn är inställd att avge pulser vid 200 Hz för 500 ms. Leverans av denna stimulans kommer att resultera i en helt smält tetanic kontraktion. Den kraft som genereras av muskeln kommer åt alla anslutningar, inklusive knutar på muskeln. Efter en lämplig vila för avledning av potentiering 4, är referens muskelns längd återställs (se del 9,2). Vanligtvis kommer konditionering tetanic sammandragning har tillåtit några fascicle längd förkortning, så muskeln måste sträckas lite att komma tillbaka till den längd som ger det största sammandragning amplitud rycka.
11. Starta experimentet
- Ett typiskt experiment kommer att omfatta längd adjustment och / eller stimulering med en mängd olika mönster av stimulering. Datainsamling kan innebära bara kraft eller styrka, med längd, fascicle längd och elektromyogram.
[Valfritt]
12. Force-frekvens relation 2
- Ställ tåget varaktighet tillräckligt länge för att nå en platå av kraft vid alla frekvenser av intresse. Den maximala isometriska kraften uppnås i den mediala gastrocnemius vid 200 Hz. Tåg varaktighet skall vara minst 200 ms, längre är bättre för lägre frekvenser, men kommer att resultera i viss trötthet om flera sammandragningar används för att bestämma hela skalan av kraft-frekvensen relation. Vi använder typiskt sammandragningar vid 0, 20, 40, 60, 80, 100 och 200 Hz. Denna frekvensområde tillåter hela skalan av kraft-frekvensen förhållande skall beskrivas. En lämplig vila mellan sammandragningarna måste få för att undvika utmattning (1-10 min).
13. Force-längd relationship 6
- Med den beräknade optimala längden etablerad tidigare, kan en kraft-längd relation kan bestämmas genom att systematiskt justera längden av muskeln från -4 mm till 4 mm med en servomotor apparat. Detta bör göras med användning av maximal stimulering (200 Hz), men vi har funnit att mycket korta sammandragningar kommer att ge samma sak optimala längden 7. Submaximala kontraktioner, som ryckningar, kan användas, men detta kommer att ge en annan längd-beroende av kraft 8.
- En viktig aspekt av bestämningen av den kraft-längd förhållandet är behovet att uppskatta den passiva kraften vid fascicle längd vid vilken den uppmätta kraften uppträder. Aktiv kraft beräknas som skillnaden mellan totala kraften och lämplig passiv kraft. Eftersom de parallella elastiska strukturer bär passiv kraft och dessa är i serie med serie elastiska strukturer måste passiv kraft bidrag till den totala kraft minska när serien elaSTIC strukturer sträcks under en kontraktion 3. När den passiva kraften är känd för alla berörda muskler längder kan lämplig passiv kraft uppskattas med kontinuerlig mätning av fascicle längd med sonomicrometry eller genom att uppskatta huruvida mätsystemet och i-serien strukturer av muskel-senor enhet. Om detta inte görs, är den optimala längden av preparatet och topp krafter, underskattas.
14. Force-hastighet relation 9
- Om du vill bestämma kraft-hastighet relation, måste du bifoga kraftgivarna till ett system som tillåter kontroll av antingen belastning eller graden av längd förändras. Det enklaste och mest kostnadseffektiva metoden är att använda tryckluft för att begränsa matfett till en kontrollerad belastning. I vårt system är muskeln fäst vid hävarmen på ena sidan av ledpunkten och lufttrycket hindrar längdförändring på den andra sidan. En längd sensor neEDS att anställas så att du kan upptäcka förändringar i muskel längd under isotoniska sammandragningar. Detta arrangemang medger afterloaded sammandragningar med pneumatisk motståndskraft. Dubbla tankar kan tillåta isometrisk sammandragning med utsläpp till en isoton belastning. Totalt 15-20 sammandragningar bör inhämtas, med massor från nästan obelastade till maximal isometrisk kraft. Vid montering data till en ekvation, ska laster över 90% av isometrisk inte användas 9.
15. Representativa resultat:
Exempel sammandragningar presenteras i figur 2. Dessa sammandragningar erhölls för att illustrera kraft-frekvensen relation. Beräkning av högsta aktiva kraft dessa sammandragningar, och plottning av den aktiva kraften mot frekvensen, utbyten Figur 3, kraft-frekvensen relation. De data som presenteras i figur 2 kan passa till ekvationen: AF = c / (1 + e ((aF) / b) + d), AF är aktiv kraft, är F-frekvens och en, b, c och d är konstanter.
För råtta mediala gastrocnemiusmuskeln, är halv-maximala frekvensen av stimulering typiskt 50-60 Hz i icke-trött muskel 2. Resultat kommer att passa tätt till den linje som beskrivs av ekvationen ovan.
Figur 1 Apparatur och muskel set-up:. Pneumatisk uppställning visas till vänster, isometrisk till höger. Spaken som visas till vänster är fäst till översättningstabellen när dynamiska kontraktioner önskas (anpassad från 13). Stegmotorn styrs av en dator (anpassad från 14).
. Figur 2 Ovanpålagda isometriska kontraktioner: 20, 40, 60, 80, 100 och 200 Hz. Amplituden av 200 Hz sammandragning är 8,13 N.
les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg "/>
. Figur 3 Kraft-frekvens förhållande: Aktiv kraft sammandragningar i figur 2 plottas och linjen representerar raden av bästa passform.
Discussion
Bra kvalitet kontraktila resultat kan uppnås med försiktighet kirurgisk beredning, säker montering i apparaten och goda elektronik kvalitet. När en elev lär denna operation, några vanliga glider inkluderar: stretching ischiasnerven, störa blodflödet och kraftig blödning. Nerven måste hanteras med varsamhet för att förhindra skador. Du kommer att veta att du har skadat nerven om den maximala tetanic kraft vid optimal längd är väsentligen mindre än den som visas i fig 3, eller om stimuleringen spänningen som behövs för maximalt aktivera alla motoriska enheter är större än 5 volt. Det är relativt lätt att undvika blodkärlen som betjänar denna muskel under operationen. Störningar på dessa fartyg kan uppstå när borrkronan placeras i den kaudala ytan av lårbenet. Om styrhålet inte på den plana ytan av lårbenet, kan borren glida. När detta händer finns det en möjlighet att de Poplietallymfknutor fartygen blir störd. Omblod pooler runt muskeln efter installation, är det ett tecken på att du har stört dessa fartyg. Kraftig blödning kan också uppstå om en stor ven skärs och inte bunden. Stora vener att se upp för är de runt vristen.
In situ muskel preparatet är en värdefull metod för studier av muskel kontraktila egenskaper. Enskilda motorenheter kan aktiveras 10, men vanligtvis alla motoriska enheter aktiveras synkront. Detta är en nackdel i förhållande till den normala asynkrona aktivering som sker genom frivilliga motorenhet rekrytering representerar så en begränsning. Men på den positiva sidan, medger synkron aktivering kvantifiering av en genomsnittlig respons av alla motoriska enheter.
Det finns två tillvägagångssätt som har använts för att undvika synkron aktivering. Ett är att använda en elektrod manschett med flera par av stimulerande ledningar. Detta möjliggör aktivering av en del av de motoriska enheterna med varje par,och stimulering kan rotera genom paren att uppnå asynkron aktivering. Denna metod för aktivering kan kombineras med anod blocket 11 att försöka att aktivera motoriska enheter i lämplig sekvens beroende på storleken princip 12. I detta tillvägagångssätt, är alla motoriska enheter aktiveras med en proximal par elektroder, och ett block läggs med likström stimulering. Amplituden av stimulus för blocket kan moduleras för att inhibera motorenheter för vilken aktivering inte är önskvärd. Tydligen blocket påverkar stora axoner till lägsta spänning, och successivt påverkar mindre enheter.
In situ råtta gastrocnemiusmuskeln preparatet är en värdefull fysiologisk metod för studier av skelettmuskulaturen kontraktion och biokemiska egenskaper i hälsa och sjukdom.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Forskning som stöds av naturvetenskap och teknisk forskning Council of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clippers | Good quality pet clippers | ||
| Surgical lamp | Dyna-Lume | Any of several will do | |
| Myograph | Custom built | ||
| Stimulator | Grass Technologies | S-88 | Any of several will do |
| Strain gauge amplifier | CWE, Inc. | PM-1000 | |
| Telethermometer | YSI | YSI-400 | |
| Robotic platform | Arrick Robotics | MD-2 | |
| Sonometric amplifier | Sonometrics | Sonolab | |
| Computer and data collection | PC with NI board | Custom software (labview) | |
| Block heater | Labline Instruments | Multi-block | |
| Nerve cuff | Custom made | ||
| Microstimulator | Custom made |
References
- MacIntosh, B. R., Gardiner, P. F. Posttetanic potentiation and skeletal muscle fatigue: interactions with caffeine. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 65, 260-268 (1987).
- Dormer, G. N., Teskey, G. C., MacIntosh, B. R. Force-frequency and force-length properties in skeletal muscle following unilateral focal ischeaemic insult in a rat model. Acta. Physiol. (Oxf.). 197, 227-239 (2009).
- MacIntosh, B. R., MacNaughton, M. B. The length dependence of muscle active force: considerations for parallel elastic properties. J. Appl. Physiol. 98, 1666-1673 (2005).
- Tubman, L. A., MacIntosh, B. R., Rassier, D. E. Absence of myosin light chain phosphorylation and twitch potentiation in atrophied skeletal muscle. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74, 723-728 (1996).
- MacNaughton, M. B., MacIntosh, B. R. Impact of length during repetitive contractions on fatigue in rat skeletal muscle. Pflugers. Arch. 455, 359-366 (2007).
- MacNaughton, M. B., MacIntosh, B. R. Reports of the Length Dependence of Fatigue are Greatly Exaggerated. J. Appl. Physiol. 101, 23-29 (2006).
- Rassier, D. E., MacIntosh, B. R. Length-dependent twitch contractile characteristics of skeletal muscle. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 80, 993-1000 (2002).
- Rack, P. M. H., Westbury, D. R. The effects of length and stimulus rate on tension in the isometric cat soleus muscle. Journal of Physiology. 204, 443-460 (1969).
- Devrome, A. N., MacIntosh, B. R. The biphasic force-velocity relationship in whole rat skeletal muscle in situ. J. Appl. Physiol. 102, 2294-2300 (2007).
- Drzymala-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. Summation of motor unit forces in rat medial gastrocnemius muscle. J Electromyogr. Kinesiol. 20, 599-607 (2010).
- Petrofsky, J. S. Control of the recruitment and firing frequencies of motor units in electrically stimulated muscles in the cat. Medical & Biological Engineering & Computers. 16, 302-308 (1978).
- Bawa, P., Binder, M. D., Ruenzel, P., Henneman, E. Recruitment order of motoneurons in stretch reflexes is highly correlated with their axonal conduction velocity. Journal of Neurophysiology. 52, 410-420 (1984).
- Dormer, G. N. Fundamental Contractil Properties of Skeletal Muscle Following a stroke in a Rat Model. Master's Thesis. , University of Calgary. (2008).
- MacNaughton, M. B. The Length dependence of Fatigue and of Repetitive Contractions. Master's Thesis. , University of Calgary. (2005).
