Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Summary

Protocol

NIH3T3 la préparation des cellules:

A. Cellules pour l'éjection

1. Trypsiniser cellules, puis diluer 1:1 avec les médias de cellules, et le transfert à partir d'un flacon T75 à un tube Falcon de 15 ml
2. Isoler les cellules en un culot par centrifugation, aspirer le surnageant et laver les cellules avec du DPBS
3. Isoler les cellules en un culot à nouveau, et aspirer le surnageant
4. Resuspendre les cellules dans les médias
5. Déterminer la densité des cellules avec des hémocytomètre (~ 200 x 10 ⁴ cellules / mL par flacon T75)
6. Solution cellulaire Centrifuger, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans le montant approprié des médias pour différentes concentrations cellulaires

Cellule d'éjection B.

1. Cellules Vortex avant de l'utiliser pour l'éjection
2. Transférer 200 ul de solution de la cellule dans la seringue
3. Réglez le mode approprié sur un générateur d'impulsions
   1. Pour éjecter des gouttelettes d'unique et de multiples gouttelettes (rafales), mis en générateur d'impulsions à «E. BUR" mode
   2. Pour l'éjection de gouttelettes en continu, mis en générateur d'impulsions à "NORM" mode
4. Modifier les paramètres du signal
   1. Réglez le niveau de haute et basse tension de sortie niveau: HIL à 5 V et de LOL à 0 V et assurez-vous de la «LIM» est allumée
   2. Régler le signal comme un signal carré
   3. Changer la quantité de temps l'électrovanne est ouverte pour l'éjection de gouttelettes en changeant la valeur de "IFD" ou le changement cyclique («devoir»)
   4. Modifier la fréquence d'éjection en changeant la valeur de "PER"
   5. Modifier le nombre de gouttelettes éjectées dans un élan en changeant la valeur de "BUR"
5. Solution cellulaire éjection sur le substrat préparé pour l'imagerie au microscope

Coloration C.

1. Maquillage solution de colorant avec 0,5 uL calcéine-AM et 2 uL d'éthidium homodimère par ml de DPBS
2. Plongez substrat préparé dans une solution de teinture
3. Laisser l'échantillon à incuber pendant 10 minutes à 37 ° C avant d'imagerie

Validation Experiment

1. Sur un Nikon Eclipse TE-2000 U microscope à fluorescence
   1. Logiciels avancés spot (Diagnostics, Inc)
   2. Live / Dead Assay

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent Microscope		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
Solenoid valve cell ejector				Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current
5-Gallon Portable air tank		Coleman	Powermate CT5	Pressurized air: 30 PSI
Pressure regulators		Marsh Bellofram
Pulse Generator			HP8112A	Actuation frequency generation: 50 MHz
XYZ-stage		Newmark Systems		With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution
NIH 3T3	Cell-line			fibroblasts
Trypsin				0.05% solution
NIH 3T3 cell medium
DPBS	Buffer
T75				Tissue culture flasks
Plastic conical tubes				15 ml, for tissue culture