Titolo Incapsulamento cella di goccioline

Summary

Protocol

NIH3T3 cellule preparazione:

Le cellule A. espulsione

1. Trypsinize cellule, poi diluire 1:1 con mezzi di comunicazione cellulare, e il trasferimento da un pallone T75 ad un tubo da 15 ml Falcon
2. Spin le cellule in una pallina da centrifugazione, aspirare il surnatante e lavare le cellule con DPBS
3. Spin le cellule in una pallina di nuovo e aspirare il surnatante
4. Risospendere le cellule in mezzi di comunicazione
5. Determinare la densità delle cellule con emocitometro (~ 200 x 10 ⁴ cellule / ml per T75 fiasco)
6. Cellula soluzione centrifuga, aspirare il surnatante e risospendere in giusta quantità di supporti per la variazione delle concentrazioni di cellule

B. cella di espulsione

1. Cellule vortice prima di utilizzare per l'espulsione
2. Trasferire 200 ul di soluzione di cella in siringa
3. Impostare la modalità appropriata sul generatore di impulsi
   1. Per espellere gocce singole e multiple gocce (treni), insieme al generatore di impulsi "E. BUR" modalità
   2. Per l'espulsione delle gocce continuo, generatore di impulsi impostato in modalità "NORM"
4. Modificare le impostazioni del segnale
   1. Impostare il livello alto e basso livello di tensione di uscita: HIL a 5 V e LOL a 0 V e assicurarsi che il "LIM" LED è acceso
   2. Impostare il segnale come un impulso quadrato
   3. Modificare la quantità di tempo la valvola solenoide è aperta per l'espulsione delle gocce, modificando il valore di "WID" o cambiando duty cycle ("dovere")
   4. Modificare la frequenza di espulsione, modificando il valore di "PER"
   5. Modificare il numero di goccioline espulse in uno scoppio, modificando il valore di "BUR"
5. Cellula soluzione di espulsione su substrato preparato per l'imaging con microscopio

C. colorazione

1. Portare soluzione colorante con 0,5 microlitri calceina-AM e 2 omodimero microlitri di etidio per ml di DPBS
2. Immergere substrato preparato in soluzione colorante
3. Lasciare campione ad incubare per 10 minuti a 37 ° C prima di imaging

Esperimento di convalida

1. Su una Nikon Eclipse TE-2000 Microscopio U fluorescente
   1. Spot software avanzato (Diagnostics, Inc.)
   2. Live / Dead Assay

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent Microscope		Nikon Instruments	Eclipse TE-2000 U
Solenoid valve cell ejector				Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current
5-Gallon Portable air tank		Coleman	Powermate CT5	Pressurized air: 30 PSI
Pressure regulators		Marsh Bellofram
Pulse Generator			HP8112A	Actuation frequency generation: 50 MHz
XYZ-stage		Newmark Systems		With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution
NIH 3T3	Cell-line			fibroblasts
Trypsin				0.05% solution
NIH 3T3 cell medium
DPBS	Buffer
T75				Tissue culture flasks
Plastic conical tubes				15 ml, for tissue culture