Summary
Protocol
NIH3T3 preparação células:
Células de A. de ejeção
- Trypsinize células, então diluir 1:1 com media de células, e transferência de um frasco T75 para um tubo Falcon 15 mL
- Spin down células em um pellet por centrifugação, aspirar o sobrenadante e lavar as células com DPBS
- Spin down células em uma pelota de novo, e aspirar o sobrenadante
- Ressuspender as células em meios de comunicação
- Determinar a densidade de células com hemocitômetro (~ 200 X 10 4 células / mL por frasco T75)
- Solução da célula centrífuga, aspirar o sobrenadante e ressuspender em quantidade adequada dos meios de comunicação para diferentes concentrações de células
B. Célula de ejeção
- Vortex células antes de usar para a ejeção
- Transferir 200 mL da solução de célula em seringa
- Definir o modo apropriado no gerador de pulso
- Para ejetar gotículas de única e gotículas múltiplas (rajadas), grupo gerador de pulso para "E. BUR" modo
- Para a ejeção de gotas contínuo, grupo gerador de pulso para "NORM" modo de
- Alterar as configurações de sinal
- Conjunto de alto nível e baixo nível de tensão de saída: LIS a 5 V e LOL para 0 V e certifique-se o "LIM" LED está ligado
- Definir como um sinal de pulso quadrado
- Alterar a quantidade de tempo que a válvula solenóide é aberta para a ejeção de gotas, alterando o valor para "WID" ou mudar ciclo ("dever")
- Mudar a freqüência de ejeção, alterando o valor para "PER"
- Alterar o número de gotículas ejetado em uma explosão, alterando o valor para "BUR"
- Solução da célula ejetar em substrato preparado para imagens com microscópio
Coloração C.
- Compõem solução corante com 0,5 mL calceína-AM e 2 homodímero de etídio mL por mL de DPBS
- Substrato preparado mergulhe em solução corante
- Deixar a amostra para incubar por 10 minutos a 37 ° C antes de imagem
Validação de experiência
- Em um microscópio Nikon Eclipse TE U-2000 Fluorescent
- Software ponto avançado (Diagnostics, Inc.)
- Live / Morto Assay
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
| Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
| 5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
| Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
| Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
| XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
| NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
| Trypsin | 0.05% solution | |||
| NIH 3T3 cell medium | ||||
| DPBS | Buffer | |||
| T75 | Tissue culture flasks | |||
| Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |
