מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Summary

תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ"א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ"א הגנומי היעד.

Abstract

אפיגנטיקה מתאר את תורשתי שינויים בתפקוד הגן המתרחשות באופן עצמאי רצף ה-DNA. הבסיס המולקולרי של ויסות הגנים epigenetic היא מורכבת, אבל בעצם כרוך שינויים DNA עצמו או את החלבונים עם ה-DNA אשר מקורביו. שינוי epigenetic העיקרי של ה-DNA בגנום של יונקים הוא מתילציה של נוקלאוטידים ציטוזין (5-MEC). מתילציה DNA מספקת הוראה מכונות ביטוי גנים כמו אל איפה ומתי הגן צריך לבוא לידי ביטוי. רצף היעד העיקרי מתילציה בדנ"א של יונקים היא 5'-CPG-3 "dinucleotides (איור 1). Dinucleotides CPG אינם מפוזרים באופן אחיד לאורך הגנום, אבל מרוכזים באזורים של רצפי הגנום חוזרות CPG "איים" נפוץ הקשורים מקדמי גן (איור 1). ומתילציות DNA מבוססים מוקדם בהתפתחות, מווסתת במהלך התמיינות רקמות ספציפיות שיבשו במדינות רבות, כולל מחלת הסרטן. כדי understand את התפקיד הביולוגי של מתילציה דנ"א ותפקידה מחלות אנושיות, מדויק, יעיל שיטות לשחזור נדרשים לזהות ולכמת בודדים 5-MeCs.

זה פרוטוקול המרה bisulphite הוא "תקן הזהב" לניתוח מתילציה בדנ"א ומקל על זיהוי וכימות של מתילציה בדנ"א ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד. הכימיה של deamination ציטוסין ידי bisulphite נתרן כרוכה בשלושה שלבים (איור 2). (1) Sulphonation: תוספת של 5-6 bisulphite לקשר הכפול של Deamination (2) ציטוזין hydrolic: deamination hydrolytic נגזרת של ציטוזין-bisulphite וכתוצאה מכך לתת נגזרת אורציל-bisulphite (3) Desulphonation אלקליות: הסרת sulphonate קבוצה ידי טיפול אלקלי, לתת אורציל. Bisulphite מעדיפים deaminates ציטוסין כדי אורציל ב DNA גדילי יחיד, ואילו 5-MEC, הוא עקשן deamination bisulphite בתיווך. עם הגברה PCR, אורציל מוגברכמו תימין תוך 5-MEC שאריות להישאר cytosines, המאפשר CpGs מפוגל להיות נבדל CpGs unmethylated על ידי נוכחות של "C" מול ציטוזין ותימין שאריות "T" במהלך רצף.

שינוי ה-DNA על ידי המרה bisulphite הוא פרוטוקול מבוססת היטב כי ניתן לנצל שיטות רבות של ניתוח מתילציה בדנ"א. מאז הגילוי של 5-MEC על ידי המרה bisulphite הודגם לראשונה על ידי פרומר ואח'. ¹ וקלארק et al. ^2, שיטות מבוססות סביב המרה bisulphite חשבון הדנ"א הגנומי עבור רוב הנתונים החדשים על מתילציה בדנ"א. שיטות שונות של ניתוח PCR פוסט עשוי להיות מנוצל, תלוי במידת הספציפיות ברזולוציה של מתילציה הנדרש. שיבוט וסדר היא עדיין השיטה הכי זמינים שיכול לתת פתרון נוקלאוטיד יחיד עבור מתילציה על פני מולקולת הדנ"א.

Protocol

Bisulphite המרה פרוטוקול

פרוטוקול סטנדרטי עבור ההמרה של 2 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי מתואר להלן. כמויות קטנות יותר או גדולות יותר של הדנ"א הגנומי (100 PG-200 מיקרוגרם) יכול להיות גם bisulphite מטופלים בהצלחה. אלה התנאים התגובה התוצאה המרה מלאה (99.5-99.7%) של כמעט כל רצף ה-DNA היעד ^3.

1. ה-DNA הכנה

הכינו דגימות הדנ"א הגנומי ידי דוגרים עם הצפת תמוגה bisulphite דנ"א (2 מיקרוגרם t-RNA, 280 ng / μl proteinase K, 1% SDS) בהיקף כולל של 18 μl עבור שעות 1 ב 37 ° C. הערה: זה חשוב כדי להשיג bisulphite המרה מירבית, במיוחד עם ה-DNA שבודד דגימות קליניות שם עדיין עשויה להיות קשורה חלבון ה-DNA.

2. ה-DNA denaturation

1. לפגל 2 מיקרוגרם DNA בנפח של 20 μl על ידי הוספת 2 μl של המוכן טרי 3M NaOH ל ג הגמרoncentration של 0.3M.
2. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות באמבט מים, ואחריו הדגירה על 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות בתוך גוש חום. מיד למקום צינורות על קרח דק '5.
3. צנטריפוגה צינורות ב 4 מעלות של 10 גרם ב 10,000, כדי להבטיח את ה-DNA הוא בתחתית של התחתית.

3. Bisulphite Deamination

Sulphonation & Deamination hydrolytic

1. הכינו פתרונות טריים של 10 Quinol רווי mM נתרן metabisulphite pH 5.0 (7.6 גרם Na ₂ S ₂ O ₅ עם 464 μl של 10 M NaOH, עשה עד 15 מ"ל מים). הפתרון של bisulphite נתרן רווי מושגת על ידי היפוך בעדינות את תערובת מגיב / H ₂ O, עם ערבוב מינימלי אוורור. במידת הצורך, להתאים את ה-pH עם 10 M NaOH, עבור פירוק מלא של metabisulphite הערה:. כפי שהוא פתרון רווי, גושים קטנים עדיין יכולים להישאר שלא נמסה.
2. הוספת 208μl של metabisulphite רווי 12 μl של Quinol 10mm ל-DNA מפוגל (20 μl), נפח סופי של 240 μl לריכוז סופי של 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0. בעדינות מערבבים את כל ריאגנטים צנטריפוגות במשך 10 שניות בלבד כדי להבטיח את כל הטיפות נמצאים בתחתית של התחתית.
3. כיסוי דגימות עם 200 μl של שמן מינרלי. דגירה דגימות ב 55 מעלות צלזיוס באמבט מים, במשך 4-16 שעות. אורך הטיפול bisulphite תלוי בכמות ובאיכות של ה-DNA להיות מומר. עבור ה-DNA באיכות ירודה או דנ"א מושפל, להגביל את זמן הדגירה עד 4 שעות. הערה: חשוב כי ההמרה bisulphite מתקיים בחושך, כדי למנוע חמצון, כך שאם זה לא ניתן לעטוף את הצינורות בנייר כסף לפני הדגירה .
4. בתום זמן הדגירה מתאים, לסובב את הצינורות בקצרה microcentrifuge כדי להבטיח את כל הנוזל בתחתית הצינור.
5. שחזר את ה-DNA טיפול bisulphiteמתחת לשכבת הנפט על ידי בקפידה pipetting את פתרון ה-DNA מהחלק התחתון של הצינור, בלי לקחת את כל שמן מינרלי.

Desalting

5. הסר את כל היונים bisulphite חינם על ידי עובר דרך עמודה desalting ו משחררי ב μl של 50 מילי-Q מים (MQH ₂ O). תלוי בכמות ובאיכות של הדנ"א הגנומי ואיך הוא מוכן, טורים desalting שונים יכולים לשמש. אנו משתמשים באופן שגרתי Promega אשף ניקוי עמודות, כמו עמודות אלה מתאימים להסיר SDS המשמש בהכנת ה-DNA לפני ההמרה.

אלקליות Desulphonation

6. Adduct bisulphite יוסר הטבעת אורציל ידי desulphonation. Desulphonate ידי הוספת 5.5 μl של המוכן טרי 3M NaOH ריכוז סופי של 0.3M, אז דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
7. צנטריפוגה בקצרה ולהוסיף 1 μl של t-RNA (10 מ"ג / מ"ל).
<li> מנטרלים את הפתרון על ידי תוספת של 33 μl של אמוניום אצטט (NH ₄ O Ac), pH 7.0 עד ריכוז סופי של 3M.
8. אתנול, להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת 330 μl של אתנול קרים 100%, ומערבבים היטב על ידי היפוך. השאר ב-20μC עבור שעות 1 עד לילה. צנטריפוגה ב g 14,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C. הסר את כל עקבות של supernatant ואוויר יבש זירז את ה-DNA של ~ 20 דקות.
9. Re-להשעות את גלולה דנ"א μl 50 / מיקרוגרם של 0.1 TE (10mm טריס-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) או H ₂ O. השאירו בטמפרטורת החדר למשך כ 2hrs. מערבולת מדי פעם הצינורות כדי להבטיח את ה-DNA הוא מומס, ואחריו צנטריפוגה מהירה.
10. השתמש מיד הגברה PCR, או לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1-10 שנים, תלוי בכמות ואיכות ה-DNA.

4. PCR הגברה

פריימר עיצוב

1. תכנון יעיל של ה-PCR bisulphite המרה ספציפי primers הוא cruciaאני להבטיח כי הגברה יעיל, מוטה לחלוטין של ה-DNA המרה מתרחשת. הקווים המנחים הבאים משמשים כדי לסייע בעיצוב פריימר.

עיצוב פריימר הנחיות

Thermocyling

2. כדי לבדוק הגברה PCR היחסי של ה-DNA ואת מפוגל unmethylated, השתמש 50:50 מפוגל / Unmethylated bisulphite מלא מדגם לשלוט המרה ולהגביר עם bisulphite ספציפי המרה primers בתנאים אופטימיזציה תגובת PCR (איור 3). עבור מפוגל 50:50: שליטה Unmethylated, להשתמש ב-DNA במבחנה SssI מפוגל ואו הגנום כולו מוגבר (WGA) דנ"א או דנ"א דם כולו. שים לב כמה גנים יהיו מפוגל באופן טבעי בדם, ולכן במקרים אלה עדיף להשתמש רק WGA ה-DNA כמו שליטה "Unmethylated".
3. הכנת תערובות תגובת PCR הגברה ב 100 & mu; aliquots אני המכיל 2 μl של ה-DNA הגנומי bisulphite המרה, 200 מיקרומטר dNTP 1, primers מיקרומטר, 1.5 mM MgCl _2, 50 mM KCl, 10mm טריס-HCL, pH 8.3 ו 0.15 פולימראז תקי μl.
4. ב thermocycler שיפוע טמפרטורה, קבע את התגובה לרוץ צבע + / - 3 מעלות צלזיוס מן אני החזוי של פריימר על פני 10 צינורות

5. כדי לבדוק כי amplicons מפוגל ו unmethylated כבר מוגבר בפרופורציות, amplicon יכולים להתעכל עם אנזים הגבלה אינפורמטיבי, כגון תקי 1 (TCGA), כי יהיה לעכל דנ"א מפוגל אך לא לעכל דנ"א unmethylated כאשר האתר הוא אנזים הגבלה שינה לאחר ההמרה bisulphite כדי TTGA. היקף העיכול ניתן דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose (איור 3A). לחלופין, SYBRGreen (0.2 μl של דילול 1:1000) ניתן להוסיף את תגובת ה-PCR והיקף מתילציה ניתן להעריך על ידי ביצוע חום מגרשים דיסוציאציה בזמן אמת PCR thermocycler (איור 3B).
6. לערבב PCR תגובת כולל MgCl ₂ תנאים ריכוז thermocycling ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי להגביר את יעילות ה-PCR או כדי להבטיח הגברה PCR היחסי של שברי PCR מפוגל ו unmethylated.
7. ברגע התנאים PCR מותאמים, הגברה PCR יכול להתבצע על דגימות המרה bisulphite. הערה: לאחר אני מותאם טמפרטורה הדרגתי PCR לא צריך להיות בשימוש.

5. נציג תוצאות:

דוגמה אופטימיזציה הגברה PCR bisulphite מוצגת באיור 3. תנאים אופטימליים PCR הגברה צריך להגביר amplicons מפוגל ו unmethylated בפרופורציה וללא משוא פנים. איור 3A מציגה ג'ל agarose עם פרופיל שיפוע הטמפרטורה הגברה PCR מתערובת של DNA ו - 50% מפוגל unmethylated. ה 'דואר amplicons PCR טופלו אנזים הגבלה, תקי 1 (TCGA), כי יהיה לעכל מפוגל (M) DNA אך לא לעכל unmethylated (U) הדנ"א באתר אנזים ההגבלה משתנה על ידי המרה bisulphite כדי TTGA. כמות שווה של לחתוך נימול מוצר PCR צפוי אם ה-DNA ואת מפוגל unmethylated מוגבר בפרופורציה. ניתן לראות על ג'ל זה שהתנאים thermocyling הגברה אופטימלית ללא משוא פנים נמצאת 56.1 ° C (T). המרה מלאה של ה-DNA bisulphite יכול גם להיות מנותח על ידי אנזים העיכול עם ציטוזין לאתר ספציפי כגון HPA III (CCGG). HPA III רק לעכל אם ההמרה נכשלה, כמו באתר הגבלה יישמר. אם השלמת ההמרה באתר הגבלה יומרו TCGG או TTGG בהתאם למצב המתילציה של הדנ"א. ה-DNA השלם המרה bisulphite ניתן לראות באיור 3 א (ג).

איור 3 ב מציג עלילה אמיתית דיסוציאציה זמןיכול לשמש גם ככלי כדי לקבוע אם יש הטיה הגברה המבוססת על בטמפרטורה שבה מולקולות שונות יהיה לנתק. בתרשים זה ניתן לראות כי ה-PCR יש מוגבר מפוגל (M) ו unmethylated (U) DNA ביחס מתערובת של DNA ו - 50% מפוגל unmethylated לעומת הגברה הבקרה של ה-DNA מפוגל מלא unmethylated אשר לנתק את 82.1μC ו 78.9μC בהתאמה.

אחרי אופטימיזציה של thermocyling ותנאי התגובה Bisulphite דגימות טיפול יכול להיות מוגבר עם פריימרים ספציפיים גדיל bisulphite ספציפית או תגובה אחת או חצי PCR מקוננות. שברי כתוצאה PCR ניתן דמיינו ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose ואת רצף במישרין (איור 4 א) או על ידי שיבוט וסדר. לאחר שיבוט רצף המדינה מתילציה של מולקולות בודדות ניתן tabulated, במפה bisulphite (איור 4B), כדי להמחיש את ההטרוגניות שלמתילציה.

תפוקה גבוהה כמותי וניתוח מתילציה ניתן preformed שימוש בטכנולוגיה כגון זה מנוצל על ידי שיטת EpiTYPER Sequenom. באמצעות שיטה זו, ה-DNA המרה bisulphite מוגבר עם bisulphite ספציפי PCR primers ואחריו תהליך מחשוף proprietry. שברים כתוצאה מכך הם ונרשמת ידי ספקטרומטריית MALDI-TOF המוני עם ספקטרום ספציפי תלויה בנוכחות cytosines מפוגל (איור 5A). סיכום יחסי מתילציה במדגם לאחר מכן ניתן להסיק בצורת מכתם (איור 5 ב) או עלילה מתילציה (איור 5 ג).

באיור 1. סכמטית CPG מפוגל. בתא נורמלי, האמרגן-CPG הקשורים האיים הם בעיקר unmethylated (אפור) ואילו אתרי CPG בתוך גופים הגן הם בדרך כלל דליל מפוגל (אדום). הפאנל בצד ימין מרחיבה את struct מולקולריתיור של ה-DNA באתר CPG הפרט מראה מתילציה עם מולקולה CH3 על פחמן 5 של ציטוזין.

באיור 2. . כימית סכמטית המרה ניתוח של מתילציה בדנ"א כולל ארבעה שלבים עיקריים כפי שמוצג; denaturation, המרה bisulphite, הגברה PCR וניתוח. בחלונית הימנית, שינויים המולקולה ציטוסין המתרחשים במהלך ההמרה bisulphite מתוארים.

באיור 3. אופטימיזציה של ה-PCR הגברה א. Agarose ג'ל אלקטרופורזה עם פרופיל שיפוע הטמפרטורה הגברה PCR מתערובת של DNA ו - 50% מפוגל unmethylated. רסיסים כבר מעוכל עם או Taq1 (T) או HpaIII (H) אשר לעכל דנ"א מפוגל ולא DNA המרה bisulphite בהתאמה. ב חום ניתוח עקומת דיסוציאציה מראה equaשיעור l של ה-DNA ואת מפוגל unmethylated (אדום לערבב קו 50/50) לעומת הגברה השליטה מפוגל מלא (קו ורוד, M) ו-DNA unmethylated (קו ירוק, U) אשר לנתק ב 82.1 ° C ו 78.9 ° C בהתאמה.

איור 4. דוגמה של רצף ישיר מפה bisulphite א. רצף עקבות של שלוש שורות תאים שונים עם אתרים CPG מודגשות בצהוב. Cell קו X מציג מתילציה 100% בכל שלושת אתרי CPG בעוד שורות תאים Y ו-Z להראות בדרגות שונות של מתילציה כפי שנראה על ידי חופפים G / אותות. ב נציג bisulphite מפה המציגה את צפיפות מתילציה (נקודות אדומות) באתרים CPG בודדים, כפי שנקבע על ידי רצף ישיר של שיבוטים בודדים.

איור 5. תפוקה גבוהה באמצעות ניתוח דנ"א מתילציה Sequenom א. ספקטרום להציג באמצעות טכנולוגיה Sequenom epiTYPER. שברי DNA להציג ספקטרום ספציפי, בהתאם לכמות של ההווה מתילציה בדנ"א. ב מכתם סיכום של אחוז מתילציה DNA בכל אתר CPG ארבע שורות תאים שונות. העלילה C. סיכום מתילציה נגזר מכתם Sequenom.

Discussion

מתילציה DNA על ידי ניתוח רצפי הדנ"א הגנומי של המרה bisulphite היא שיטה מבוססת היטב צדדי המאפשר זיהוי וכימות של מתילציה בדנ"א ברזולוציה של נוקלאוטיד בודד. עם זאת, ההמרה bisulphite וניתוח לאחר מכן מסתמכת על ההנחה כי ה-DNA שהומרה באופן מלא עם כל ציטוסין unmethylated להיות deaminated כדי אורציל ורק cytosines מפוגל שנותרו בלתי תגובתי. אם הגיור אינו שלם, עלולות להתעורר בעיות עם ניתוח מאז cytosines unmethylated unconverted עשוי להתפרש באופן שגוי כמו cytosines מפוגל. המרה Bisulphite יכול להיות מותאם בשלבים שונים כדי למקסם את אחוז ההמרה. עבור ה-DNA כדי שניתן יהיה להמיר אותו במלואו הראשון חייב להיות חד גדילי כך שאריות ציטוסין נחשפים יוני bisulphite. הצעד הראשון, denaturation DNA, הוא קריטי ויכול להיות מקור המרה שלם אם ה-DNA אינו מפוגל לחלוטין. על מנת להבטיחכי ה-DNA הוא מפוגל מלא חשוב הפרמטרים כולל הסרת תגובה של חלבון בכל הקשור, ריכוז מלח מתאימים, טמפרטורת הדגירה ובזמן המתאימים כדי לשמור על ה-DNA קונפורמציה תקועים אחד. חשוב להשתמש טרי NaOH 3M ולאפשר זמן הדגירה מספקת. אם ה-DNA הוא מתנגד denaturation, כמה שינויים בפרוטוקול כולל הארכת זמן הדגירה עד 30 דקות או פיצול ה-DNA לפני denaturation עשוי להקל denaturation DNA. בנוסף, ה-DNA גדילי יחיד (ssDNA) עשוי לחשל מחדש להכפיל את ה-DNA גדילי (dsDNA) במהלך התגובה bisulphite המרה. ביצוע התגובה בטמפרטורה גבוהה יותר (90-95 מעלות צלזיוס) או מעת לעת, או באופן רציף במהלך התגובה bisulphite יכול לסייע בשמירה על ssDNA. עם זאת, חשוב להיות מודעים לכך השפלה DNA הוא מואץ מאוד על אלה טמפרטורות גבוהות יותר. ריאגנטים שונים ניתן גם להוסיף לשבש מחדש חישול של הדואר גדילי דנ"א, כגון אוריאה.

ריכוז ה-DNA ואיכותו יכול להשפיע גם על היעילות של התגובה bisulphite ו האולטימטיבי תשואה PCR. השפלה DNA הוא מגבלה של פרוטוקול המרה bisulphite. הטיפול הכימי של הדנ"א מציגה הפסקות גדיל שונים ssDNA וחלק התנאים הקשים הדרושים המרה bisulphite מלא כולל ריכוז bisulphite גבוהה, פעמים דגירה ארוך יכול להאיץ השפלה DNA. בתנאים סטנדרטיים תגובה תיאר, השפלה DNA הוא לא בעיה נפוצה עם זאת, אם השינויים הם הציגו פרוטוקול, כגון רצפים שאינם עקשן המרה, עבור תבניות דנ"א מפורקים או באיכות ירודה, כגון דגימות FFPE, אז השפלה DNA יכול להיות מגבלה משמעותית.

פורמלין פרפין קבוע, מוטבעים (FFPE) דגימות DNA מושפל יכול להיות יעיל bisulphite המרה מוגבר בפרוטוקול זהאך שינויים על מנת להבטיח כי ה-DNA אינו מושפל עוד יותר מומלץ. השימוש של RNA מוביל כגון t-RNA מומלץ. כמו כן הגליקוגן ניתן להוסיף כנשא כאשר ריכוז ה-DNA הוא נמוך (<200 ננוגרם). בגלל ה-DNA שבודד רקמות FFPE כבר מקוטעת פיצול נוסף מתקיים במהלך deamination, יש להקפיד למזער השפלה נוספת. אל ה-DNA שבר נוספת לפני denaturation ולהגביל את זמן הדגירה של התגובה bisulphite עד 4 שעות. עיצוב amplicons לא יותר מאשר 300 נ"ב עקב DNA מקוטעת.

גורם נוסף שיכול להשפיע על הגברה PCR כי ההמרה bisulphite של cytosines unmethylated מפחית את המורכבות של תבנית ה-DNA. פריימר הבאים עיצוב פרוטוקול המפורטים בסעיף 4.1, אורך פריימר מוגברת PCR מקוננים יכולים לעזור להגביר את הספציפיות ואת התשואה PCR.

לבסוף, מאז תבנית ה-DNA משתנה במהלך bisulphITE המרה, הטיה הגברה יכולה להיות דאגה. ודא הגברה יחסי PCR של תבניות מפוגל ו unmethylated מסומנת עם תערובת 50/50 לשלוט DNA M / U, כפי שמתואר בפרוטוקול, ראה איור 3. כמו כן, להבטיח כי הגברה של תבניות המרה רק מתרחש באמצעות אנזים HpaIII הגבלה ג'ל אלקטרופורזה (איור 3). התנאים PCR עשויה צריך להיות מותאם על ידי שינוי ריכוז הטמפרטורה ו / או מגנזיום או הארכת זמן הארכה. מספר תבניות להיראות בעייתי במיוחד ואת המיקום פריימר ייתכן שיהיה צורך להתאים או מנוונת primers ייתכן שיהיה צורך בשימוש.

הדור הבא רצף טכניקות הם המתפתחת במהירות כדי להשיג החלטה דומה bisulphite רצף גנומי, ו דור שלישי יחיד רצף מולקולה יש את הפוטנציאל כדי לאפשר ניתוח של ה-DNA הן מתילציה יסודי ללא צורך רצף bisulphite. עם זאת, זמינות spec נרחבתificity של טכניקות אלה נשארים זמן משם. רצף הגנומי Bisulphite הוא תקן הזהב בניתוח מתילציה הוא פרוטוקול חזקים. השיטה התקדמה עד לנקודה שבה הבעיות הנפוצות ואת המגבלות נפתרו ויישומים הרחיבו מ מנתח גן הפרט תפוקה גבוהה ניתוח הגנום כולו מתואר על ידי Clark et al. 2006 ^4. הנחיות והמלצות לפתרון בעיות נוספות המפורטות בטבלה 1. הוא הציע כי הגישה האופטימלית היא תחילה לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי ורק להציג את השינוי אם וכאשר מתעוררת בעיה.

טבלה 1. הנחיות לפתרון בעיות

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.