의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

Summary

DNA의 methylation 분석을위한 황금 표준 bisulphite 변환 DNA의 게놈 시퀀싱 수 있습니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 deamination을 bisulphite 5 - methylcytosine (5 멕)과 비교 사이 토신의 증가 감도 활용합니다. Unmethylated cytosines는 대상 게놈의 DNA의 PCR 증폭 후 methylated cytosines 구별하실 수 있습니다.

Abstract

Epigenetics는 DNA 시퀀스에 독립적으로 발생하는 유전자 기능에 물려 전할 수있는 변경 사항에 대해 설명합니다. epigenetic 유전자 조절의 분자 기초가 복잡하지만, 기본적으로 DNA 자체 또는 DNA 동료 단백질의 수정을 포함한다. 포유 동물 genomes에 DNA의 주된 epigenetic 수정 사이 토신 세포핵의 methylation (5 멕)입니다. DNA의 methylation은 어디서 유전자가 표현되어야 때 같은 유전자 표현 기계 지침을 제공합니다. 포유류의 DNA methylation에 대한 기본 대상 시퀀스는 5' - CPG - 3 'dinucleotides (그림 1)입니다. CPG dinucleotides가 균일 게놈 전반에 걸쳐 배포되지 않지만 반복 게놈 시퀀스와 일반적으로 유전자 발기인 (그림 1)과 관련된 CPG "섬"의 지역에 집중되어있다. 의 DNA methylation 패턴은 특정 조직 분화 동안에 변조된 초기 개발 년에 설립된 암 등 많은 질병 상태에 방해됩니다. U 위해nderstand 정확한 인간의 질병, 방법 효과적이고 재현성의 DNA를 methylation과 역할의 생물 학적 역할은 5 MeCs을 개인을 감지하고 계량해야합니다.

bisulphite 전환이 프로토콜은 DNA의 methylation 분석을위한 "금 표준"이며 단일 염기 해상도의 DNA methylation의 식별 및 부량을 용이하게합니다. 나트륨 bisulphite에서 사이 토신 deamination의 화학은 세 단계 (그림 2)를 포함합니다. (1) Sulphonation : 유라실 - bisulphite 유도체 (3 할) 알칼리 Desulphonation를 제공하는 결과 사이 토신 - bisulphite 유도체의 가수 분해 deamination : 사이 토신 (2) Hydrolic Deamination의 5-6 이중 결합에 bisulphite의 또한 sulphonate 제거 알칼리 처리에 의해 그룹 유라실를 제공합니다. Bisulphite는 우선적으로, 5 멕 반면, 단일 좌초된 DNA에 유라실하는 사이 토신 deaminates bisulphite - 중재 deamination에 내화물입니다. PCR 증폭되면 유라실이 증폭됩니다5 멕 잔류물이 methylated CpGs가 시퀀싱 중에 사이 토신 "C"대 thymine "T"물질의 존재에 의해 unmethylated CpGs 구분할 수 있도록, cytosines 그대로하면서 thymine으로.

bisulphite 변환에 의해 DNA 수정은 DNA의 methylation 분석의 여러 방법에 대해 이용할 수있는 잘 확립 프로토콜입니다. bisulphite 변환에 의해 5 멕의 검출 먼저 Frommer 외. ¹ 클락 외. ^2, DNA의 methylation에 대한 새로운 데이터의 대부분의 게놈 DNA 계정의 bisulphite 변환 기반으로 방법으로 증명 이후. 게시물 PCR 분석의 다른 방법은 특이성 및 필수 methylation의 해상도의 정도에 따라 활용 수 있습니다. 복제 및 시퀀싱 여전히 DNA 분자 전체 methylation에 대한 단일 염기 해상도를 줄 수있는 가장 쉽게 사용할 수 방법입니다.

Protocol

Bisulphite 변환 프로토콜

게놈 DNA의 2 μg의 전환에 대한 표준 프로토콜은 아래 설명되어 있습니다. 게놈 DNA (100 PG - 200 μg)의 작은 또는 큰 금액은 또한 성공적으로 치료 bisulphite 수 있습니다. 이러한 반응 조건은 거의 모든 대상의 DNA 시퀀스 ³ 전체 변환 (99.5-99.7 %)의 결과.

1. DNA 준비

37 ° C. 주 1 시간 18 μl의 총 볼륨에 bisulphite DNA를 용해 완충액 (2 μg t RNA, 280 μl / NG Proteinase K, 1 % SDS)와 게놈 DNA를 잠복기하여 샘플을 준비 : 이것은 달성하는 것이 중요합니다 특히 여전히 DNA와 연관된 단백질이있을 수 있습니다 임상 시료에서 분리된 DNA와 함께 최대한 bisulphite 변환.

2. DNA 변성

1. 최종 사용자에게 신선한 3M NaOH 2 μl를 추가로 20 μl의 볼륨에 변성이 μg의 DNA0.3M의 oncentration.
2. 37 샘플을 품어 ° 열 블록에서 2 분 90 ° C에서 부화 다음 물을 욕조에서 15 분 C,. 바로 5 분 얼음에 튜브를 삽입합니다.
3. 1만그램 10 s에 대한 ° C가 DNA가 튜브의 하단에되도록 4에서 튜브를 원심.

3. Bisulphite Deamination

Sulphonation 및 가수 분해 Deamination

1. 10 MM Quinol 및 포화 나트륨 metabisulphite 산도 5.0 (10 M NaOH의 464 μl와 7.6 g 나 ₂ S ₂ O _5, 물 15 ML까지 만들어진)의 신선한 솔루션을 준비합니다. 포화 나트륨 bisulphite의 솔루션은 최소 혼합 및 폭기와 함께 부드럽게 반전 시약 / H ₂ O 혼합에 의해 이루어진다. . 필요한 경우 metabisulphite 참고 전체 해산, 10 M NaOH로 pH를 조정 : 그것은 포화 용액이므로, 작은 덩어리는 아직 소화 되 다만 남아있을 수 있습니다.
2. 208 추가2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, 산도 5.0의 최종 농도 240 μl의 최종 볼륨에있는 포화 metabisulphite 및 변성 DNA (20 μl)에 10mM Quinol 12 μl의 μl. 부드럽게 방울의 모든 튜브의 하단에 있도록하기 위해 10 초에 대한 모든 시약 및 원심 분리기를 섞는다.
3. 미네랄 오일 200 μl로 샘플을 중첩. ° C 물 목욕에 4-16 시간 55에서 샘플을 품어. bisulphite 치료의 길이는 변환할 수있는 DNA의 수량과 품질에 따라 달라집니다. 품질 또는 저하의 DNA DNA가 4 시간에 부화 시간을 제한. 참고 : 그것 전에 부화에 포일의 튜브 가능 랩이 아니라면, 그 bisulphite 변환 산화를 방지하기 위해 어둠 속에서 이루어지는 것이 중요합니다 .
4. 적절한 배양 시간의 끝에서, 모든 액체는 튜브의 하단에되도록 microcentrifuge에 간단히 튜브를 돌린다.
5. bisulphite 처리 DNA를 복구조심스럽게 미네랄 오일 중 하나를 차지하지 않고, 튜브의 바닥에서 DNA 솔루션을 pipetting하여 오일 층 아래에​​서.

탈염

5. 탈염 컬럼을 통과하고 밀리 Q 물 (MQH ₂ O) 50 μl에 eluting하여 무료 bisulphite 이온을 제거합니다. 게놈 DNA의 수량과 품질에 대한 방법과 그것이 준비에 따라, 다른 탈염 열은 사용할 수 있습니다. 우리는 일상적으로 이러한 열이 SDS 전에 전환 DNA의 준비에 사용되는 제거 적합로 Promega 마법사가, 대열을 정비 청소 사용합니다.

알칼리 Desulphonation

6. bisulphite adduct는 desulphonation하여 유라실 링에서 제거됩니다. 0.3M의 최종 농도 신선한 3M NaOH의 5.5 μl를 추가하여 Desulphonate, 그때 37 ° C 15 분에 대한 샘플을 품어.
7. 간단히 원심 분리기와 t RNA (10 MG / ML) 1 μl를 추가합니다.
<리튬> 암모늄 아세테이트 33 μl (NH ₄ O AC), 3M의 최종 농도 산도 7.0의 추가에 의해 해결책을 중화.
8. 얼음 차가운 100 % 에탄올을 330 μl를 추가하여 에탄올 침전 DNA는 역전으로 잘 섞는다. 하루에 1 시간을위한 - 20μC에 둡니다. 4 15 분 14,000그램에서 원심 ° C. 뜨는 공기의 모든 흔적들이 ~ 20 분 시켰던 DNA를 건조 제거합니다.
9. 0.1 TE (10mM 트리스 - HCL, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0) 또는 H ₂ O에 50 μl / μg의 DNA 펠렛를 다시 중지 약 2 시간에 대한 상온에서 둡니다. DNA를 보장하기 위해 때때로 소용돌이 튜브는 빠른 원심 분리기 뒤에, 해산이다.
10. DNA의 수량과 품질에 따라 10~10년위한 -20 ° C에서 PCR 증폭, 또는 상점 즉시 사용하십시오.

4. PCR 증폭

프라이머 디자인

1. PCR bisulphite 변환 특정 primers의 효율적인 설계 crucia입니다완전히 변환된 DNA의 효율적인, 편견 증폭을 보장을 위해 내가 발생합니다. 다음 지침은 프라이머 디자인을 지원하는 데 사용됩니다.

프라이머 디자인 지침

Thermocyling

2. methylated 및 unmethylated DNA의 PCR 증폭을위한 비례 테스트하려면, 50:50 Methylated / Unmethylated 완전히 bisulphite 변환 제어 샘플을 사용하여 최적화된 PCR 반응 조건 (그림 3)에서 bisulphite 변환 특정 primers로 확대. 50:50 Methylated 들면 다음과 같습니다 Unmethylated 제어, 체외 SssI methylated DNA와 중 전체 게놈 증폭 (WGA) DNA 또는 전체 혈액 DNA에 사용합니다. 일부 유전자는 자연스럽게 혈액에 methylated 있으므로 이러한 경우에만 "Unmethylated"제어로 WGA DNA를 사용하는 것이 최선이다 것입 양해하여 주시기 바랍니다.
3. 100 & M의 PCR 증폭 반응 혼합물을 준비U; bisulphite 변환 게놈 DNA, 200 μm의 dNTP의, 1 μm의 primers, 1.5 MM MgCl _2, 50 MM KCl, 10mM 트리스 - HCL, pH를 8.3 및 0.15 μl DNA 형성 촉매 효소의 2 μl를 포함하는 내 aliquots.
4. 3 ° C에 걸쳐 뇌관의 예측 TM 10 튜브 - 온도 기울기 thermocycler에서는 그라데이션에서 실행 반응 + / 설정

5. methylated 및 unmethylated amplicons가 비례하여 증폭되었는지 테스트하려면, amplicon은 methylated DNA를 소화합니다 같은 DNA 형성 촉매 1 (TCGA)로 정보를 제한 효소, 함께 소화 수 있지만 제한 효소 사이트가있을 때 unmethylated DNA를 소화하지 않습니다 TTGA에 bisulphite 변환 후 변경. 소화의 정도는 아가로 오스 겔 전기 영동 (그림 3A)에 의해 시각하실 수 있습니다. 또는 SYBRGreen (1:1000 희석의 0.2 μl)은 PCR 반응에 추가하여 수methylation의 범위는 실시간 PCR thermocycler (그림 3B)에서 열 분해의 음모를 수행하여 평가하실 수 있습니다.
6. MgCl ₂ 농도 및 thermocycling 조건을 포함한 PCR 반응 혼합 PCR 효율을 증가 시키거나 methylated 및 unmethylated PCR 파편의 PCR 증폭 비례 수 있도록 조정해야 할 수도 있습니다.
7. PCR 조건 최적화되면, PCR 증폭은 bisulphite 변환 샘플을 수행할 수 있습니다주의 :.되면 TM은 온도 구배 PCR은 사용할 수 없습니다 필요 최적화되어 있습니다.

5. 대표 결과 :

bisulphite PCR 증폭 최적화의 예제는 그림 3에 표시됩니다. 최적의 PCR 증폭 조건은 비율과 편견없이 methylated 및 unmethylated amplicons을 증폭한다. 그림 3A 50 % methylated 및 unmethylated DNA의 혼합물에서 온도 기울기 PCR의 증폭 프로파일 아가로 오스 겔을 보여줍니다. 일E PCR의 amplicons는 methylated 소화하는 제한 효소, DNA 형성 촉매 1 (TCGA), (M) DNA를 취급되었지만 제한 효소 사이트가 TTGA에 bisulphite 변환에 의해 변경이므로 (U)의 DNA를 unmethylated 소화하지 않습니다. methylated 및 unmethylated DNA가 비례하여 증폭 경우 잘라 포경 PCR 제품의 동일한 금액을 예정입니다. 그것은 아닌 바이어스 증폭을위한 최적의 thermocyling 조건이 56.1에 있습니다이 젤에서 볼 수 ° C (T). bisulphite DNA의 완전한 변환은 또한 고전력 증폭기 III (CCGG)로 사이 토신 사이트 특정 효소로 소화하여 분석하실 수 있습니다. 변환이 실패하면 고전력 증폭기 III에만 제한 사이트가 유지되므로, 소화합니다. 변환이 완료되면 제한 사이트는 TCGG 또는 DNA의 methylation 상태에 따라 TTGG로 변환됩니다. 완벽한 bisulphite DNA 변환은 그림 3A (H)에서 볼 수 있습니다.

그림 3B는 실시간 분리 계획을 보여줍니다다른 분자가 분열시키다되는 온도에 따라 어떤 증폭 바이어스가 있는지 확인하는 도구로도 사용할 수 있습니다. 이 그림에서 그것은 PCR이 82.1μC에서 떼어 놓다 완전히 methylated 및 unmethylated DNA의 제어 증폭에 비해 50% methylated 및 unmethylated DNA의 조합에서 비례 methylated 증폭 (M)와 unmethylated (U) DNA 것을 볼 수있다 각각 78.9μC.

thermocyling 및 반응 조건의 최적화 후 Bisulphite 취급 샘플은 단일 또는 세미 중첩된 PCR 반응 중 하나의 스트랜드 구체적이고 bisulphite 특정 primers로 증폭하실 수 있습니다. 그 결과 PCR 파편은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 시각 및 직접 (그림 4A) 또는 복제 및 시퀀싱에 의해 합성 수 있습니다. 복제 및 개별 분자의 methylation 상태를 배열은의 이질을 시각화하기 위해 bisulphite지도 (그림 4B)에서 tabulated 수 후methylation.

높은 처리량 정량 methylation 분석은 Sequenom의 EpiTYPER 방법으로 이용되는 등의 기술을 사용하여 preformed 수 있습니다. 이 방법을 사용 bisulphite 변환 DNA가 PCR primers 특정 bisulphite로 증폭 proprietry 절단 과정옵니다. 그 결과 조각은 methylated cytosines (그림 5A)의 존재에 따라 특정 스펙트럼과 함께 든 - TOF 질량 분광법에 의해 quantitated 있습니다. 예제에서 methylation 비율의 요약은 다음 경구 (그림 5B) 또는 methylation의 줄거리 (그림 5C)의 형태로 추정 수 있습니다.

그림 1. 정상 세포에서 발기인 - 관련 CPG 섬이 주로 Methylated CPG 배선. unmethylated 아르 (회색) 유전자 기관 내에서 CPG 사이트 및 스파스 (적색) 일반적으로 methylated 반면. 오른쪽 패널은 분자 구조체를 확장개별 CPG 사이트에서 DNA의 ure하고 사이 토신의 탄소 5 CH3 분자와 methylation을 보여줍니다.

그림 2. . 변성, bisulphite 변환, PCR 증폭 및 분석, 화학 변환 도식 분석의 DNA methylation의이 그림과 같이 네 가지 주요 단계를 포함합니다. 오른쪽 패널에서, bisulphite 변환하는 동안 발생 사이 토신 분자에 대한 수정이 그려져 있습니다.

그림 3. PCR 증폭. A.의 Optimisation 50% methylated 및 unmethylated DNA의 혼합물에서 온도 기울기 PCR의 증폭 프로필로 아가로 오스 겔 전기 영동. 조각은 각각 methylated DNA와 비 bisulphite 변환 DNA를 소화 Taq1 (T) 또는 HpaIII (H) 중 하나와 함께 소화했습니다. B. 열 분리 곡선 분석 equa를 보여줍니다methylated 및 unmethylated DNA (빨간색 선 50분의 50 믹스)의 내 비중이 제어 완전히 methylated의 증폭 (핑크 라인, M)와 ° C와 78.9 ° C 각각 82.1에서 떼어 놓다 unmethylated DNA (녹색 라인, U)에 비해.

그림 4. 직접 시퀀싱의 예제와 bisulphite지도. A. 노란색으로 강조 CPG 사이트 세 가지 다른 세포 라인에서 시퀀스 추적. 세포 라인 Y 및 Z는 G / A 신호를 중복하여 본으로 methylation의 변화도 보여주 반면에 세포 라인 X는 세 CPG 사이트에서 100 % methylation을 표시합니다. 각 클론의 직접 시퀀싱에 의해 결정된 개별 CPG 사이트에 methylation의 밀도 (붉은 점)를 보여주는 B. 대표 bisulphite지도.

그림 5. Sequenom. A.를 사용하여 높은 처리량의 DNA methylation 분석 Sequenom epiTYPER 기술을 이용하여 스펙트럼 볼 수 있습니다. 의 DNA 조각의 DNA methylation 선물의 금액에 따라, 특정 스펙트럼을 표시합니다. 네 가지 세포 라인 각 CPG 사이트의 DNA methylation의 비율의 B. 경구은 요약. C.의 Methylation의 줄거리 요약 Sequenom의 풍자시에서 파생.

Discussion

bisulphite 변환 DNA의 게놈 시퀀싱에 의해 DNA의 methylation 분석 단일 염기 해상도의 DNA methylation의 식별 및 부량을 용이하게 잘 설립하고 다양한 방법입니다. 그러나, bisulphite 전환 및 후속 분석은 DNA가 완전히 모든 unmethylated 사이 토신이 유라실에 deaminated되고 오직 methylated cytosines이 취소 반응 나머지로 변환되어 그 전제에 의존합니다. 변환이 완료되지 않은 경우 변하지 않은 unmethylated cytosines가 잘못 methylated cytosines로 해석될 수 있기 때문에, 문제가 분석 발생할 수 있습니다. Bisulphite 변환은 변환의 비율을 최대화하기 위해 여러 단계에서 최적화할 수 있습니다. DNA가 완전히 변환하기 위해서는 사이 토신 잔류물이 bisulphite 이온에 노출되는 있으므로 먼저 좌초 하나 있어야합니다. 첫 번째 단계는, DNA의 변성은 중요하며 DNA가 완전히 변성되지 않은 경우 불완전 변환의 원천이 될 수 있습니다. 보장하기DNA가 완전히 변성입니다 그것은 모든 관련 단백질의 제거, 적절한 소금 농도, 배양 온도 및 시간을 포함하여 반응 매개 변수는 단일 좌초 형태의 DNA를 유지하기 위해 적합한 것이 중요합니다. 신선한 3M NaOH를 사용하고 적절한 배양 시간을 허용하는 것이 중요합니다. DNA가 변성에 저항하는 경우, 30 분 배양 시간을 연장 또는 사전 변성에 DNA를 fragmenting을 포함하여 프로토콜에 몇 가지 수정의 DNA 변성을 촉진 수도 있습니다. 또한, 단일 좌초된 DNA (ssDNA)는 bisulphite 변환 반응 중 좌초된 DNA (dsDNA)를 두 배로 다시 어닐링 수 있습니다. 중 정기적으로 또는 지속적으로 bisulphite 반응 동안 높은 온도 (90-95 ° C)에서 반응을 수행하면 ssDNA의 유지를 도움하실 수 있습니다. 그러나, DNA 저하가 크게 이러한 높은 온도에서 가속 것을 인식하는 것이 중요합니다. 각종 시약도 일의 다시 어닐링을 혼란에 추가할 수 있습니다이러한 요소로 전자의 DNA 가닥.

DNA와 품질의 농도 또한 bisulphite 반응과 궁극적인 PCR 수율의 효율성에 영향을 줄 수 있습니다. DNA의 저하는 bisulphite 변환 프로토콜의 제한 사항입니다. DNA의 화학 치료는 다양한 스트랜드 ssDNA에 휴식과 높은 bisulphite 농도, 긴 배양 시간이 DNA 저하를 가속 수 있습니다 포함한 전체 bisulphite 변환에 필요한 가혹한 조건의 일부를 소개합니다. 프로토콜 수정이 소개하는 경우에 설명된 표준 반응 조건 하에서 DNA의 저하는 다음과 같은 FFPE 샘플과 같은 품질의 저하거나 DNA 템플릿에 대한 이러한 전환 내화물 아르 시퀀스에 대해서는, 그러나 DNA 저하 일반적인 문제가되지 않습니다 상당한 제한 될 수 있습니다.

포르말린 고정, 파라핀 임베디드 (FFPE)와 타락한 DNA 샘플을 효과적으로이 프로토콜을 사용하여 변환하고 증폭 bisulphite 수 있습니다그러나 DNA는 더 이상 저하되지 않도록 수정은 좋습니다. 같은 t RNA와 같은 캐리어 RNA의 사용을 권장합니다. DNA 농도는 (<200 NG) 낮은 경우 또한 글리코겐은 항공사로 추가할 수 있습니다. FFPE 조직에서 분리된 DNA가 이미 조각하고 더 조각이 deamination 동안 이루어지는 때문에,주의가 더욱 저하를 최소화하기 위해 이동해야합니다. 조각의 DNA가 변성되기 전에 더 이상하지 마십시오 4 시간 bisulphite 반응에 대한 배양 시간을 제한하고 있습니다. 디자인 조각난 DNA로 인해 300 BP보다 큰 amplicons 없습니다.

unmethylated cytosines의 bisulphite 변환 DNA 템플릿의 복잡성을 줄일 PCR 증폭에 영향을 미칠 수있는 다른 요인. 섹션 4.1 증가 뇌관의 길이와 중첩된 PCR에 명시된 다음 뇌관 디자인 프로토콜은 모든 특이성과 PCR 수율을 향상하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마지막으로, DNA 템플릿 이후 bisulph 중 변경될 수 있습니다감지 변환, 증폭 바이어스는 우려 수 있습니다. methylated 및 unmethylated 템플릿의 비례 PCR 증폭이 같은 프로토콜에 명시된 바와 같이 제어 50분의 50 M / U DNA 믹스로 체크되어 있는지 확인, 그림 3을 참조하십시오. 또한 전용 변환 템플릿의 증폭을 보장하는 것은 HpaIII 제한 효소와 겔 전기 영동 (그림 3)를 사용하여 발생합니다. PCR 조건은 온도 및 / 또는 마그네슘 농도를 변화하거나 확장 시간을 길어으로 최적화할 필요가 있습니다. 일부 템플릿은 특히 문제가 될 것처럼 및 뇌관의 위치가 조정해야하거나 primers 타락한 수 있습니다 사용해야 할 수도 있습니다.

차세대 시퀀싱 기술이 빠르게 게놈 시퀀싱을 bisulphite과 유사한 해상도를 달성하기 위해 진화하고 있으며, 3 세대 단일 분자 배열이 bisulphite 시퀀싱을위한 필요없이 기본 DNA와 methylation 모두의 분석을 위해 수 있도록 가능성이 있습니다. 그러나, 광범위한 가용성 및 사양이러한 기술의 ificity 거리에 시간이 좀 남아 있습니다. Bisulphite 게놈의 순서는 methylation 분석의 황금 표준이며 강력한 프로토콜입니다. 방법은 일반적인 문제와 한계가 해결되었습니다 지점으로 진행되고 있으며 응용 프로그램은 높은 처리량 및 클라크 외에 기술된 전체 게놈 분석 개별 유전자 분석에서 확대했습니다. 2006 ^4. 문제 해결 지침 및 추가 권장 사항은 표 1에 요약되어 있습니다. 이것은 최적의 접근 방식이 처음 표준 프로토콜을 따라하는 경우에만 수정 언제 문제가 발생을 소개하는 것이 좋습니다.

표 1. 해결 가이드

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.