DNA-metylering:, dock Ändring och analys

Summary

Guldmyntfoten för DNA-metylering analys är genomisk sekvensering av, dock omvandlas DNA. Denna metod tar fördel av den ökade känslighet cytosin jämfört med 5-methylcytosine (5-MEC) till, dock deaminering under sura förhållanden. Unmethylated cytosines kan skiljas från metylerad cytosines efter PCR-amplifiering av målet arvsmassans DNA.

Abstract

Epigenetik beskriver ärftliga förändringar i genen funktion som inträffar oberoende av varandra till den DNA-sekvens. Den molekylära grunden för epigenetisk genreglering är komplex, men i grunden handlar om modifieringar av DNA i sig eller de proteiner som DNA medarbetare. Den dominerande epigenetisk modifiering av DNA i genomer är metylering av cytosin nukleotider (5-MEC). DNA-metylering ger instruktion till genuttryck maskiner om var och när genen skall uttryckas. Den primära målsekvens för DNA-metylering i däggdjur är 5'-CpG-3 "dinucleotides (figur 1). CpG dinucleotides är inte jämnt fördelade över hela genomet, men är koncentrerad till regioner av upprepade genomiska sekvenser och CpG "öar" som vanligen förknippas med gen projektansvariga (Figur 1). DNA-metylering mönster etableras tidigt i utvecklingen, modulerade under vävnad specifika differentiering och störs i många sjukdomstillstånd inklusive cancer. För att understand den biologiska roll DNA-metylering och dess roll i mänskliga sjukdomar, exakt, effektiv och reproducerbara metoder krävs för att detektera och kvantifiera individuella 5-mecs.

Detta protokoll för, dock omvandling är den "gyllene standarden" för DNA-metylering analys och underlättar identifiering och kvantifiering av DNA-metylering vid enstaka nukleotid upplösning. Kemi cytosin deaminering av natriumbisulfit omfattar tre steg (figur 2). (1) sulfonering: Tillägget av, dock till 5-6 dubbelbindningen av cytosin (2) Hydrolic deaminering: hydrolytisk deaminering av den resulterande cytosin-, dock derivat för att ge en uracil-, dock derivat (3) Alkali Desulphonation: Borttagning av långkedjiga grupp genom en alkali, att ge uracil. , Dock deaminates företrädesvis cytosin till uracil i enstaka DNA, medan 5-Mec är refraktära mot, dock-medierad deaminering. Efter PCR-amplifiering är uracil förstärkssom tymin, medan 5-Mec rester kvar som cytosines, så metylerade CpGs ska skiljas från unmethylated CpGs genom närvaron av en cytosin "C" kontra tymin "T" rest under sekvensering.

DNA-modifiering av, dock omvandlingen är ett väletablerat protokoll som kan utnyttjas för många metoder för DNA-metylering analys. Sedan upptäckten av 5-Mec med, dock omvandlingen först bevisas av Frommer et al. ¹ och Clark et al. ^2, metoder baserade runt, dock omvandlingen av arvsmassans DNA står för merparten av nya uppgifter om DNA-metylering. Olika metoder av post PCR-analys kan användas, beroende på graden av specificitet och lösning av metylering krävs. Kloning och sekvensering är fortfarande den mest lättillgängliga metod som kan ge enda nukleotid upplösning för metylering i DNA-molekylen.

Protocol

, Dock konvertering protokoll

Ett standardprotokoll för omvandling av 2 mikrogram arvsmassans DNA beskrivs nedan. Mindre eller större mängder av arvsmassans DNA (100 PG-200 mikrogram) kan också, dock behandlas framgångsrikt. Dessa reaktioner villkor resulterar i fullständig omvandling (99,5-99,7%) av nästan varje target DNA-sekvens ^3.

1. DNA-preparation

Förbered proven genom att inkubera genomiska DNA med, dock DNA lyseringsbuffert (2 mikrogram t-RNA, 280 ng / l proteinas K, 1% SDS) i en total volym på 18 l för 1 timme vid 37 ° C. OBS: Detta är viktigt för att uppnå maximal, dock konvertering, speciellt med DNA isolerat från kliniska prover där det fortfarande kan vara protein i samband med DNA.

2. DNA Denaturering

1. Denaturera 2 mikrogram DNA i en volym på 20 l genom att tillsätta 2 ìl av nyberedd 3M NaOH till en slutlig Concentration av 0,3 M.
2. Inkubera proverna vid 37 ° C i 15 minuter i ett vattenbad, följt av inkubering vid 90 ° C i 2 min i ett värmeblock. Placera omedelbart rören på is i 5 min.
3. Centrifugera rören vid 4 ° C under 10 s vid 10000 g, för att säkerställa att DNA är i botten av röret.

3. , Dock deaminering

Sulfonering & hydrolytiska deaminering

1. Bered en färsk lösning på 10 mm Quinol och mättade natriummetabisulfit pH 5,0 (7,6 g Na ₂ S ₂ O ₅ med 464 l av 10 M NaOH, som består till 15 ml med vatten). Lösningen av mättade natriumbisulfit uppnås genom att försiktigt vända reagens / H ₂ O blandningen med minst blandning och luftning. Om nödvändigt, justera pH-värdet med 10 M NaOH, för full upplösning av metabisulfit. OBS: Eftersom det är en mättad lösning, kan små klumpar fortfarande olösta.
2. Lägg till 208ìl av mättade metabisulfit och 12 l 10 mM Quinol till denaturerade DNA (20 l), i en slutlig volym på 240 l till en slutlig koncentration av 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5,0. Blanda försiktigt alla reagenser och centrifugera i 10 sekunder för att se alla dropparna i botten av röret.
3. Overlay proverna med 200 l av mineralolja. Inkubera proverna vid 55 ° C i ett vattenbad, för 4-16 timmar. Längd, dock behandling är beroende av kvantitet och kvalitet av DNA som ska konverteras. För DNA av dålig kvalitet eller försämrad DNA begränsa inkubationstiden till 4 timmar. OBS: Det är viktigt att att, dock omvandlingen sker i mörker för att undvika oxidering, så om det inte är möjligt linda rören i folie innan inkubation .
4. I slutet av lämplig inkubationstid snurra rören kortfattat i en mikrocentrifug att se all vätska är i botten av röret.
5. Återvinn, dock behandlade DNAfrån under oljan lager genom att försiktigt pipettera ut DNA-lösning från botten av röret, utan att ta upp några av mineralolja.

Avsaltning

5. Ta bort alla fria, dock joner som passerar genom en avsaltning kolumn och eluerande i 50 ìl av Milli-Q Water (MQH ₂ O). Beroende på kvantitet och kvalitet av arvsmassans DNA och hur man är beredd, kan olika avsaltning kolumner användas. Vi använder rutinmässigt Promega guiden Rensa upp kolumner, eftersom dessa kolumner är lämpliga att ta bort SDS som används vid beredning av DNA före konvertering.

Alkalimetaller Desulphonation

6. Den, dock addukt tas bort från uracil ringen av desulphonation. Desulphonate genom att tillsätta 5,5 l nyberedd 3M NaOH till en slutlig koncentration av 0,3 M, sedan inkubera proverna vid 37 ° C i 15 min.
7. Centrifugera kort och tillsätt 1 l av t-RNA (10 mg / ml).
<li> Neutralisera lösningen genom tillsats av 33 l ammoniumacetat (NH ₄ O AC), pH 7,0 till en slutlig koncentration av 3M.
8. Etanol-fällningen DNA genom att tillsätta 330 l av iskall 100% etanol, blanda väl genom inversion. Lämna at-20μC för 1 timme till natten. Centrifugera på 14.000 gi 15 minuter vid 4 ° C. Ta bort alla spår av supernatanten och lufttorka den fälls DNA för ~ 20 min.
9. Återuppslamma DNA pelleten i 50 ml / mikrogram 0,1 TE (10 mM Tris-HCl, 0.1mm EDTA, pH 8,0) eller H ₂ O. Lämna i rumstemperatur i cirka 2 timmar. Ibland Vortexa rören för att säkerställa att DNA är upplöst, följt av en snabb centrifug.
10. Använd omedelbart för PCR-amplifiering, eller förvara vid -20 ° C i 1-10 år beroende på kvantitet och kvalitet av DNA.

4. PCR-amplifiering

Primer Design

1. Effektiv design av PCR, dock omvandlingen-specifika primers är crucial för att se till att effektiva, objektiva förstärkning av helt konverterade DNA uppstår. Följande riktlinjer används för att underlätta primer design.

Primer Design Riktlinjer

Thermocyling

2. För att testa för proportionell PCR-amplifiering av metylerade och unmethylated DNA, använda en 50:50 Methylated / Unmethylated fullt, dock omvandlas kontrollprov och förstärker med, dock omvandlingen-specifika primers under optimerat PCR-reaktionen förhållanden (Figur 3). För 50:50 Methylated: Unmethylated kontrollerna använder in vitro SSSI metylerade DNA och antingen hela genomet amplifieras (WGA) DNA eller helblod DNA. Observera att vissa gener naturligtvis kommer att metyleras i blod och därmed i dessa fall är det bäst att bara använda WGA DNA som "Unmethylated" kontroll.
3. Bered PCR-blandningar amplifieringsreaktionen i 100 & mu; l alikvoter innehållande 2 ìl, dock omvandlas genomiska DNA, 200 mikroM dNTP-talet, 1 mikroM grundfärg, 1,5 mM MgCl _2, 50 mm KCl, 10mm Tris-HCL, pH 8,3 och 0,15 l Taq-polymeras.
4. I en temperaturgradient termocykler satte flykt reaktion i en lutning + / - 3 ° C från den förutsagda Tm av primer över 10 tuber

5. För att testa att metylerade och unmethylated amplicons ha förstärkts i förhållande, kan amplicon brytas ned med en informativ restriktionsenzymanalys som Taq-1 (TCGA), som kommer att smälta metylerade DNA men kommer inte att smälta unmethylated DNA när begränsningen enzymet webbplatsen ändras efter, dock konverteringen till TTGA. Omfattningen av matsmältningen kan visualiseras med agarosgelelektrofores (figur 3a). Alternativt kan SYBRGreen (0,2 ìl 1:1000 utspädning) läggas till i PCR-reaktionen ochomfattningen av metylering kan bedömas genom att utföra värme dissociation tomter i en realtids-PCR-termocykler (Figur 3B).
6. PCR-reaktionsblandningen inklusive MgCl ₂ koncentration och termocykling villkor kan behöva justeras för att öka PCR effektivitet eller för att säkerställa proportionellt PCR-amplifiering av metylerade och unmethylated PCR-fragment.
7. När PCR-förhållanden är optimerade, kan PCR-amplifiering utföras på, dock omvandlas prover. OBS: När TM är optimerat en temperaturgradient PCR inte behöver användas.

5. Representativa resultat:

Ett exempel, dock PCR-amplifiering optimering visas i figur 3. Optimala PCR-amplifiering villkor bör förstärka metylerade och unmethylated amplicons i proportion och utan fördomar. Figur 3A visar en agarosgel med en temperaturgradient PCR-amplifiering profil från en blandning av 50% metylerade och unmethylated DNA. The PCR amplicons har behandlats med en begränsning enzym, Taq-1 (TCGA), som kommer att smälta denaturerad (M) DNA men kommer inte att smälta unmethylated (U) DNA som restriktionsenzymanalys webbplatsen ändras av, dock omvandling till TTGA. En lika stor mängd klipp och oklippt PCR-produkten förväntas om metylerade och unmethylated DNA förstärks i proportion. Det kan ses på denna gel som den optimala thermocyling för icke-partiskhet förstärkning är på 56,1 ° C (T). Fullständig omvandling av den, dock DNA kan också analyseras genom rötning med cytosin-platsspecifik enzym som Hpa III (CCGG). Hpa III endast kommer att smälta om omräkningen har misslyckats, eftersom begränsningen webbplatsen kommer att finnas kvar. Om konverteringen är klar begränsning webbplats kommer att konverteras till TCGG eller TTGG beroende på metylering tillståndet i DNA. Komplett, dock DNA-konvertering kan ses i figur 3a (H).

Figur 3B visar en riktig intrig tid dissociation somkan också användas som ett verktyg för att avgöra om det finns någon förstärkning partiskhet baserat på temperatur vid vilken olika molekyler kommer dissociera. I denna figur kan man se att PCR har förstärkt denaturerad (M) och unmethylated (U) DNA i proportion från en blandning av 50% metylerade och unmethylated DNA jämfört med kontrollgruppen förstärkningen av fullständigt metylerade och unmethylated DNA som avstånd till 82.1μC och 78.9μC respektive.

Efter optimering av thermocyling och villkor reaktion, dock kan behandlas prov amplifieras med del specifika och, dock specifika primers i antingen en enda eller delvis kapslade PCR-reaktionen. Den resulterande PCR-fragment kan visualiseras genom agarosgelelektrofores och sekvenseras antingen direkt (Figur 4A) eller genom kloning och sekvensering. Efter kloning och sekvensering metylering tillståndet i enskilda molekyler kan tabellform, i ett, dock karta (Figur 4B), att visualisera heterogenitetmetylering.

Hög genomströmning kvantitativ metylering analys kan förformade använda teknologi som den som används av Sequenom EpiTYPER metoden. Med denna metod är, dock omvandlas DNA amplifieras med, dock specifika PCR-primers och följs av en proprietry klyvning process. Den resulterande fragment kvantifieras genom MALDI-TOF masspektrometri med de specifika spektrum beroende av förekomsten av metylerade cytosines (Figur 5A). En sammanfattning av metylering nyckeltal i provet kan sedan extrapoleras i form av en Epigram (Figur 5B) eller metylering tomt (Figur 5C).

Figur 1. Metyleras CpG schematiska. I normala celler är promotor-associerade CpG öarna övervägande unmethylated (grå) medan CpG platser inom genen kroppar är gles och allmänt metylerat (röd). Panelen till höger expanderar den molekylära structure av DNA på individuell CpG plats och visar metylering med en CH3 molekyl med kol 5 av cytosin.

Figur 2. . Kemisk omvandling schematisk analys av DNA-metylering består av fyra huvudsakliga steg som visas, denaturering,, dock konvertering, PCR-amplifiering och analys. I den högra panelen, är ändringar av cytosin molekyl som uppstår under, dock konverteringen avbildas.

Figur 3. Optimering av PCR-amplifiering. A. Agarosgelelektrofores med en temperaturgradient PCR-amplifiering profil från en blandning av 50% metylerade och unmethylated DNA. Fragment har smält med antingen Taq1 (T) eller HpaIII (H) som smälta metylerade DNA och icke, dock omvandlas DNA respektive. B. Värme dissociation kurvan Analysen visar en ekvationl Andelen metylerade och unmethylated DNA (röd linje 50/50 mix) jämfört med kontrollgruppen förstärkningen av fullständigt metylerade (rosa linje, M) och unmethylated DNA (grön linje, U), som tar avstånd vid 82,1 ° C och 78,9 ° C respektive.

Figur 4. Exempel på direkt sekvensering och en, dock karta. A. Sekvens spår från tre olika cellinjer med CpG platser markerade i gult. Cellinje X visar 100% metylering vid alla tre CpG platser medan cellinjer Y och Z visar varierande grad av metylering som ses av överlappande G / A-signaler. B. representant, dock karta som visar tätheten av metylering (röda punkter) vid enskilda CpG platser, som bestäms genom direkt sekvensering av enskilda kloner.

Figur 5. Hög genomströmning DNA-metylering analys med Sequenom. A. Spectrum visa med Sequenom epiTYPER teknik. DNA-fragment visa specifika spektra beroende på mängden DNA-metylering närvarande. B. Epigram sammanställning av andelen DNA-metylering vid varje CpG plats för fyra olika cellinjer. C. Metylering Summarisk täppa härrör från Sequenom epigram.

Discussion

DNA-metylering analys av genomisk sekvensering av, dock omvandlas DNA är en väletablerad och mångsidig metod som underlättar identifiering och kvantifiering av DNA-metylering vid enstaka nukleotid upplösning. Baseras dock, dock konvertering och efterföljande analys på förutsättningen att DNA helt har omvandlats med varje unmethylated cytosin är deaminerade till uracil och bara metylerat cytosines kvar un-reaktivt. Om konvertering är ofullständig, kan problem uppstå med analysen eftersom oomvända unmethylated cytosines kan felaktigt tolkas som denaturerad cytosines. , Dock konvertering kan optimeras i olika skeden för att maximera andelen konvertering. För DNA för att vara helt omvandlas det först måste enkelsträngad så att cytosin rester utsätts för, dock joner. Det första steget, DNA denaturering, är kritisk och kan vara en källa till ofullständig omvandling om DNA är inte helt denaturerad. För att säkerställaatt DNA är fullständigt denaturerad är det viktigt att reaktionen parametrar, bland annat borttagande av alla tillhörande protein, lämplig salthalt, inkubation temperatur och tid är lämpliga för att upprätthålla DNA i enkelsträngad konformation. Det är viktigt att använda färska 3M NaOH och att adekvat inkubationstid. Om DNA är motstånd denaturering kan vissa ändringar av protokollet, inklusive att förlänga inkubationstiden till 30 minuter eller fragmentera DNA innan denaturering underlätta DNA denaturering. Dessutom kan enstaka DNA (ssDNA) åter glödga till dubbelsträngat DNA (dsDNA) under, dock konverteringen reaktion. Genomförande av reaktionen vid en högre temperatur (90-95 ° C) antingen regelbundet eller kontinuerligt under, dock reaktionen kan hjälpa underhåll av ssDNA. Det är dock viktigt att vara medveten om att DNA-nedbrytningen är kraftigt snabbare vid dessa högre temperaturer. Olika reagenser kan också läggas att störa nytt glödgning av the DNA-strängar, som urea.

Koncentrationen av DNA och dess kvalitet kan också påverka effektivitet, dock reaktionen och slutliga PCR avkastning. DNA nedbrytning är en begränsning av det, dock omvandlingen protokollet. Den kemiska behandlingen av DNA introducerar olika strängbrott i ssDNA och några av de hårda villkor som krävs för fullständig, dock omvandlingen inklusive hög, dock koncentration, långa inkubationstiderna kan påskynda DNA nedbrytning. Enligt standarden beskrivna reaktionen förhållanden, är DNA nedbrytning inte är ett vanligt problem men om protokoll ändringar införs, till exempel för sekvenser som är terapiresistenta konvertering, för DNA-mallar som bryts ned eller av dålig kvalitet som FFPE prover, sedan DNA-degradering kan bli en betydande begränsning.

Formalin fast, paraffininbäddade (FFPE) och nedbrutna prover DNA kan på ett effektivt sätt, dock omvandlas och förstärks med hjälp av detta protokollMen förändringar för att säkerställa att DNA är inte vidare försämras rekommenderas. Användningen av en transportör RNA som t RNA rekommenderas. Också glykogen kan läggas till som en bärare när DNA-koncentrationen är låg (<200 ng). Eftersom DNA isolerat från FFPE vävnader är redan splittrad och ytterligare fragmentering sker under deaminering måste försiktighet vidtas för att minimera ytterligare nedbrytning. Inte splittrar DNA ytterligare innan denaturering och begränsa inkubationstiden för, dock reaktionen på 4 timmar. Design amplicons inte större än 300 BP på grund av fragmenterad DNA.

En annan faktor som kan påverka PCR-amplifiering att, dock omvandlingen av unmethylated cytosines reducerar komplexiteten i DNA-mallen. Följande primer design protokoll som beskrivs i avsnitt 4.1, ökad primer längd och nästlade PCR kan alla bidra till att öka specificitet och PCR avkastning.

Slutligen är då DNA-mallen ändras under bisulphite konvertering, förstärkning bias kan vara ett bekymmer. Se till att proportionellt PCR-amplifiering av metylerade och unmethylated mallar är markerad med en kontroll 50/50 M / U DNA-mix, som beskrivs i protokollet, se figur 3. Se också till att förstärkningen av bara konverterade mallar sker med hjälp av HpaIII restriktionsenzymanalys och gelelektrofores (Figur 3). PCR förhållanden kan behöva optimeras genom att variera temperatur och / eller magnesium koncentration eller förlänga förlängning tid. Vissa mallar verkar vara särskilt problematiskt och primer ställning kan behöva justeras eller degenererade primers kan behöva användas.

Nästa generations sekvensering tekniker utvecklas snabbt för att uppnå en liknande resolution till, dock genomiska sekvensering, och tredje generationen enda molekyl sekvensering har potential att möjliggöra analyser av både primär DNA och metylering utan behov av, dock sekvensering. Men omfattande tillgänglighet och specificity av dessa tekniker återstår en tid bort. , Dock genomisk sekvensering är den högsta standarden inom metylering analys och är en robust protokoll. Metoden har utvecklats till den punkt där de gemensamma problem och begränsningar har lösts och ansökningarna har expanderat från enskilda gen analyser för hög genomströmning och hela genomet analys beskrivs av Clark et al. 2006 ^4. Felsökning riktlinjer och ytterligare rekommendationer som beskrivs i tabell 1. Det föreslås att den optimala strategin är att inledningsvis följa standardprotokoll och endast införa ändringen, om och när ett problem uppstår.

Tabell 1. Felsökning Riktlinjer

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.