DNA metylering: Bisulphite Modifikasjon og analyse

Summary

Gullstandarden for DNA metylering analyse er genomisk sekvensering av bisulphite konvertert DNA. Denne metoden tar fordel av den økte følsomheten av cytosin, sammenlignet med 5-methylcytosine (5-MEC) til bisulphite deaminering henhold sure forhold. Unmethylated cytosines kan skilles fra denaturert cytosines etter PCR forsterkning av målet genomisk DNA.

Abstract

Epigenetikk beskriver arvelige endringer i gen-funksjon som oppstår uavhengig av DNA-sekvensen. Den molekylære grunnlaget for epigenetic genregulering er komplisert, men i hovedsak innebærer endringer av DNA selv eller proteiner som DNA kollegaer. Den dominerende epigenetic modifikasjon av DNA i mammalske genomer er metylering av cytosin nukleotider (5-MEC). DNA metylering gir instruksjon til genuttrykk maskiner om hvor og når genet skal uttrykkes. Den primære mål sekvens for DNA metylering i pattedyr er 5'-CpG-3 'dinucleotides (Figur 1). CpG dinucleotides er ikke jevnt fordelt i hele genomet, men er konsentrert i regioner av repetitive genomisk sekvenser og CpG "øyer" vanligvis forbindes med genet prosjektpartnere (figur 1). DNA metylering mønstre etableres tidlig i utviklingen, moduleres under vev spesifikke differensiering og forstyrret i mange sykdommer, inkludert kreft. Til understand den biologiske rolle DNA metylering og dens rolle i menneskelig sykdom, presis, effektiv og reproduserbare metoder er nødvendig for å oppdage og kvantifisere individuell 5-MeCs.

Denne protokollen for bisulphite konvertering er "gullstandarden" for DNA metylering analyse og enklere identifisering og kvantifisering av DNA metylering ved singel nukleotid oppløsning. Kjemien til cytosin deaminering av natrium bisulphite involverer tre trinn (figur 2). (1) sulfonert: Tilsetning av bisulphite til 5-6 doble bindingen av cytosin (2) hydrolic deaminering: hydrolytisk deaminering av den resulterende cytosin-bisulphite derivatet å gi en uracil-bisulphite derivat (3) Alkali Desulphonation: Fjerning av sulphonate gruppe ved en lutbehandling å gi uracil. Bisulphite deaminates fortrinnsvis cytosin til uracil i enkeltrom strandet DNA, mens 5-MEC er refraktær til bisulphite-mediert deaminering. Ved PCR forsterkning, er uracil forsterkessom tymin mens 5-MEC rester forbli som cytosines, slik denaturert CpGs skal skilles fra unmethylated CpGs ved tilstedeværelsen av en cytosin "C" versus tymin "T" rester under sekvensering.

DNA modifisering av bisulphite konvertering er en veletablert protokoll som kan utnyttes for mange metoder for DNA metylering analyse. Siden påvisning av 5-MEC ved bisulphite konvertering ble først demonstrert av Frommer et al. ¹ og Clark et al. ^2, metoder basert rundt bisulphite konvertering av genomisk DNA står for majoriteten av nye data om DNA metylering. Ulike metoder for post PCR-analyse kan benyttes, avhengig av graden av spesifisitet og oppløsning av metylering nødvendig. Kloning og sekvensering er fortsatt den mest lett tilgjengelig metode som kan gi single nukleotid oppløsning for metylering over DNA-molekylet.

Protocol

Bisulphite konvertering protokoll

En standard protokoll for konvertering av to mikrogram av genomisk DNA er beskrevet nedenfor. Mindre eller større mengder av genomisk DNA (100 pg-200 mikrogram) kan også være bisulphite behandles riktig. Disse reaksjonen forholdene resultere i fullstendig konvertering (99,5 til 99,7%) av nesten alle target DNA sekvens ^3.

1. DNA Forberedelse

Forbered prøver med inkubasjon genomisk DNA med bisulphite DNA Lysis Buffer (2 mikrogram t-RNA, 280 ng / mL Proteinase K, 1% SDS) i et totalt volum på 18 mL for 1 time ved 37 ° C. Merk: Dette er viktig for å oppnå maksimal bisulphite konvertering, spesielt med DNA isolert fra kliniske prøver hvor det kan fortsatt være protein forbundet med DNA.

2. DNA denaturering

1. Denature 2 mikrogram DNA i et volum på 20 mL ved å legge 2 mL av nylagde 3M NaOH til en endelig concentration av 0,3.
2. Inkuber prøvene ved 37 ° C i 15 min i et vannbad, etterfulgt av inkubasjon ved 90 ° C i 2 min i en varme blokk. Umiddelbart plassere rørene på is i 5 min.
3. Sentrifuger rørene ved 4 ° C i 10 s ved 10 000 g, for å sikre DNA er på bunnen av røret.

3. Bisulphite deaminering

Sulfonert & hydrolytisk deaminering

1. Forbered friske løsninger på 10 mm Quinol og mettet natriummetabisulfitt pH 5,0 (7,6 g Na ₂ S ₂ O ₅ med 464 mL 10 M NaOH, laget opp til 15 ml med vann). Løsningen av mettet natrium bisulphite oppnås ved forsiktig å invertere reagenset / H ₂ O blanding, med minimum miksing og lufting. Om nødvendig, juster pH med 10 M NaOH, for full oppløsning av metabisulphite. Merknad: Siden det er en mettet løsning, kan små klumper fremdeles uoppløst.
2. Legg til 208mL av mettet metabisulphite og 12 mL av 10mm Quinol til denaturert DNA (20 mL), i et endelig volum på 240 mL til en endelig konsentrasjon av 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0. Bland forsiktig alle reagenser og sentrifuger i 10 sek for å sikre at alle dråpene er på bunnen av røret.
3. Overlegg prøvene med 200 mL av mineralolje. Inkuber prøvene ved 55 ° C i vannbad, for 4-16 timer. Lengden på bisulphite behandling er avhengig av mengde og kvalitet av DNA som skal konverteres. For DNA av dårlig kvalitet eller degradert DNA, begrense inkubasjonstiden til 4 timer. Merknad: det er viktig at at bisulphite konverteringen foregår i mørket for å unngå oksidering, så hvis dette ikke er mulig wrap rørene i folie før inkubering .
4. På slutten av den aktuelle inkubasjonstid, spin rørene kort i en mikrosentrifuge å sikre at all væske er på bunnen av røret.
5. Gjenopprette bisulphite behandlet DNAfra under oljelaget ved forsiktig pipettere ut DNA løsning fra bunnen av røret, uten å ta opp noen av mineralolje.

Avsalting

5. Fjern eventuelle gratis bisulphite ioner ved å passere gjennom en avsalting kolonne og eluting i 50 mL av milli-Q vann (MQH ₂ O). Avhengig av mengden og kvaliteten på genomisk DNA og hvordan det er forberedt, kan ulike avsalting kolonner brukes. Vi rutinemessig bruker Promega Wizard Rydd opp i kolonner, som disse kolonnene er egnet til å fjerne SDS brukes i utarbeidelsen av DNA før konvertering.

Alkali Desulphonation

6. Den bisulphite addukt fjernes fra uracil ringen av desulphonation. Desulphonate ved å tilsette 5,5 mL av nylagde 3M NaOH til en endelig konsentrasjon på 0,3 M, så inkuber prøvene ved 37 ° C i 15 min.
7. Sentrifuge kort og tilsett 1 mL av t-RNA (10 mg / ml).
<li> Nøytraliser løsningen ved å tilsette 33 mL av ammonium acetat (NH ₄ O Ac), pH 7,0 til en endelig konsentrasjon av 3M.
8. Etanol-felle DNA ved å tilsette 330 mL av iskald 100% etanol, bland godt av inversjon. Leave at-20μC for 1 time til natten. Sentrifuger ved 14 000 g for 15 min ved 4 ° C. Fjern alle spor av supernatanten og luft tørke utfelte DNA for ~ 20 min.
9. Re-suspendere DNA pellet i 50 mL / mikrogram på 0,1 TE (10mm Tris-HCL, 0.1mm EDTA, 8,0 pH) eller H ₂ O. Forlat i romtemperatur i ca 2 timer. Av vortex rørene for å sikre DNA er oppløst, etterfulgt av en rask sentrifuge.
10. Brukes umiddelbart for PCR amplifisering, eller lagre ved -20 ° C i 1-10 år, avhengig av mengde og kvalitet av DNA.

Fire. PCR Amplification

Primer Design

1. Effektiv utforming av PCR bisulphite konvertering-spesifikke primere er crucial for å sikre at effektive, objektive forsterkning av helt konvertert DNA oppstår. Følgende retningslinjer er brukt for å hjelpe primer design.

Primer Design Guidelines

Thermocyling

2. For å teste for proporsjonal PCR amplifisering av denaturert og unmethylated DNA, bruk en 50:50 denaturert / unmethylated fullt bisulphite konvertert kontroll prøven og forsterke med bisulphite konvertering-spesifikke primere under optimalisert PCR reaksjonen forhold (figur 3). For 50:50 denaturert: unmethylated kontroll, bruk in vitro SssI metylert DNA og enten hele genomet forsterkes (WGA) DNA eller fullblod DNA. Vær oppmerksom på at noen gener vil være naturlig denaturert i blodet og derfor i disse tilfellene er det best å bare bruke WGA DNA som "unmethylated" kontroll.
3. Forbered PCR forsterkning reaksjonsblandingene i 100 & mu; l alikvoter inneholder 2 mL av bisulphite konvertert genomisk DNA, 200 mM dNTP er, 1 mM primere, 1,5 mm ₂ MgCl, 50 mM KCl, 10mm Tris-HCL, 8,3 pH og 0,15 mL Taq polymerase.
4. I en temperatur gradient thermocycler, sett kjøre reaksjon i en gradient + / - 3 ° C fra spådd Tm av primer over 10 rør

5. For å teste at denaturert og unmethylated amplicons har blitt forsterket i forhold, kan amplicon bli fordøyd med en informativ restriksjon enzym, som Taq 1 (TCGA), som vil fordøye denaturert DNA, men vil ikke fordøye unmethylated DNA når begrensningen enzymet området er endret etter bisulphite konvertering til TTGA. Omfanget av fordøyelsen kan visualiseres ved agarose gel elektroforese (figur 3A). Alternativt kan SYBRGreen (0,2 mL av 1:1000 fortynning) legges til PCR reaksjonen ogomfanget av metylering kan vurderes ved å utføre varme dissosiasjon tomter i en real-time PCR thermocycler (Figur 3B).
6. PCR Reaction mix inkludert MgCl _{2-konsentrasjonen} og thermocycling forhold må kanskje justeres for å øke PCR effektivitet eller for å sikre proporsjonal PCR forsterkning av denaturert og unmethylated PCR fragmenter.
7. Når PCR forholdene er optimalisert, kan PCR forsterkning utføres på bisulphite konverterte prøver. Merk: Når Tm er optimalisert en temperatur gradient PCR ikke trenger brukes.

5. Representant Resultater:

Et eksempel på bisulphite PCR forsterkning optimalisering er vist i figur 3. Optimal PCR amplifisering forholdene bør forsterke denaturert og unmethylated amplicons i proporsjon og uten bias. Figur 3A viser en agarose gel med en temperatur gradient PCR forsterkning profil fra en blanding av 50% denaturert og unmethylated DNA. The PCR amplicons har blitt behandlet med en begrensning enzym, 1 Taq (TCGA), som vil fordøye denaturert (M) DNA, men vil ikke fordøye unmethylated (U) DNA som begrensning enzymet området endres ved bisulphite konvertering til TTGA. En lik mengde klipp og uklippet PCR produktet forventes hvis denaturert og unmethylated DNA er forsterket i forhold. Det kan ses på denne gel at den optimale thermocyling betingelser for ikke-bias forsterkning er på 56,1 ° C (T). Komplett konvertering av bisulphite DNA kan også bli analysert av fordøyelsen med cytosin-site bestemt enzym som hpa III (CCGG). Hpa III vil bare fordøye hvis konverteringen har sviktet, ettersom begrensningen området vil bli opprettholdt. Hvis konverteringen er fullført begrensningen området vil bli konvertert til TCGG eller TTGG avhengig metylering tilstanden av DNA. Komplett bisulphite DNA konvertering kan sees i figur 3A (H).

Figur 3B viser en sanntid dissosiasjon tomten somkan også brukes som et verktøy for å avgjøre om det er noen forsterkning skjevhet basert på temperaturen der de ulike molekylene vil distansere. I denne figuren kan det sees at PCR har forsterket denaturert (M) og unmethylated (U) DNA i forhold fra en blanding av 50% denaturert og unmethylated DNA sammenlignet med kontrollgruppen forsterkning av fullt denaturert og unmethylated DNA som distansere på 82.1μC og 78.9μC hhv.

Etter optimalisering av thermocyling og reaksjon forhold Bisulphite behandlet prøvene kan bli forsterket med tråd spesifikke og bisulphite spesifikke primere i enten en enkel eller semi nestede PCR reaksjon. Den resulterende PCR fragmenter kan visualiseres ved agarose gel elektroforese og sekvensert enten direkte (Figur 4A) eller ved kloning og sekvensering. Etter kloning og sekvensering av metylering tilstanden til den enkelte molekyler kan være ordnet i en bisulphite kart (Figur 4B), for å visualisere heterogenitetmetylering.

Høy gjennomstrømning kvantitativ metylering analyse kan preformed ved hjelp av teknologi slik som benyttes av Sequenom EpiTYPER metoden. Ved hjelp av denne metoden, er bisulphite konvertert DNA forsterket med bisulphite spesifikke PCR primere og etterfulgt av en proprietry cleavage prosess. Den resulterende fragmenter er quantitated av MALDI-TOF massespektrometri med de spesifikke spekteret avhengig av tilstedeværelsen av denaturert cytosines (Figur 5A). En oppsummering av metylering forholdstall i prøven kan deretter ekstrapoleres i form av en epigram (Figur 5B) eller metylering plottet (Figur 5C).

Figur 1. Denaturert CpG skjematisk. I normal celle, er promotor-assosiert CpG øyer overveiende unmethylated (grå), mens CpG områder innen gen kropper er sparsomme og generelt denaturert (rød). Panelet på høyre utvider molekylær structure av DNA på en individuell CpG område og viser metylering med en CH3 molekyl karbon 5 av cytosin.

Figur 2. . Kjemisk konvertering skjematisk Analyse av DNA metylering omfatter fire hovedtrinnene som vist; denaturering, bisulphite konvertering, PCR forsterkning og analyse. I høyre panel, er endringer i cytosin molekylet som oppstår under bisulphite konvertering avbildet.

Figur 3. Optimalisering av PCR forsterkning. A. Agarose gel elektroforese med en temperatur gradient PCR forsterkning profil fra en blanding av 50% denaturert og unmethylated DNA. Fragmenter har blitt fordøyd med enten Taq1 (T) eller HpaIII (H) som fordøye metylert DNA og ikke bisulphite konvertert DNA hhv. B. Heat dissosiasjon kurve Analysen viser en EQUAl andel av denaturert og unmethylated DNA (rød linje 50/50 blanding) sammenliknet med kontrollgruppen forsterkning av fullt denaturert (rosa linje, M) og unmethylated DNA (grønn linje, U) som dissosierer ved 82,1 ° C og 78,9 ° C hhv.

Figur 4. Eksempel på direkte sekvensering og en bisulphite kart. A. Sequence spor fra tre forskjellige cellelinjer med CpG nettsteder uthevet i gult. Cellelinje X viser 100% metylering på alle tre CpG nettstedene mens cellelinjer Y og Z viser varierende grad av metylering sett av overlappende G / A signaler. B. Representant bisulphite kart som viser tettheten av metylering (røde prikker) på individnivå CpG områder, som bestemmes av direkte sekvensering av individuelle kloner.

Figur 5. Høy gjennomstrømning DNA metylering analyse ved hjelp Sequenom. A. Spectrum visning ved hjelp Sequenom epiTYPER teknologi. DNA fragmenter vise bestemte spektra, avhengig av mengden av DNA metylering stede. B. epigram oppsummering av prosentandelen av DNA metylering på hvert CpG stedet for fire ulike cellelinjer. C. Metylering plottet oppsummering avledet fra Sequenom epigram.

Discussion

DNA metylering analyse av genomisk sekvensering av bisulphite konvertert DNA er et veletablert og allsidig metode som muliggjør identifisering og kvantifisering av DNA metylering ved singel nukleotid oppløsning. Men avhengig bisulphite konvertering og påfølgende analyse på premisset om at DNA har blitt fullt konvertert med hver unmethylated cytosin blir deaminated til uracil og bare denaturert cytosines gjenværende un-reaktiv. Hvis konverteringen er ufullstendig, kan problemer oppstå med analyse siden uomvendte unmethylated cytosines kan feilaktig tolkes som denaturert cytosines. Bisulphite konvertering kan være optimalisert på ulike stadier for å maksimere andelen av konverteringen. For DNA å være fullt konvertert det først skal være singel strandet slik at cytosin rester blir utsatt for bisulphite ioner. Det første trinnet, DNA denaturering, er kritisk og kan være kilde til ufullstendig konvertering hvis DNA er ikke fullt denaturert. For å sikreat DNA er fullt denaturert det er viktig at reaksjonen parametere inkludert fjerning av alle assosiert protein, passende salt konsentrasjon, inkubasjonstemperatur og tid er egnet til å opprettholde DNA i single strandet konformasjon. Det er viktig å bruke friske 3M NaOH og å tillate tilstrekkelig inkubasjonstid. Hvis DNA er motstand denaturering, kan enkelte modifikasjoner til protokollen inkludert forlenge inkubasjonstiden til 30 minutter eller fragmentering av DNA før denaturering lette DNA denaturering. I tillegg kan enkelt strandet DNA (ssDNA) re-anneal å doble DNA (dsDNA) under bisulphite konverteringen reaksjon. Gjennomføring av reaksjonen ved høyere temperatur (90-95 ° C) enten periodevis eller kontinuerlig under bisulphite reaksjonen kan hjelpe vedlikehold av ssDNA. Det er imidlertid viktig å være klar over at DNA fornedrelse er sterkt akselerert på disse høyere temperaturer. Ulike reagenser kan også legges til forstyrre re-annealing av the DNA-strenger, som for eksempel urea.

Konsentrasjonen av DNA og dens kvalitet kan også påvirke effektiviteten av bisulphite reaksjonen og ultimate PCR yield. DNA nedbrytning er en begrensning av bisulphite konvertering protokollen. Den kjemiske behandlingen av DNA introduserer forskjellige tråd pauser i ssDNA og noen av de tøffe forholdene er nødvendig for fullstendig bisulphite konvertering inkludert høy bisulphite konsentrasjon, lang inkubasjonstider kan akselerere DNA degradering. Under standard reaksjonen forholdene beskrevet, er DNA degradering ikke et vanlig problem, men hvis protokoll modifikasjoner er innført, slik som for sekvenser som er refraktære til omvendelse, for DNA maler som er degradert eller av dårlig kvalitet som FFPE prøvene, da DNA-degradering kan bli en betydelig begrensning.

Formalinfikserte, parafin embedded (FFPE) og degradert DNA-prøver kan være effektivt bisulphite konvertert og forsterket bruke denne protokollenMen modifikasjoner for å sikre at DNA ikke er ytterligere degradert blir rådet. Bruk av en transportør RNA som t-RNA anbefales. Også glykogen kan legges som en transportør når DNA konsentrasjonen er lav (<200 ng). Fordi DNA isolert fra FFPE vev allerede er fragmentert og ytterligere fragmentering finner sted under deaminering, må man sørge for å minimere ytterligere degradering. Ikke fragment DNA ytterligere før denaturering og begrense inkubasjonstiden for bisulphite reaksjonen til 4 timer. Design amplicons ikke større enn 300 bp på grunn av fragmentert DNA.

En annen faktor som kan påvirke PCR amplifisering at bisulphite konvertering av unmethylated cytosines reduserer kompleksiteten i DNA-malen. Følgende primer designen protokoll beskrevet i pkt. 4.1, økt primer lengde og nestede PCR kan alle bidra til å øke spesifisitet og PCR yield.

Endelig er siden DNA-malen endret under bisulphITE konvertering, forsterkning bias kan være en bekymring. Sikre at proporsjonal PCR forsterkning av denaturert og unmethylated maler er merket med en kontroll 50/50 M / U DNA blanding, som beskrevet i protokollen, se Figur 3. Også sørge for at forsterkning av bare konvertert maler er oppstått bruker HpaIII begrensning enzym og gel elektroforese (figur 3). PCR-forholdene må være optimalisert ved å variere temperatur og / eller magnesium konsentrasjon eller forlenge forlengelse tid. Noen maler synes å være spesielt problematisk og primer posisjon må kanskje justeres eller degenererte primere må benyttes.

Neste generasjons sekvensering teknikker er i rask utvikling for å oppnå et lignende vedtak om å bisulphite genomisk sekvensering, og tredje generasjon eneste molekyl sekvensering har potensial for å tillate analyse av både primær DNA og metylering uten behov for bisulphite sekvensering. Men utbredt tilgjengelighet og specificity av disse teknikkene er fortsatt litt tid borte. Bisulphite genomisk sekvensering er gullstandarden i metylering analyse og er en robust protokoll. Metoden har kommet til punktet der felles problemer og begrensninger har blitt løst, og søknadene har ekspandert fra individ genet analyser til høy gjennomstrømming og hele genomet analyse beskrevet av Clark et al. 2006 ^4. Feilsøking retningslinjer og ytterligere anbefalinger er beskrevet i Tabell 1. Det foreslås at den optimale tilnærmingen er å begynne med følge standard protokollen og bare introdusere modifikasjon hvis og når et problem oppstår.

Tabell 1. Feilsøking Retningslinjer

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.