DNAメチル化：重亜硫酸修飾と分析

Summary

DNAメチル化解析のためのゴールドスタンダードは、重亜硫酸変換したDNAのゲノム配列決定です。このメソッドは、酸性条件下で脱アミノ化を亜硫酸、5 - メチルシトシン（5 - MEC）と比較しシトシンの感度の向上を活用しています。非メチル化シトシンを標的ゲノムDNAのPCR増幅後にメチル化シトシンを区別することができます。

Abstract

エピジェネティクスは、DNA配列に独立して発生する遺伝子機能の遺伝性の変化を説明します。エピジェネティックな遺伝子調節の分子基盤は複雑ですが、本質的にDNAそのものやとDNA関連付けますタンパク質への変更を伴います。哺乳類ゲノムのDNAの主なエピジェネティックな修飾は、シトシン塩基のメチル化（5 - MEC）です。 DNAメチル化は、どこで、遺伝子が発現する必要があるときにと遺伝子発現の機械に命令を提供します。哺乳動物におけるDNAメチル化の主な標的配列は、5' - CpGの- 3'ヌクレオチド（図1）です。 CpGジヌクレオチドは、一様にゲノム全体に分散されていないが、反復的なゲノム配列と一般的に遺伝子のプロモーター（図1）に関連付けられているCpGの"島"の地域に集中している。 DNAのメチル化パターンは、組織特異的分化の間に変調された、開発の初期段階で設立し、がんを含む多くの疾患状態で中断されます。 uにnderstand DNAメチル化とヒト疾患におけるその役割の生物学的役割、、正確に効率的で再現性のある方法は、個々の5 - MECを検出し定量する必要があります。

亜硫酸変換のためのこのプロトコルは、DNAメチル化解析のための"ゴールドスタンダード"であり、単一のヌクレオチド解像度でDNAメチル化の同定と定量を容易にします。重亜硫酸ナトリウムによるシトシン脱アミノ化の化学的性質には、3つのステップ（図2）を伴います。 （1）スルホン化：ウラシル-亜硫酸誘導体の（3）アルカリ脱スルホンを与えるために生じたシトシン-亜硫酸誘導体の加水分解的脱アミノ化：：スルホネートの除去（2）油圧脱アミノ化シトシンの5-6二重結合に亜硫酸を添加するアルカリ処理によるグループ、ウラシルを与える。亜硫酸は、優先的に5 - MECのに対し、一本鎖DNA中のウラシルへのシトシンdeaminates、亜硫酸を介する脱アミノ化に抵抗性です。 PCR増幅時には、ウラシルが増幅され5 - MEC残基は、メチル化CpGのがシーケンス処理中シトシン"C"対チミン"T"残基の存在によって非メチル化CpGのと区別できるように、シトシンとして残っている間、チミンとして。

亜硫酸変換のDNA修飾は、DNAメチル化解析の多くのメソッドのために悪用される可能性が十分に確立されたプロトコルです。亜硫酸変換による5 - MECの検出は、最初に箱をら ^1、クラークら^2、DNAのメチル化に関する新たなデータの大部分のゲノムDNAのアカウントの亜硫酸変換をベースにした方法によって実証されて以来。後のPCR分析の異なる方法が必要なメチル化の特異性と解像度の程度に応じて、用いることができる。クローニングとシークエンシングは、まだDNA分子間のメチル化のための単一ヌクレオチド解像度を与えることができる最も容易に入手できる方法です。

Protocol

亜硫酸変換プロトコル

ゲノムDNAの2μgの変換のための標準プロトコルを以下に説明されています。ゲノムDNA（100 pgの-200μgの）のより小さいか大きい金額も正常に処理された亜硫酸することができます。これらの反応条件は、ほぼすべての標的DNA配列³の完全な転換（99.5から99.7パーセント）になります。

1。 DNAの調製

37℃の注で1時間、18μLの総体積で重亜硫酸DNAの溶解バッファー（2μgのトン RNA、280 ng /μLのプロテイナーゼK、1％SDS）でゲノムDNAをインキュベートすることにより、サンプルを準備します：これは達成することが重要です。特に、まだDNAに関連するタンパク質が存在する可能性がある臨床検体から分離されたDNAと最大重亜硫酸変換、。

2。 DNAの変性

1. 最後のcに用時調製した3MのNaOH2μlを添加することにより20μlの体積で変性2μgのDNA0.3Mのonc​​entration。
2. 37サンプルをインキュベートしますヒートブロックで2分間90℃でインキュベートした水浴中で15分間、。直ちに氷上で5分間チューブを置きます。
3. 10,000 gで10秒° Cは、DNAがチューブの底にあることを確認するために4でチューブを遠心する。

3。亜硫酸脱アミノ化

スルホン化＆加水分解脱アミノ化

1. 10 mMのキノールとナトリウム飽和亜硫酸液pH 5.0（10 M NaOHを464μLの7.6グラムのNa ₂ S ₂ O _5、水で15mlになる）の新鮮な溶液を調製。飽和重亜硫酸ナトリウムの溶液を最小混合と曝気と、ゆるやかに転倒試薬/ H ₂ Oの混合物によって達成されます。必要に応じて、メタ重亜硫酸の完全な溶解のために、10 M NaOHでpHを調整する注：それは飽和溶液であるため、小さなしこりがまだ溶け残る場合があります。
2. 208を追加飽和メタ重亜硫酸及び2.31M bisulphite/0.5mMキノールの最終濃度〜240μlの最終容量で変性したDNA（20μL）、、pHは5.0〜10mMのキノールの12μlを添加。優しくチューブの底にある液滴のすべてを確実にするために10秒間すべての試薬と遠心を混ぜる。
3. ミネラルオイル200μlのサンプルをオーバーレイ。 ℃の水浴中で、4〜16時間を55でサンプルをインキュベートする。亜硫酸治療の長さが変換されるDNAの量と質に依存しています。低品質や劣化したDNAのDNAの場合は、4時間にインキュベーション時間を制限する注：それはそれはインキュベーション前にホイルにチューブ可能ラップがないようなら、その重亜硫酸変換は酸化を避けるために、暗闇の中で行われることが重要です。 。
4. 適切なインキュベーション時間の最後に、すべての液体がチューブの底にあることを確認するために微量遠心機でチューブを軽くスピン。
5. 亜硫酸処理されたDNAを回収する慎重に鉱物油のいずれかを取ることなく、チューブの底からDNA溶液をピペッティングによりオイルの層の下から。

脱塩

5. 脱塩カラムを通過し、ミリQ水（MQH ₂ O）の50μlで溶出することにより任意のフリー亜硫酸イオンを取り外します。ゲノムDNAの量と質にし、それがどのように準備される応じて、別の脱塩カラムを使用することができます。我々は、日常的にこれらの列は、変換の前にDNAの調製に使用されるSDSを除去するのに適しているとしてプロメガウィザードは、列をクリーンアップします。

アルカリ脱スルホン

6. 重亜硫酸付加物は、脱スルホンによってウラシル環から削除されます。 0.3Mの最終濃度に調製したばかりの3M NaOHを5.5μlを添加することによりDesulphonateは、その後37℃で15分間サンプルをインキュベートする。
7. 短時間遠心し 、t RNA（10 mg / ml）を1μlを加える。
<liは>酢酸アンモニウム（NH ₄ O AC）、3Mの最終濃度までのpH 7.0の33μlの添加によるソリューションを中和します。
8. 氷冷100％エタノール330μlを添加してDNAをエタノール沈殿させ、反転によりよく混ぜる。一晩に1時間で-20μC残す。 4時15分、14,000 gで遠心する℃、上清と空気のすべての痕跡〜20分間沈殿したDNAを乾燥させて取り外します。
9. 0.1 TE（10mMのトリス- HCL、0.1mmのEDTA、pH8.0）をまたはH _{2 O50μl}の/μgのでDNAペレットを再サスペンド約2時間室温で残す。 DNAを確実にするために時々ボルテックスチューブは、迅速な遠心分離に続いて、溶解させる。
10. DNAの量と質に応じて10から10年間、-20℃でPCR増幅、または店のためにすぐに使用してください。

4。 PCR増幅

プライマーの設計

1. PCR亜硫酸変換特異的プライマーの効果的なデザインは、cruciaです完全に変換したDNAの効率的、公平な増幅が起こることを確保するためのリットル。次のガイドラインは、プライマーの設計を支援するために使用されています。

プライマーの設計ガイドライン

Thermocyling

2. メチル化及び非メチル化DNAの比例PCR増幅のためにテストするには、50:50メチル/非メチル化を完全に亜硫酸変換制御のサンプルを使用して最適化されたPCRの反応条件（図3）の下で亜硫酸変換特異的プライマーを用いて増幅する。 50:50メチル化の場合：非メチル化コントロール、 体外 SSSIメチル化DNAとのいずれかの全ゲノム増幅（WGA）のDNAまたは全血のDNA の使用。いくつかの遺伝子が自然に血液中のメチル化、したがって、これらの場合にのみ、"非メチル化"コントロールとしてWGA DNAを使用するのがベストだとされますのでご注意ください。
3. 100＆mのPCR増幅反応混合物を準備するU;重亜硫酸変換したゲノムDNA、200μMのdNTPの、1μMのプライマー、1.5mMのMgCl _2、50mMのKClを、10mMのトリス- HCL、pH8.3中、0.15μlのTaqポリメラーゼ 2μlを含むLアリコート。
4. 3℃でプライマーの予測されたTm値から10本 - 温度勾配のサーモサイクラーでは、勾配のラン反応+ /を設定する

5. メチル化及び非メチル化アンプリコンが比例して増幅されていることをテストするために、アンプリコンは、メチル化DNAを消化し ​​ますが、制限酵素サイトがあるときに非メチル化DNAを消化し ​​ないようなTaqポリメラーゼ 1（TCGA）などの有益な制限酵素、、で消化することができますTTGAに亜硫酸変換後に変更。消化の程度は、アガロースゲル電気泳動（図3A）により可視化することができます。また、SYBRGreen（1:1000希釈の0.2μl）をPCR反応に加えることができるとメチル化の程度は、リアルタイムPCRサーモサイクラー（図3B）の熱解離のプロットを行うことにより評価することができる。
6. MgCl ₂濃度と熱サイクル条件を含むPCR反応ミックスは、PCRの効率を向上させたり、メチル化及び非メチル化PCRフラグメントの比例PCR増幅を確実にするために調整する必要があります。
7. PCR条件が最適化されると、PCR増幅は、重亜硫酸変換のサンプルで実行することができます注：。一度Tm値は、温度勾配PCR法は、使用される必要はない最適化されています。

5。代表的な結果：

亜硫酸PCR増幅の最適化の例を図3に示されています。最適なPCR増幅の条件は、比例して、バイアスのないメチル化及び非メチル化アンプリコンを増幅する必要があります。図3Aは50％、メチル化及び非メチル化DNAの混合物から温度勾配PCR増幅のプロファイルを使用してアガロースゲルを示しています。目電子PCRアンプリコンは、メチル化（M）DNAを消化し ​​ますが、制限酵素部位としてメチル化（U）DNAを消化し ​​ない制限酵素、Taqポリメラーゼ 1（TCGA）、治療を受けていますTTGAに亜硫酸変換によって変更されます。メチル化及び非メチル化DNAが比例して増幅される場合にはカットとカットされていないPCR産物の等しい量が期待されている。それは、非バイアス増幅のための最適なthermocyling条件は56.1℃で（T）であることをこのゲルに見ることができます。亜硫酸DNAの完全な変換はまた、 パアン III（CCGG）などのシトシン-サイト固有の酵素による消化によって分析することができます。変換が失敗した場合パアン IIIは、唯一の制限部位が維持されるため、消化されます。変換が完了されている場合は制限酵素サイトはTCGGまたはDNAのメチル化状態に応じてTTGGに変換されます。亜硫酸DNA変換を完了し、図3A（H）で見ることができます。

図3Bは、リアルタイムでの解離のプロットを示していますまた、別の分子が解離する温度に基づいて任意の増幅の偏りがあるかどうかを判断するためのツールと​​して使用することができます。この図では、PCRが82.1​​μCで解離完全にメチル化及び非メチル化DNAの制御増幅に比べて50％メチル化及び非メチル化DNAの混合物からの割合でメチル化増幅さ（M）と非メチル化（U）DNAていることがわかるそれぞれ78.9μC。

thermocylingと反応条件の最適化後に重亜硫酸処理されたサンプルは、1つまたはセミネストPCR反応のいずれかで鎖の特定と亜硫酸特異的プライマーで増幅することができる。得られたPCR断片は、アガロースゲル電気泳動によって可視化し、直接（図4A）またはクローニングとシークエンシングにより配列決定することができます。クローニングと個々の分子のメチル化状態をシークエンシングは、の不均一性を可視化するために、重亜硫酸マップ（図4B）で、表形式で表すことができます後メチル化。

ハイスループット定量的なメチル化の解析は、シーケノムのEpiTYPERの方法によって利用されるそのような技術を使用して予備成形することができます。この方法を使用して、重亜硫酸変換したDNAを重亜硫酸特異的なPCRプライマーで増幅し、proprietry切断プロセスが続きます。得られた断片をメチル化シトシン（図5A）の存在に依存して特定のスペクトルとMALDI - TOF質量分析法によって定量される。サンプル中のメチル化率の要約は、エピグラム（図5B）またはメチル化のプロット（図5C）の形で外挿することができます。

図1。メチル化CpG回路図。遺伝子の本体内のCpGサイトが疎と（赤）一般的にメチル化されているのに対し、正常細胞では、プロモーター、関連するCpGアイランドは、主に（灰色）非メチル化されています。右側のパネルには、分子構造体を拡張個々のCpGサイトにおけるDNAのUREとシトシンの炭素5のCH3分子とメチル化を示しています。

図2。化学変換の回路図 DNAメチル化の分析のように4つの主な段階が含まれ、。変性、亜硫酸変換、PCRの増幅と解析を。右側のパネルでは、重亜硫酸変換中に発生したシトシン分子への変更が描かれている。

図3。 PCR増幅。A.の最適化 50パーセントメチル化及び非メチル化DNAの混合物から温度勾配PCR増幅のプロファイルを使用してアガロースゲル電気泳動。フラグメントは、それぞれメチル化DNAと非重亜硫酸変換したDNAを消化Taq1（T）またはHpaIII（H）のどちらかで消化されています。 B.熱解離曲線解析では、方程式を示しています。82.1での解離の制御を完全にメチル化の増幅（ピンクライン、M）と非メチル化DNA（緑のライン、U）に比べて、メチル化及び非メチル化DNAのL比率（赤線50/50ミックス）° Cと78.9 ° Cであった。

図4。ダイレクトシークエンシングと亜硫酸マップの例。A.黄色で強調表示さCpG部位を持つ3つの別の細胞株からのシーケンスのトレース。セルの線YとZはG /信号を重ねて見られるようにメチル化の度合いを示すのに対し、セルの行Xは、3つすべてのCpGサイトで100％のメチル化が表示されます。として個々のクローンのダイレクトシークエンシングによって決定される個々のCpG部位のメチル化の密度を示すB.描写亜硫酸マップ（赤い点）、。

図5。シーケノム。Aを用いた高スループットのDNAメチル化解析シーケノムepiTYPERの技術を使用してスペクトラムビュー。 DNA断片は、DNAメチル化の存在量に応じて、特定のスペクトルが表示されます。つの異なる細胞株のための各CpGサイトにおけるDNAメチル化の割合のB.エピグラムは、要約。シーケノムの警句から派生したC.メチル化のプロットの要約。

Discussion

亜硫酸変換したDNAのゲノム配列決定によるDNAメチル化解析は、単一ヌクレオチド解像度でDNAメチル化の同定と定量を容易に確立されたと多目的な方法です。しかし、亜硫酸変換とその後の分析は、DNAが完全にすべての非メチル化シトシンをウラシルに脱アミノ化されているとのみメチル化シトシンが非反応性の残りに変換されていることを前提に依存しています。変換が不完全な場合は変換されていない非メチル化シトシンが誤ってメチル化シトシンとして解釈される場合があるので、問題は、分析で生じる可能性があります。亜硫酸変換は変換の割合を最大化するために様々な段階で最適化することができます。 DNAが完全に変換されるためにはシトシン残基が重亜硫酸イオンにさらされているように、それは最初の一本鎖にする必要があります。最初のステップは、DNAの変性は、非常に重要であり、DNAが完全に変性していない場合は不完全な変換の原因となる可能性があります。確実にDNAが完全に変性していることそれは関連するすべてのタンパク質の除去、適切な塩濃度、培養温度および時間などの反応パラメータは、一本鎖コンフォメーションのDNAを維持するために適していることが重要です。新鮮な3M NaOHを使用し、適切なインキュベーション時間を確保することが重要です。 DNAは変性に抵抗している場合、30分にインキュベーション時間を延長または変性する前にDNAの断片化を含むプロトコルのいくつかの変更は、DNAの変性を促進するかもしれない。さらに、一本鎖DNA（ssDNAには）重亜硫酸変換反応の間に鎖DNA​​（dsDNA）を倍増させる再アニールすることがあります。どちらかを定期的、または継続的に亜硫酸反応の間に高い温度（90〜95℃）で反応を行うことはssDNAの維持を助けることができる。しかし、DNAの劣化が大きく、これらの高温下で加速されていることを認識することが重要です。種々の試薬はまた、目の再アニーリングを妨害するために追加することができます。尿素のような電子のDNA鎖、。

DNAの濃度とその品質はまた、重亜硫酸反応と究極のPCRの収量の効率に影響を与える可能性があります。 DNAの分解は、重亜硫酸変換のプロトコルの制限です。 DNAの化学的処理は、様々な鎖ssDNAにで休憩し、高亜硫酸濃度を含む完全な亜硫酸変換に必要な過酷な条件のいくつかを紹介し、長いインキュベーション時間は、DNAの劣化を加速することができます。説明した標準的な反応条件下でプロトコルの修正が導入されている場合、DNAの分解が低下したり、FFPEサンプルのような質の悪いのであるDNAテンプレートのために、そのような変換に対して不応性である配列の場合と同様、ただし、共通の問題ではありませんが、その後、DNAの分解重要な制限になることができます。

ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）と劣化したDNAサンプルは、効果的にこのプロトコルを使用して変換し、増幅された亜硫酸することができますしかし、DNAはそれ以上低下しないことを保証するための変更が推奨されます。 例えば 、t RNAのようなキャリアRNAの使用が推奨されます。 DNA濃度は、（<200 ngの）低い場合にも、グリコーゲンを担体として追加することができます。 FFPE組織から単離されたDNAが既に断片化し、さらに断片化が脱アミノ化中に行われるため、注意がさらに劣化を最小限に抑えるために注意する必要があります。フラグメントDNAが変性する前に、それ以上しないでくださいと4時間に亜硫酸反応のインキュベーション時間を制限する。デザインは、断片化したDNAにより300 bpよりも大きいアンプリコンない。

非メチル化シトシンの重亜硫酸変換がDNAテンプレートの複雑さを減少させることをPCR増幅に影響を与えることができるもう一つの要因。セクション4.1、増加したプライマーの長さとネステッドPCRに記載されている以下のプライマーの設計のプロトコルはすべての特異性とPCRの収量を向上させることができます。

最後に、DNAテンプレート以来bisulph中に変更されITE変換、増幅バイアスが問題となり得る。メチル化及び非メチル化テンプレートのその比例PCR増幅は、プロトコルに記載されている、コントロール50分の50のM / U DNAミックスでチェックされていることを確認、図3を参照してください。また、唯一の変換テンプレートの増幅がHpaIIIの制限酵素とゲル電気泳動（図3）を使用して発生していることを確認してください。 PCR条件は、温度および/またはマグネシウムの濃度を変えるか、伸長時間を長くすることによって最適化する必要があります。一部のテンプレートは、特に問題のように見えるとプライマーの位置を調整する必要がありますまたは縮重プライマーを可能に使用する必要があります。

次世代シーケンシング技術は、急速にゲノム配列決定を重亜硫酸と同様の分解能を達成するために進化している、と第三世代の単一分子シーケンシングは、重亜硫酸シーケンシングを必要とせずに一次DNAとメチル化の両方の分析を可能にするために可能性を秘めている。しかし、広範な可用性とスペックこれらの技術のificityは離れてしばらくの間残る。亜硫酸ゲノムシークエンシングは、メチル化解析のゴールドスタンダードであり、堅牢なプロトコルです。メソッドは、共通の問題および制限事項が解決されている点に進んでおり、アプリケーションは、高いスループットとクラークらにより記載された全ゲノム解析に個々の遺伝子解析から拡大している。2006 ^4。トラブルシューティングのガイドラインとその他の推奨事項を表1に概説されています。それは、最適なアプローチは、最初に標準のプロトコルに従っている場合にのみ変更とするときに問題が発生を導入することが示唆される。

表1。トラブルシューティングのガイドライン

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.