الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Summary

المعيار الذهبي لتحليل الحامض النووي هو التسلسل الجيني للbisulphite الحمض النووي التي تم تحويلها. هذا الأسلوب يستفيد من زيادة الحساسية للمقارنة مع السيتوزين methylcytosine - 5 (5 - MEC) إلى نزع الأمين bisulphite تحت الظروف الحمضية. ويمكن تمييز cytosines Unmethylated من cytosines ميثليته بعد التضخيم PCR هدف الحمض النووي الجيني.

Abstract

علم التخلق يصف التغيرات في وظيفة الجينات الموروثة التي تحدث بشكل مستقل لتسلسل الحمض النووي. الأساس الجزيئي للتنظيم الجينات جينية معقدة ، ولكن ينطوي أساسا تعديلات على الحمض النووي أو البروتينات نفسها التي الحمض النووي الزميلة. التعديل اللاجينية الغالبة من الحمض النووي في جينومات الثدييات هي مثيلة من النيوكليوتيدات السيتوزين (5 - MEC). الحامض النووي يوفر التعليم لآلية التعبير الجيني إلى أين ومتى ينبغي التعبير عن الجين. والهدف الرئيسي لتسلسل الحامض النووي في الثدييات هو 5' - CPG - 3 'dinucleotides (الشكل 1). لا dinucleotides CPG موزعة بشكل متجانس في جميع أنحاء الجينوم ، ولكنها تتركز في مناطق تسلسل الجينوم المتكررة وCPG "الجزر" التي ترتبط عادة مع المروجين الجين (الشكل 1). وتنشأ أنماط الحامض النووي في وقت مبكر في عملية التنمية ، التضمين أثناء تمايز أنسجة محددة وتعطلت في دول كثيرة من بينها مرض السرطان. إلى شمطلوبة nderstand الدور البيولوجي في الحامض النووي ودورها في المرض ، والإنسان الدقيق وفعالة وقابلة للتكرار الأساليب لكشف وتحديد الفرد 5 MeCs.

هذا البروتوكول لتحويل bisulphite هو "المعيار الذهبي" لتحليل الحامض النووي ويسهل تحديد وتقدير من الحامض النووي في قرار النوكليوتيدات واحد. كيمياء نزع الأمين السيتوزين bisulphite الصوديوم التي تتضمن ثلاث خطوات (الشكل 2). (1) Sulphonation : إضافة إلى السندات bisulphite 5-6 المزدوج لنزع الأمين (2) السيتوزين الهيدروليكية : نزع الأمين حلمهي المشتقة السيتوزين ، مما أدى إلى إعطاء bisulphite مشتق اليوراسيل - bisulphite (3) Desulphonation قلوي : إزالة للسلفونات المجموعة علاج القلوية ، لإعطاء اليوراسيل. Bisulphite deaminates تفضيلي السيتوزين إلى اليوراسيل في الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد ، في حين MEC - 5 ، هو صهر لbisulphite بوساطة نزع الأمين. على تضخيم PCR ، يتم تضخيمه اليوراسيلكما الثايمين بينما 5 - MEC مخلفات تبقى كما cytosines ، مما يسمح حاليا CpGs ميثليته من CpGs unmethylated بواسطة جود "جيم" السيتوزين مقابل بقايا الثايمين "T" خلال التسلسل.

تعديل الحمض النووي عن طريق تحويل bisulphite هو بروتوكول الراسخة التي يمكن استغلالها لطرق كثيرة للتحليل الحامض النووي. وقد تجلى منذ أول اكتشاف MEC - 5 عن طريق التحويل بواسطة bisulphite فرومر وآخرون ⁽¹⁾ وكلارك وآخرون. ² ، وطرق التحويل القائمة حول bisulphite حساب الحمض النووي الجيني لغالبية بيانات جديدة عن الحامض النووي. يمكن استخدام أساليب مختلفة للتحليل PCR آخر ، اعتمادا على درجة من الدقة وحلها مثلأيشن المطلوبة. الاستنساخ والتسلسل لا يزال الأسلوب الأكثر توافرا التي يمكن أن تعطي واحدة لقرار النوكليوتيدات مثيلة عبر جزيء الحمض النووي.

Protocol

Bisulphite التحويل بروتوكول

ووصف بروتوكول قياسي لتحويل 2 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي أدناه. يمكن أن كميات أصغر أو أكبر من الحمض النووي الجيني (100 بيكوغرام - 200 ميكروغرام) أيضا أن تكون bisulphite تعامل بنجاح. هذه الشروط يؤدي إلى رد فعل التحويل الكامل (99،5-99،7 ٪) تقريبا من كل هدف تسلسل الحمض النووي ^3.

1. الحمض النووي التحضير

تحضير عينات الحمض النووي التي يحتضنها الجينومية مع bisulphite تحلل الحمض النووي العازلة (2 ميكروغرام ر الحمض النووي الريبي ، 280 نانوغرام / ميكروليتر بروتين كاف ، 1 ٪ SDS) في حجم ما مجموعه 18 ميكرولتر : 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ملاحظة : هذا أمر مهم لتحقيق تحويل bisulphite القصوى ، لا سيما مع الحمض النووي المعزولة من العينات السريرية حيث قد يكون هناك لا يزال بروتين يرتبط مع DNA.

2. الحمض النووي تمسخ

1. تفسد الحمض النووي ميكروغرام 2 في حجم 20 ميكرولتر بإضافة 2 ميكروليتر من هيدروكسيد الصوديوم 3M الطازجة إلى ج النهائيoncentration من 0.3M.
2. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام الماء ، تليها حضانة في درجة مئوية لمدة 2 دقيقة 90 في كتلة الحرارة. المكان على الفور أنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق.
3. أنابيب الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 ثانية عند 10000 غرام ، للتأكد من الحمض النووي هو في الجزء السفلي من الأنبوب.

3. Bisulphite نزع الأمين

Sulphonation ونزع الأمين حلمهي

1. إعداد حلول جديدة من 10 ملي كينول الصوديوم والدهون المشبعة metabisulphite 5.0 درجة الحموضة (7.6 ز نا ₂ S ₂ O ₅ مع 464 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 10 م ، تتكون من 15 مل من الماء). ويتم تحقيق حل bisulphite الصوديوم المشبعة بواسطة قلب الخليط برفق كاشف / H ₂ O ، مع الحد الأدنى من خلط والتهوية. إذا لزم الأمر ، وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم M 10 ، على حل كامل للmetabisulphite ملاحظة : كما هو محلول مشبع ، قد كتل صغيرة لا تزال غير منحل.
2. إضافة 208ميكرولتر من metabisulphite المشبعة و 12 ميكرولتر من كينول 10MM على الحمض النووي المعطل (20 ميكرولتر) ، في الحجم النهائي من 240 ميكروليتر إلى التركيز النهائي لل2.31M bisulphite/0.5mM كينول ، ودرجة الحموضة 5.0. المزيج بلطف عن الكواشف والطرد المركزي لمدة 10 ثانية لضمان أن جميع من قطرات هي في الجزء السفلي من الأنبوب.
3. تراكب العينات مع 200 ميكرولتر من الزيوت المعدنية. احتضان العينات عند درجة حرارة 55 مئوية في حمام مائي ، ل4-16 ساعات. مدة العلاج bisulphite تعتمد على كمية ونوعية الحمض النووي لتحويلها. عن الحمض النووي من نوعية رديئة أو الحمض النووي المتدهورة ، والحد من فترة حضانة إلى 4 ساعات ملاحظة : من المهم أن هذا التحويل bisulphite تجري في الظلام لتجنب الأكسدة ، إذا بحيث لا يتم التفاف ممكن الأنابيب في احباط قبل الحضانة .
4. في نهاية فترة حضانة مناسبة ، وتدور الأنابيب لفترة وجيزة في microcentrifuge لضمان أن جميع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
5. استرداد DNA bisulphite معاملةمن تحت طبقة النفط pipetting بعناية الحل من الحمض النووي من أسفل الأنبوب ، دون أخذ أي من الزيوت المعدنية.

تحلية

5. إزالة أي الأيونات الحرة bisulphite التي تمر عبر عمود تحلية ويبلغ حجمه في 50 ميكرولتر من ملي - Q المياه (MQH ₂ O). اعتمادا على كمية ونوعية الحمض النووي الجيني وكيف أنها مستعدة ، يمكن استخدام الأعمدة تحلية مختلفة. نحن نستخدم بشكل روتيني Promega معالج تنظيف أعمدة ، وهذه الأعمدة هي مناسبة لإزالة SDS المستخدمة في إعداد الحمض النووي قبل التحويل.

القلوي Desulphonation

6. تتم إزالة ناتج إضافة bisulphite من الحلقة التي desulphonation اليوراسيل. Desulphonate بإضافة 5.5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 3M الطازجة إلى تركيز النهائي من 0.3M ، ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
7. الطرد المركزي لفترة وجيزة وإضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ر (10 ملغ / مل).
<لى> تحييد الحل من خلال إضافة 33 ميكرولتر من خلات الأمونيوم (NH ₄ O AC) ، ودرجة الحموضة 7.0 إلى تركيز النهائي من 3M.
8. خليط الايثانول ترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 330 ميكروليتر من الايثانول البارد الثلج 100 ٪ ، وكذلك عن طريق انقلاب. إجازة في دورتها الحادية و20μC : 1 ساعة ليلة وضحاها. ز الطرد المركزي في 14000 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة كل آثار طاف والهواء الجاف في الحمض النووي للعجل 20 دقيقة ~.
9. إعادة تعليق بيليه الحمض النووي في 50 ميكروليتر / 0.1 ميكروغرام TE O. ₂ (تريس 10MM - HCL ، 0.1mM EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0) أو H ترك في درجة حرارة الغرفة ل2hrs تقريبا. تم حل بعض الأحيان دوامة الأنابيب لضمان الحمض النووي ، ويليه الطرد المركزي بسرعة.
10. استخدامها على الفور لتضخيم PCR ، أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 10-10 سنة تبعا لنوعية وكمية الحمض النووي.

4. PCR التضخيم

التصميم التمهيدي

1. التصميم الفعال للبادئات PCR تحويل محددة هي bisulphite cruciaل لضمان كفاءة والتضخيم غير منحازة تماما لتحويل الحمض النووي يحدث. تستخدم المبادئ التوجيهية التالية لمساعدة التصميم التمهيدي.

إرشادات التصميم التمهيدي

Thermocyling

2. لاختبار PCR التضخيم النسبي من الحمض النووي ميثليته وunmethylated ، استخدم 50:50 مميثل / Unmethylated bisulphite عينة السيطرة تماما وتحويلها مع تضخيم الاشعال bisulphite محددة وفقا للشروط التحويل الأمثل تفاعل PCR (الشكل 3). لمميثل 50:50 : الرقابة Unmethylated ، واستخدام الحمض النووي في المختبر SssI ميثليته وإما كله تضخيم الجينوم (WGA) الحمض النووي DNA أو كليا في الدم. يرجى أن تدرك أن بعض الجينات ميثليته طبيعيا في الدم ، وبالتالي في مثل هذه الحالات فإنه من الأفضل استخدام الحمض النووي فقط WGA مثل السيطرة "Unmethylated".
3. تحضير مخاليط تفاعل PCR التضخيم في 100 م وش ؛ aliquots ل تحتوي على 2 ميكروليتر من الحمض النووي الجينومي bisulphite تحويل ، و 200 ميكرومتر dNTP ، 1 ميكرومتر الاشعال ، 1.5 ملي MgCl ₂ ، 50 ملي بوكل ، 10MM تريس - HCL ، ودرجة الحموضة 8.3 و 0.15 بوليميريز طق ميكرولتر.
4. في درجة حرارة thermocycler التدرج ، تعيين رد فعل تشغيل في الانحدار + / -- 3 درجات مئوية من تيم توقع من التمهيدي عبر أنابيب 10

5. لاختبار التي تم تضخيم amplicons ميثليته وunmethylated في نسبة ، يمكن هضم amplicon مع انزيم التقييد بالمعلومات ، مثل طق 1 (TCGA) ، التي من شأنها هضم الحمض النووي ميثليته لكن لن هضم الحمض النووي عندما unmethylated موقع انزيم التقييد غيرت بعد التحويل إلى bisulphite TTGA. ويمكن الحد من عملية الهضم يمكن تصور بواسطة agarose هلام إستشراد (3A الشكل). بدلا من ذلك ، يمكن إضافة SYBRGreen (0.2 ميكرولتر من تخفيف 1:1000) لتفاعل PCR وويمكن تقييم مدى مثيلة قبل تنفيذ مؤامرات حرارة التفكك في thermocycler PCR الوقت الحقيقي (الشكل 3B).
6. قد PCR مزيج التفاعل بما في ذلك ظروف الاعتقال وMgCl thermocycling ₂ يجب أن يتم تعديلها لزيادة كفاءة PCR أو لضمان تضخيم PCR PCR النسبي للشظايا وunmethylated ميثليته.
7. مرة واحدة يتم تحسين ظروف PCR ، يمكن إجراء PCR التضخيم على عينات bisulphite تحويل ملاحظة : بمجرد الأمثل تيم درجة حرارة PCR التدرج لا ينبغي أن تستخدم.

5. ممثل النتائج :

ويرد مثال على التحسين bisulphite PCR التضخيم في الشكل 3. وينبغي أن الظروف المثلى PCR التضخيم تضخيم amplicons ميثليته unmethylated وبما يتناسب ودون تحيز. الشكل 3A يظهر agarose هلام مع ملف تعريف التدرج في درجة الحرارة PCR التضخيم من مزيج من الحمض النووي ميثليته 50 ٪ وunmethylated. الوقد تمت معالجة البريد amplicons PCR مع انزيم التقييد ، طق 1 (TCGA) ، التي من شأنها هضم ميثليته (M) الحمض النووي لكنها لن هضم unmethylated (U) DNA كما هو تغيير موقع انزيم التقييد لتحويل bisulphite TTGA. ومن المتوقع أن مبلغ مساو من قص وتقطيعه منتج PCR إذا تم تضخيم الحمض النووي ميثليته وunmethylated في نسبة. يمكن أن ينظر إليه على هذا الجل أن الظروف المثلى لthermocyling عدم الانحياز في التضخيم هو 56،1 درجة مئوية (T). ويمكن أيضا تحويل كاملة من الحمض النووي يتم تحليلها من قبل bisulphite الهضم مع السيتوزين الموقع انزيم معين مثل هبان الثالث (CCGG). هبان الثالث سوف هضم فقط إذا كان التحويل قد فشلت ، كما سيتم الحفاظ على موقع قيود. وإذا اكتمال عملية التحويل يمكن تحويل الموقع إلى تقييد أو TCGG TTGG بالاعتماد على حالة مثيلة من الحمض النووي. ويمكن رؤية كاملة في تحويل الحمض النووي bisulphite 3A الشكل (H).

الشكل 3B يظهر انصرافا الوقت الحقيقي مؤامرة التيويمكن أيضا أن تستخدم كأداة لتحديد ما إذا كان هناك أي تحيز التضخيم استنادا إلى درجة الحرارة التي سوف تنأى جزيئات مختلفة. يمكن أن تكون في هذا الشكل نرى أن PCR وسع ميثليته (M) وunmethylated الحمض النووي (U) في نسبة من مزيج من الحمض النووي ميثليته 50 ٪ ومقارنة unmethylated التضخيم السيطرة على الحمض النووي ميثليته بالكامل والذي فصل في unmethylated 82.1μC و78.9μC على التوالي.

بعد التحسين من ظروف التفاعل thermocyling ويمكن أن تتضخم Bisulphite عينات تعامل مع الاشعال حبلا محددة تحديدا وbisulphite في أي تفاعل PCR أو شبه واحدة متداخلة. يمكن أن ينجم عن ذلك يمكن تصور شظايا PCR بواسطة هلام إستشراد agarose والتسلسل إما مباشرة (الشكل 4A) أو عن طريق الاستنساخ والتسلسل. يمكن أن يكون بعد جدولتها الاستنساخ وتسلسلها حالة مثيلة من الجزيئات الفردية ، في خريطة bisulphite الشكل (4B) ، لتصور عدم تجانسمثيلة.

ويمكن تحليل إنتاجية عالية بريفورميد مثلأيشن الكمي باستخدام التكنولوجيا مثل تلك التي يستخدمها الأسلوب EpiTYPER Sequenom. باستخدام هذا الأسلوب ، يتم تضخيم الحمض النووي bisulphite تحويلها مع bisulphite الاشعال PCR محددة ويعقبه proprietry عملية الانقسام. وquantitated الشظايا الناتجة عن طريق قياس الطيف الكتلي - TOF MALDI مع طائفة معينة تعتمد على وجود cytosines ميثليته (الشكل 5A). ويمكن بعد ذلك ملخص لنسب مثيلة في العينة يمكن استقراء في شكل ساخر (الشكل 5B) أو مؤامرة مثلأيشن (الشكل 5C).

الشكل 1. التخطيطي CPG ميثليته في الخلية العادية ، والمروج المرتبطة CPG الجزر هي في الغالب unmethylated (الرمادي) في حين CPG مواقع داخل الهيئات الجينات متفرق وميثليته عموما (الحمراء). لوحة على اليمين توسيع البنية الجزيئيةلدى عودتهم من الحمض النووي في موقعا CPG الفردية ومعارض مثيلة مع جزيء الكربون في CH3 5 من السيتوزين.

الشكل 2. . كيماوية تحويل التخطيطي تحليل الحامض النووي ويشمل أربع مراحل رئيسية كما هو مبين ؛ تمسخ ، bisulphite التحويل ، PCR التضخيم والتحليل. في اللوحة اليمنى ، وصفت التعديلات على جزيء السيتوزين التي تحدث أثناء عملية التحويل bisulphite.

الشكل 3. الأمثل من PCR التضخيم ألف. Agarose هلام الكهربائي مع التشكيل التدرج في درجة الحرارة PCR التضخيم من مزيج من الحمض النووي ميثليته 50 ٪ وunmethylated. وقد تم استيعاب إما مع شظايا Taq1 (T) أو HpaIII (H) الذي هضم الحمض النووي ميثليته الحمض النووي وعدم تحويلها bisulphite على التوالي. باء منحنى تفارق الحرارة التحليل يظهر equaنسبة لتر من الحمض النووي ميثليته وunmethylated (50/50 خط أحمر مزيج) مقابل السيطرة على التضخيم ميثليته بالكامل (الخط الوردي ، M) والحمض النووي unmethylated (الخط الأخضر ، U) والذي فصل في 82.1 درجة مئوية و 78.9 درجة مئوية على التوالي.

الشكل 4. مثال على التسلسل المباشر وخريطة bisulphite ألف. تتبع تسلسل من ثلاثة خطوط مختلفة من الخلايا مع مواقع CPG أبرزت باللون الأصفر. خط خلوي يعرض مثلأيشن X 100 ٪ في جميع المواقع الثلاثة CPG بينما خطوط خلية Y Z وتظهر بدرجات متفاوتة من مثيلة من وجهة نظر متداخلة G / A الإشارات. باء خريطة bisulphite الممثل تبين كثافة مثلأيشن (نقطة حمراء) في مواقع CPG الفردية ، على النحو الذي يحدده التسلسل المباشر لاستنساخ الفردية.

الشكل 5. ارتفاع سرعة تحليل الحامض النووي باستخدام Sequenom ألف. عرض الطيف باستخدام Sequenom epiTYPER التكنولوجيا. عرض شظايا من الحمض النووي أطياف محددة ، اعتمادا على كمية الحامض النووي الحالي. باء ساخر ملخص للنسبة المئوية من الحامض النووي في كل موقع CPG لمدة أربعة خطوط مختلفة من الخلايا. جيم ملخص المؤامرة الميثلة المستمدة من Sequenom ساخر.

Discussion

تحليل الحمض النووي مثلأيشن بواسطة التسلسل الجيني للحمض النووي bisulphite تحويل طريقة راسخة ومرنة تسهل تحديد وتقدير من الحامض النووي في قرار النوكليوتيدات واحد. ومع ذلك ، وتحويل bisulphite وتحليل لاحقة تعتمد على فرضية أنه قد تم تحويل الحمض النووي بشكل كامل مع كل السيتوزين unmethylated يجري deaminated إلى اليوراسيل وcytosines فقط ميثليته المتبقية من الامم المتحدة وعلى رد الفعل. إذا كان التحويل غير كاملة ، يمكن تنشأ مشاكل مع التحليل ، إذ يمكن تحويله cytosines unmethylated تفسير غير صحيح كما cytosines ميثليته. يمكن أن يكون الأمثل Bisulphite التحويل في مراحل مختلفة لتحقيق أقصى قدر نسبة التحويل. أن الحمض النووي لتحويلها بالكامل يجب أن يكون أول واحد الذين تقطعت بهم السبل بحيث يتعرضون للمخلفات السيتوزين bisulphite الأيونات. الخطوة الأولى ، تمسخ الحمض النووي ، أمر بالغ الأهمية ، ويمكن أن تكون مصدرا للتحويل الحمض النووي ناقصا إذا لم يتم التشويه والتحريف بشكل كامل. لضمانأن الحمض النووي هو التشويه والتحريف بشكل كامل من المهم أن رد فعل المعلمات بما في ذلك إزالة جميع البروتينات المرتبطة بها ، حسب تركيز الملح ، ودرجة حرارة الحضانة والوقت المناسب للحفاظ على الحمض النووي في التشكل الذين تقطعت بهم السبل واحدة. من المهم استخدام الطازجة 3M هيدروكسيد الصوديوم والسماح الوقت الكافي للحضانة. إذا كان الحمض النووي تقاوم تمسخ ، قد يكون بعض التعديلات على البروتوكول بما في ذلك تمديد فترة حضانة لمدة 30 دقيقة أو تفتيت الحمض النووي قبل تمسخ تسهيل تمسخ الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك ، قد تقطعت بهم السبل الحمض النووي واحد (ssDNA) إعادة يصلب لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) خلال رد فعل التحويل bisulphite. ويمكن تنفيذ رد فعل على ارتفاع درجة الحرارة (90-95 درجة مئوية) إما بصورة دورية أو مستمرة خلال تفاعل bisulphite المساعدات صون ssDNA. ومع ذلك ، فإنه من المهم أن ندرك أن يتم تسريعها تدهور الحمض النووي في ارتفاع درجات الحرارة هذه. ويمكن أيضا الكواشف المختلفة يمكن ان تضاف الى عرقلة إعادة الصلب من الجدائل الحمض النووي ه ، مثل اليوريا.

يمكن للتركيز الحمض النووي ونوعيته يؤثر أيضا على كفاءة التفاعل bisulphite والعائد النهائي PCR. تدهور الحمض النووي هو وجود قيود على تحويل بروتوكول bisulphite. العلاج الكيميائي للفواصل حبلا الحمض النووي يدخل في مختلف ssDNA وبعض الظروف القاسية اللازمة لتحويل bisulphite كاملة بما في ذلك تركيز عالية bisulphite مرات حضانة طويلة يمكن أن يسرع تدهور الحمض النووي. وفقا للشروط القياسية وصف رد الفعل ، وتدهور الحمض النووي ليست مشكلة شائعة ولكن ، إذا أدخلت تعديلات البروتوكول ، مثل متواليات التي يتم صهر للتحويل ، لقوالب الحمض النووي التي تدهورت أو من نوعية رديئة مثل عينات FFPE ، ثم تدهور الحمض النووي يمكن أن يصبح وجود قيود كبيرة.

يمكن الفورمالين الثابتة ، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) وعينات من الحمض النووي المتدهورة على نحو فعال وتضخيم bisulphite تحويلها باستخدام هذا البروتوكولولكن ينصح التعديلات للتأكد من أن الحمض النووي لا مزيد من التدهور. ينصح استخدام الحمض النووي الريبي الناقل مثل الحمض النووي الريبي ر. ويمكن أيضا أن يضاف الجليكوجين باعتبارها الناقل عند تركيز منخفض الحمض النووي (<200 نانوغرام). لأن الحمض النووي من الأنسجة المعزولة FFPE بالفعل مجزأة ومزيد من الانقسام يحدث أثناء نزع الأمين ، يجب الحرص على الحد من مزيد من التدهور. لا مزيد من الحمض النووي قبل أي جزء تمسخ والحد من فترة حضانة للتفاعل bisulphite إلى 4 ساعات. تصميم amplicons لم أكبر من 300 سنة مضت بسبب الحمض النووي مجزأة.

عامل آخر يمكن أن تؤثر على تضخيم PCR أن التحويل من bisulphite cytosines unmethylated يقلل من تعقيد قالب الحمض النووي. ويمكن تصميم التمهيدي بعد بروتوكول المبينة في القسم 4.1 ، زيادة طول التمهيدي وPCR المتداخلة مساعدة جميع لزيادة الغلة والنوعية PCR.

أخيرا ، منذ القالب الحمض النووي هو تغيير خلال bisulphويمكن تحويل الفنار ، والتحيز التضخيم تكون مصدرا للقلق. ضمان أن يتم فحص PCR التضخيم النسبي من القوالب وميثليته unmethylated مع مزيج 50/50 سيطرة الحمض النووي M / U ، كما ورد في البروتوكول ، انظر الشكل 3. تأكد أيضا أن التضخيم من القوالب تحويلها فقط يحدث باستخدام انزيم HpaIII التقييد والكهربائي للهلام (الشكل 3). قد تحتاج إلى ظروف PCR يكون الأمثل من خلال تغيير درجة الحرارة وتركيز / أو المغنيسيوم أو إطالة وقت التمديد. بعض القوالب ويبدو أن مشكلة خاصة وموقف التمهيدي قد تحتاج إلى أن تعدل أو تتحول الاشعال قد تحتاج لاستخدامه.

تقنيات الجيل القادم التسلسل تتطور بسرعة لتحقيق تسوية مماثلة لتسلسل الجينوم bisulphite ، وثالث التسلسل جيل جزيء واحد لديه القدرة على السماح لتحليل الحمض النووي لكل من الابتدائي ومثيلة من دون الحاجة إلى تسلسل bisulphite. ومع ذلك ، وتوافر واسع النطاق والمواصفاتificity من هذه التقنيات لا تزال بعض الوقت بعيدا. تسلسل الجينوم Bisulphite هو معيار الذهب في التحليل ومثلأيشن هو بروتوكول قوية. وقد أحرز تقدم في طريقة إلى النقطة التي تم فيها حل المشاكل المشتركة والقيود والطلبات قد وسعت من التحليلات الجينية الفردية إلى إنتاجية عالية وتحليل كامل الجينوم التي وصفها كلارك وآخرون ⁴ 2006. وترد المبادئ التوجيهية والتوصيات لحل المشاكل إضافية في الجدول رقم 1. يقترح أن النهج الأمثل هو اتباع البروتوكول القياسي في البداية فقط وإدخال التعديل إذا وعندما تنشأ مشكلة.

الجدول 1. المبادئ التوجيهية استكشاف

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.