DNA methylering: bisulfit Ændring og analyse

Summary

Den gyldne standard for DNA methylering analyse er genomiske sekventering af bisulfit konverteret DNA. Denne metode benytter sig af den øgede følsomhed cytosin sammenlignet med 5-methylcytosine (5-MEC) til bisulfit deaminering under sure betingelser. Unmethylated cytosines kan skelnes fra methyleres cytosines efter PCR-amplifikation af målet genomisk DNA.

Abstract

Epigenetik beskriver arvelige ændringer i genfunktion, der opstår uafhængigt af DNA-sekvensen. Den molekylære basis af epigenetiske genregulering er kompleks, men det væsentlige indebærer ændringer i selve DNA eller proteiner med hvilke DNA associerede virksomheder. Den fremherskende epigenetiske ændringer af DNA i pattedyrs genomer er methylering af cytosin nukleotider (5-MEC). DNA methylering giver instruktion om at genekspression maskiner til hvor og hvornår genet skal udtrykkes. Den primære målsekvens for DNA-methylering hos pattedyr er 5'-CPG-3 'dinucleotides (figur 1). CPG dinucleotides er ikke jævnt fordelt over hele genomet, men er koncentreret i regioner af gentagne genomiske sekvenser og CPG "øer" ofte forbundet med genet initiativtagere (Figur 1). DNA methylering mønstre er etableret tidligt i udviklingen, moduleret under væv specifikke differentiering og forstyrret i mange sygdomstilstande, herunder kræft. For at understand den biologiske rolle af DNA methylering og dens rolle i sygdomme hos mennesker, præcise, effektive og reproducerbare metoder er nødvendige for at detektere og kvantificere de enkelte 5-MeCs.

Denne protokol for bisulfit konvertering er "gold standard" for DNA methylering analyse og letter identifikation og kvantificering af DNA methylering på enkelt nucleotid opløsning. Kemien i cytosin deaminering ved natriumbisulfit består af tre trin (Figur 2). (1) sulfonering: Tilføjelsen af ​​bisulfit til de 5-6 dobbeltbinding af cytosin (2) Hydrolic deaminering: hydrolytisk deaminering af den resulterende cytosin-bisulfit derivat at give en uracil-bisulfit derivat (3) Alkali Desulphonation: Fjernelse af sulfonat gruppen af ​​en alkalibehandling, at give uracil. Bisulfit fortrinsvis deaminates cytosin til uracil i enkelt-strenget DNA, mens 5-MEC, er refraktære over for bisulfit-medieret deaminering. Ved PCR-amplifikation, er uracil forstærkessom thymin, mens 5-MEC rester forblive som cytosines, så denatureret CpGs skal adskilles fra unmethylated CpGs ved tilstedeværelsen af ​​et cytosin "C" versus thymin "T" restprodukt i løbet af sekventering.

DNA modifikation af bisulfit konvertering er en veletableret protokol, som kan udnyttes til mange metoder af DNA methylering analyse. Siden påvisning af 5-MEC ved bisulfit konvertering først blev påvist ved Frommer et al. ¹ og Clark et al. ^2, metoder baseret omkring bisulfit konvertering af genomisk DNA tegner sig for hovedparten af de nye data på DNA methylering. Forskellige metoder til post-PCR-analyse kan anvendes, afhængig af graden af ​​specificitet og løsning af methylering påkrævet. Kloning og sekventering er stadig den mest tilgængelige metode, der kan give en enkelt nucleotid opløsning for metylering tværs af DNA-molekylet.

Protocol

Bisulfit konvertering protokol

En standard-protokol til omdannelse af 2 mikrogram af genomisk DNA er beskrevet nedenfor. Mindre eller større mængder af genomisk DNA (100 PG-200 mikrogram) kan også bisulfit behandles med succes. Disse reaktioner forhold resulterer i en fuldstændig omlægning (99,5-99,7%) af næsten alle target-dna-sekvens ^3.

1. DNA-forberedelse

Forbered prøver ved at inkubere genomisk DNA med bisulfit DNA lysisbuffer (2 mikrogram t-RNA, 280 ng / mikroliter proteinase K, 1% SDS) i en samlet volumen på 18 μl til 1 time ved 37 ° C. Bemærk: Dette er vigtigt for at opnå maksimal bisulfit konvertering, især med DNA isoleret fra kliniske prøver, hvor der kan stadig være protein forbundet med DNA.

2. DNA Denaturering

1. Denaturere 2 mg DNA i en volumen på 20 μl ved tilsætning af 2 μl af frisklavede 3M NaOH til en endelig concentration af 0.3M.
2. Inkubér prøverne ved 37 ° C i 15 min i et vandbad, efterfulgt af inkubation ved 90 ° C i 2 min i en varmeblok. Umiddelbart placere rørene på is i 5 min.
3. Centrifugér glassene ved 4 ° C i 10 s ved 10.000 g, for at sikre, at DNA er i bunden af røret.

3. Bisulfit deaminering

Sulfonering & Hydrolytisk deaminering

1. Forbered frisklavede opløsninger på 10 mm quinol og mættet natriummetabisulfit pH 5,0 (7,6 g Na ₂ S ₂ O ₅ med 464 μl 10 M NaOH, lavet op til 15 ml med vand). Løsningen af mættet natriumbisulfit opnås ved forsigtigt at vende reagenset / H ₂ O blanding, med et minimum af blanding og beluftning. Om nødvendigt justeres pH med 10 M NaOH, for fuld opløsning af kaliummetabisulfit. Bemærk: Da det er en mættet opløsning, kan små klumper stadig uopløst.
2. Tilføj 208μl af den mættede kaliummetabisulfit og 12 μl af 10mM quinol til denatureret DNA (20 μl), i en endelig mængde på 240 mikroliter med en slutkoncentration på 2.31M bisulphite/0.5mM quinol, pH 5,0. Bland forsigtigt alle reagenser og centrifuger i 10 sek til at sikre, at alle dråberne er i bunden af ​​røret.
3. Overlay prøverne med 200 μl af mineralsk olie. Inkubér prøverne ved 55 ° C i et vandbad, til 4-16 timer. Længden af ​​bisulfit behandling er afhængig af mængden og kvaliteten af ​​den DNA, der skal konverteres. For DNA af dårlig kvalitet eller nedbrudt DNA, begrænse inkubationstiden til 4 timer. Bemærk: Det er vigtigt, at de bisulfit konverteringen foregår i mørke for at undgå iltning, så hvis dette ikke er muligt wrap rør i folie før inkubering .
4. Ved udgangen af ​​den pågældende inkubationstid, dreje rør kortvarigt i en mikrocentrifuge for at sikre, at al væsken er i bunden af ​​røret.
5. Genopret den bisulfit behandlede DNAfra under olien lag ved omhyggeligt pipettering ud DNA løsning fra bunden af ​​røret, uden at tage nogen af ​​mineralsk olie.

Afsaltning

5. Fjern eventuelle gratis bisulfit ioner ved at passere gennem en afsaltning kolonne og sk i 50 μl af Milli-Q vand (MQH ₂ O). Afhængig af mængden og kvaliteten af ​​det genomiske DNA og hvordan det er forberedt, kan forskellige afsaltning kolonner anvendes. Vi rutinemæssigt bruger Promega guiden Ryd op i kolonner, da disse kolonner er egnede til at fjerne SDS anvendes til fremstilling af DNA forud for konvertering.

Alkali Desulphonation

6. Den bisulfit addukt fjernes fra uracil ring af desulphonation. Desulphonate ved at tilsætte 5,5 μl af frisklavede 3M NaOH til en endelig koncentration på 0,3 M, så Inkubér prøverne ved 37 ° C i 15 min.
7. Centrifuge kort og tilsæt 1 ml af t-RNA (10 mg / ml).
<li> Neutraliser løsning ved tilsætning af 33 μl af ammoniumacetat (NH ₄ O Ac), pH 7,0 til en slutkoncentration på 3M.
8. Ethanol-bundfald DNA ved at tilsætte 330 μl af is kold 100% ethanol, bland godt ved at vende. Forlad at-20μC for 1 time at overnatte. Centrifugeres ved 14.000 gi 15 min ved 4 ° C. Fjern alle spor af supernatanten og lufttørre udfældede DNA for ~ 20 min.
9. Genopslæmmes DNA pellet i 50 μl / mg på 0,1 TE (10mm Tris-HCl, 0,1 mm EDTA, pH 8,0) eller H ₂ O. Henstår ved stuetemperatur i ca 2 timer. Lejlighedsvis Vortex rørene for at sikre, at DNA er opløst, efterfulgt af en hurtig centrifuge.
10. Anvendes straks til PCR-amplifikation, eller opbevares ved -20 ° C i 1-10 år, afhængigt af mængden og kvaliteten af ​​DNA.

4. PCR-amplifikation

Primer Design

1. Effektiv design af PCR bisulfit konvertering-specifikke primere er crucial for at sikre, at effektive, upartiske forstærkning af helt omdannet DNA opstår. De følgende retningslinjer anvendes til at støtte primer design.

Primer Design Guidelines

Thermocyling

2. At teste for proportional PCR-amplifikation af methylerede og unmethylated DNA, bruge en 50:50 Methylkviksølv / Unmethylated fuldt bisulfit konverteret kontrolprøve og forstærker med bisulfit konverteringen-specifikke primere under den optimerede PCR-reaktionen forhold (Figur 3). Til 50:50 Methylkviksølv: Unmethylated kontrollen, anvender in vitro SssI methylerede DNA og enten hele genomet forstærkes (WGA) DNA eller fuldblod DNA. Vær opmærksom på, at nogle gener vil være naturligt methyleres i blodet og derfor i disse tilfælde er det bedst kun at bruge WGA DNA som "Unmethylated" kontrol.
3. Forbered PCR-amplifikation reaktionsblandingerne i 100 & Mu; l alikvoter, som indeholder 2 μl af bisulfit konverteret genomisk DNA, 200 μM dNTP er, 1 μM primere, 1,5 mM MgCl _2, 50 mM KCl, 10mm Tris-HCl, pH 8,3 og 0,15 μl Taq polymerase.
4. I en temperaturgradient thermocycler, indstille køre reaktionen i et forløb + / - 3 ° C fra den forudsagte Tm af primer på tværs af 10 rør

5. For at teste, at de methylerede og unmethylated amplikationsprodukter er blevet forstærket i forhold, kan amplikonet blive fordøjet med en informativ begrænsning enzym, såsom Taq 1 (TCGA), som vil fordøje methylerede DNA, men vil ikke fordøje unmethylated DNA, når det restriktionsenzym webstedet er ændret efter bisulfit konvertering til TTGA. Omfanget af fordøjelsen kan visualiseres ved agarosegel elektroforese (figur 3A). Alternativt kan SYBRGreen (0,2 μl af 1:1000 fortyndingen) lægges til PCR reaktion ogomfanget af methylering kan vurderes ved at udføre varme dissociation plots i et real-time PCR thermocycler (figur 3B).
6. PCR-reaktionsblandingen herunder MgCl ₂ koncentration og termocykling betingelser skal muligvis justeres for at øge PCR effektivitet eller til at sikre proportionel PCR-amplifikation af methylerede og unmethylated PCR-fragmenter.
7. Når PCR-forhold er optimeret, kan PCR-amplifikation udføres på bisulfit konverterede prøver. Bemærk: Når TM er optimeret til en temperatur gradient PCR behøver ikke at blive brugt.

5. Repræsentative resultater:

Et eksempel på bisulfit PCR amplifikation optimering er vist i figur 3. Optimale PCR amplifikation betingelser bør forstærke methylerede og unmethylated amplikationsprodukter i forhold til og uden fordomme. Figur 3A viser en agarosegel med en temperaturgradient PCR-amplifikation profil fra en blanding af 50% methylerede og unmethylated DNA. The PCR amplikationsprodukter er blevet behandlet med en begrænsning enzym, Taq 1 (TCGA), som vil fordøje methylerede (M), DNA, men vil ikke fordøje unmethylated (U) DNA som begrænsning enzym webstedet ændres ved bisulfit konvertering til TTGA. En lige stor del af afskårne og uslebne PCR-produkt er forventet, hvis methyleres og unmethylated DNA forstærkes i forhold. Det kan ses på denne gel, at den optimale thermocyling betingelser for ikke-bias forstærkning er på 56,1 ° C (T). Fuldstændig omlægning af bisulfit DNA kan også analyseres ved oplukning med cytosin-site specifikke enzym som hpa III (CCGG). Hpa III vil kun fordøje, hvis konverteringen er mislykkedes, da begrænsningen hjemmeside vil blive opretholdt. Hvis konverteringen er fuldført begrænsningen websted vil blive konverteret til TCGG eller TTGG afhængig methylering tilstand DNA. Komplet bisulfit DNA-konvertering kan ses i figur 3A (H).

Figur 3B viser en real time dissociation plot, derkan også bruges som et redskab til at afgøre, om der er nogen forstærkning skævhed baseret på den temperatur, hvor de forskellige molekyler vil tage afstand. I dette tal kan det ses, at PCR har forstærket methylerede (M) og unmethylated (U) DNA i forhold fra en blanding af 50% methylerede og unmethylated DNA sammenlignet med kontrolgruppen forstærkning af fuldt methylerede og unmethylated DNA, som tager afstand fra 82.1μC og 78.9μC hhv.

Efter optimering af thermocyling og reaktionsbetingelser bisulfit behandlede prøver kan forstærkes med streng specifikke og bisulfit specifikke primere i enten en enkelt eller semi nested PCR reaktion. Den resulterende PCR-fragmenter kan visualiseres ved agarosegel elektroforese og planlægges enten direkte (figur 4A) eller ved kloning og sekventering. Efter kloning og sekventering af methylering tilstand af de enkelte molekyler kan være angivet i en bisulfit kort (figur 4B), til at visualisere heterogeniteten imethylering.

High throughput kvantitative methylering analyse kan preformed bruge teknologi som den, der anvendes af Sequenom EpiTYPER metode. Ved hjælp af denne metode, er bisulfit omdannes DNA forstærkes med bisulfit specifikke PCR primere og efterfølges af et proprietry spaltning proces. Den resulterende fragmenter quantitated af MALDI-TOF massespektrometri med den specifikke spektrum afhængig af tilstedeværelsen af ​​methylerede cytosines (Figur 5A). Et resumé af methylering nøgletal i prøven kan så ekstrapoleres i form af et Epigram (Figur 5B) eller metylering plot (figur 5C).

Figur 1. Methylerede CPG skematisk. I den normale celle, der er promotor-associerede CPG øer overvejende unmethylated (grå), mens CPG steder i genet organer er sparsomme og generelt methylerede (rød). Panelet til højre udvider molekylære structURE af DNA på en individuel CPG hjemmeside og viser methylering med en CH3 molekyle hos Carbon 5 af cytosin.

Figur 2. . Kemisk omdannelse skematisk analyse af DNA methylering omfatter fire vigtigste etaper som vist; denaturering, bisulfit konvertering, PCR amplifikation og analyse. I højre panel, er ændringer af cytosin molekyle, der opstår under bisulfit konvertering afbildet.

Figur 3. Optimering af PCR-forstærkning. A. Agarosegel elektroforese med en temperaturgradient PCR-amplifikation profil fra en blanding af 50% methylerede og unmethylated DNA. Fragmenter er blevet fordøjet med enten Taq1 (T) eller HpaIII (H), som fordøje methylerede DNA og ikke bisulfit konverteret DNA hhv. B. Varm dissociation kurve analyse viser en ligningerl andelen af ​​methylerede og unmethylated DNA (rød linje 50/50 mix) i sammenligning med kontrolgruppen forstærkning af fuldt methylerede (lyserød linje, M) og unmethylated DNA (grøn linje, U), som tager afstand ved 82,1 ° C og 78,9 ° C hhv.

Figur 4. Eksempel på direkte sekventering og et bisulfit kort. A. Sekvens spore fra tre forskellige cellelinjer med CPG steder markeret med gult. Cellelinie X viser 100% methylering på alle tre CPG sites mens cellelinjer Y og Z viser varierende grader af methylering set af overlappende G / A-signaler. B. repræsentant bisulfit kort, der viser tætheden af ​​methylering (røde prikker) på de enkelte CPG steder, som bestemmes ved direkte sekventering af de enkelte kloner.

Figur 5. High throughput DNA methylering analyse ved hjælp Sequenom. A. Spectrum visning ved hjælp Sequenom epiTYPER teknologi. DNA-fragmenter display specifikke spektre, afhængigt af mængden af ​​DNA methylering til stede. B. epigram sammendrag af den procentdel af DNA methylering på hvert CPG stedet for fire forskellige cellelinjer. C. Methylering plot summary stammer fra Sequenom epigram.

Discussion

DNA methylering analyse af genom sekventering af bisulfit konverteret DNA er en veletableret og alsidig metode, der letter identifikation og kvantificering af DNA methylering på enkelt nucleotid opløsning. Men bisulfit konvertering og efterfølgende analyse bygger på den forudsætning, at dna er fuldt ombygget med hver unmethylated cytosin blive deamineret til uracil og kun methylerede cytosines resterende un-reaktive. Hvis konverteringen er ufuldstændig, kan der opstå problemer med analysen, da uomvendte unmethylated cytosines kan fejlagtigt tolkes som methylerede cytosines. Bisulfit konvertering kan optimeres på forskellige stadier for at maksimere andelen af ​​konverteringen. For DNA til at være fuldt konverterede det først skal være enkelt strandede så cytosin rester er udsat for bisulfit ioner. Det første skridt, DNA denaturering, er kritisk og kan være kilde til ufuldstændig konvertering, hvis DNA ikke er fuldt denatureret. For at sikre,, at DNA er fuldt denatureret, er det vigtigt, at reaktionen parametre, herunder fjernelse af alle dermed forbundne protein, passende saltkoncentration, inkubationstemperatur og tid er egnede til at opretholde DNA i enkelt strandede kropsbygning. Det er vigtigt at bruge friske 3M NaOH og for at give en passende inkubationstid. Hvis DNA er modstand denaturering, kan nogle ændringer til protokollen, herunder udvidelse af inkubationstiden til 30 minutter eller fragmentering af DNA forud for denaturering lette DNA denaturering. Desuden kan en enkelt strandede DNA (ssDNA) re-anneal til dobbelt strandede DNA (dsDNA) under bisulfit konverteringen reaktion. Udførelse af reaktionen ved en højere temperatur (90-95 ° C) enten periodisk eller løbende under bisulfit reaktionen kan støtte vedligeholdelsen af ​​ssDNA. Men det er vigtigt at være opmærksom på, at DNA-nedbrydning i høj grad er accelereret ved disse højere temperaturer. Forskellige reagenser kan også tilføjes at forstyrre re-udglødning af the DNA-strenge, såsom urinstof.

Koncentrationen af ​​DNA og dets kvalitet kan også påvirke effektiviteten af ​​bisulfit reaktion og ultimativ PCR udbytte. DNA-nedbrydning er en begrænsning af den bisulfit konverteringen protokollen. Den kemiske behandling af DNA introducerer forskellige Strand pauser i ssDNA og nogle af de barske vilkår nødvendigt for fuldstændig bisulfit konvertering herunder høj bisulfit koncentration, lange inkubationstider kan fremskynde DNA nedbrydning. Under standard reaktionen beskrevne betingelser, er DNA nedbrydning ikke er et fælles problem, men hvis protokol ændringer er indført, såsom for sekvenser, der er refraktære over for konvertering, for DNA-skabeloner, der nedbrydes eller af dårlig kvalitet, der FFPE prøver, så DNA-nedbrydning kan blive en væsentlig begrænsning.

Formalinfikserede, paraffinindstøbte embedded (FFPE) og nedbrudt DNA-prøver kan effektivt bisulfit konverteres og forstærkes ved hjælp af denne protokolMen ændringer for at sikre, at DNA ikke er yderligere nedbrydes tilrådes. Brugen af en transportør RNA såsom T RNA anbefales. Også glykogen kan tilføjes som en transportør, når DNA-koncentration er lav (<200 ng). Fordi DNA isoleret fra FFPE væv er allerede fragmenteret og yderligere opsplitning finder sted under deaminering, skal der drages omsorg for at minimere yderligere nedbrydning. Må ikke fragment DNA yderligere, før denaturering og begrænse inkubationstiden for bisulfit reaktion på 4 timer. Design amplikationsprodukter ikke større end 300 basispoint på grund af fragmenteret DNA.

En anden faktor, der kan påvirke PCR-amplifikation, at bisulfit konvertering af unmethylated cytosines reducerer kompleksiteten af ​​DNA-skabelonen. Følgende primer design protokol skitseret i afsnit 4.1, øget primer længde og nested PCR kan alle bidrage til at øge specificiteten og PCR udbytte.

Endelig er da DNA-skabelonen ændres under bisulphITE konvertering, forstærkning skævhed kan være en bekymring. Sørg for, at proportional PCR-amplifikation af methylerede og unmethylated skabeloner er markeret med en kontrolgruppe 50/50 M / U DNA-mix, som skitseret i protokollen, jf. figur 3. Også sikre, at forstærkning af kun konverterede skabeloner, der sker ved hjælp af HpaIII restriktionsenzym og gelelektroforese (Figur 3). Den PCR-forhold kan være nødvendigt at optimeres ved at variere temperaturen og / eller magnesium koncentration eller forlængelse forlængelse tid. Nogle skabeloner synes at være særligt problematisk og primer position skal muligvis justeres eller degenerere primere kan have brug for at blive brugt.

Næste generation sekventering teknikker er i rivende udvikling for at opnå en lignende beslutning til bisulfit genomiske sekventering, og tredje generation enkelt molekyle sekventering har potentialet til at gøre det muligt for en analyse af både primære DNA og metylering uden behov for bisulfit sekvensering. Men, almindeligt tilgængelige og specificity af disse teknikker er fortsat et stykke tid væk. Bisulfit genomisk sekventering er den gyldne standard i methylering analyse og er en robust protokol. Metoden har udviklet sig til det punkt, hvor de fælles problemer og begrænsninger er blevet løst, og ansøgningerne har udvidet fra individuelle gen analyser til high throughput og hele genomet analyse beskrevet af Clark et al. 2006 ^4. Fejlfinding retningslinjer og yderligere anbefalinger er skitseret i tabel 1. Det foreslås, at den optimale tilgang er i første omgang at følge de standard-protokol, og kun indføre ændringer, hvis og når der opstår et problem.

Tabel 1. Fejlfinding Retningslinjer

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type
Sodium Metabisulphite	Ajax Finechem
Hydroquinone	Merck & Co., Inc.
Wizard DNA-clean-up system	Promega Corp.