Emballage VIH ou FIV à base de constructions d'expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

Summary

Vecteurs d'expression lentiviraux sont les véhicules les plus efficaces pour différentes exprimant de façon stable des molécules effectrices ou des constructions rapporteurs à diviser et non de division des cellules de mammifères et des organismes entiers. Ici, nous fournir un protocole sur la façon d'emballer des constructions d'expression lentivector particules pseudoviral et pour transduire des cellules cibles en utilisant les particules pseudoviral.

Abstract

Comme à la norme des vecteurs plasmidiques, il est possible de transfecter lentivectors sous forme de plasmide dans les cellules à faible et à moyen terme l'efficacité pour obtenir une expression transitoire de effecteurs. Constructions d'emballage d'expression lentiviraux en particules pseudoviral, cependant, permet à la transduction du 100%, même avec difficiles à transfecter des cellules primaires, tels que, la tige et des cellules différenciées. En outre, la livraison lentiviral ne produit pas les réponses cellulaires spécifiques généralement associés à des transfections chimiques, comme la mort cellulaire résultant de la toxicité du réactif de transfection ^{1, 2.} Lorsque transduites dans des cellules cibles, la construction lentiviral s'intègre dans l'ADN génomique et fournit une expression stable de l'épingle à cheveux d'ARN (shRNA), le gène d'ADNc, microARN ou reporter ^{3, 4.} Des cellules cibles exprimant de manière stable la molécule effectrice peut être isolé à l'aide d'un marqueur sélectionnable contenue dans le vecteur d'expression construit comme puromycine ou GFP. Après psparticules eudoviral infecter les cellules cibles, ils ne peuvent pas se répliquer dans les cellules cibles, parce que les gènes viraux structuraux sont absents et les longues répétitions terminales (LTR) sont conçus pour être auto-inactivant sur ​​la transduction du ^{5, 6.}

Il ya trois principales composantes nécessaires pour l'emballage lentiviral efficace ^{1, 5, 6, 7.}

1. Le vecteur d'expression lentiviral qui contient quelques-uns des éléments génétiques nécessaires pour l'emballage, l'intégration stable de l'expression virale dans l'ADN génomique de construire, et l'expression de l'effecteur ou reporteur.
2. Les plasmides d'emballage lentiviraux qui fournissent les protéines essentielles pour la transcription et d'emballage d'une copie d'ARN du vecteur d'expression recombinant dans des particules pseudoviral. Ce protocole utilise les plasmides PPACK (SBI) qui codent pour gag, pol et rev à partir du génome du VIH ou le FIV et de stomatite vésiculeuse g de protéines (VSV-G) pour la protéine d'enveloppe virale.
3. 293TN produire r cellules (dérivé de cellules HEK 293) qui expriment l'antigène T de SV40 grande, qui est nécessaire pour la production à titre élevé lentivirale et un gène de résistance à la néomycine, utile pour resélectionner des cellules de maintenance.

Un aperçu du protocole de production virale peut être vu dans la figure 1. Production virale commence par co-transfection des cellules productrices 293TN avec le vecteur d'expression lentiviral et les plasmides d'emballage. Les particules virales sont sécrétées dans les médias. Après 48-72 heures les milieux de culture cellulaire est récolté. Débris cellulaires est enlevé à partir des milieux de culture cellulaire, et les particules virales sont précipités par centrifugation avec du PEG-il de la concentration. Produit particules sont ensuite lentiviraux titrés et peut être utilisé pour la transduction de cellules cibles. Détails de titrage virale ne sont pas inclus dans ce protocole, mais peut être trouvée à l'adresse:

ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Ce protocole a été optimisé en utilisant les produits spécifiques indiqués. D'autres réactifs peuvent être substitués, mais les mêmes résultats ne peuvent être garantis.

Protocol

1. La transfection de cellules avec des plasmides 293TN emballage et la construction d'expression

1. Graine de 7,0 à 8,0 x 10 ⁶ cellules par 15 293TN plaque de culture cm ² dans 20 ml de milieu de culture contenant du milieu DMEM additionné de 4 mM de L-glutamine, 4,5 g / l de glucose, et sérum de veau fœtal (10%) sans antibiotiques. Cultiver pendant 18-24 heures à 37 ° C avec 5% de CO _{2 de} sorte que la densité cellulaire atteint 60-80% de confluence au moment de la transfection. Dans certains cas, il peut être nécessaire à des plaques de semences de plusieurs cellules pour obtenir un titre suffisamment élevé pour que la transduction des cellules cibles.
2. Pour chaque plaque de cellules, ajouter 1,6 ml DMEM sans sérum dans un tube stérilisé à l'autoclave 2 ml Eppendorff. Ajouter 45 ul pPACKH1 ou pPACKF1 et 4,5 mg de votre lentivector construire à l'DMEM et mélanger par pipetage de haut en bas.
3. Ajouter 55 ul de PureFection dans le même tube. Vortex pendant 10 secondes. Incuber le milieu DMEM-plasmide-PureFection mélange à température ambiante fou 15 min.
4. Ajouter le DMEM-plasmide-PureFection mélange sur la plaque de culture de tissus goutte à goutte et agiter doucement pour disperser uniformément tout au long de la plaque. Retour le plat dans l'incubateur et de croître à 37 ° C avec 5% de CO _2.
5. Il n'est pas nécessaire de changer les médias après la transfection. Si votre lentivector construction exprime un gène codant pour une protéine fluorescente comme la GFP, vérifiez vos cellules sous un microscope 12-24 heures après la transfection. Vous devriez être capable de voir les cellules> 90% GFP-positives, indiquant que la transfection a été un succès.
6. Recueillir le surnageant de culture cellulaire après 48 et 72 heures dans un tube de centrifugation de 50 ml stérile. Ce surnageant de culture cellulaire contient maintenant les particules infectieuses pseudoviral. (Suivez les lignes directrices recommandées pour travailler avec la classe de protection BSL-2). Centrifuger à 1500 xg pendant 15 min à température ambiante pour obtenir un culot les débris cellulaires. Transférer le surnageant viral dans un nouveau tube, en veillant à ne pas perturber le culot.
7. Cellules 293TN qui ont été utilisés pour les emballages virale doivent être éliminés dans un container prévu à et ne doivent pas être utilisés pour d'autres séries d'emballages virale.

2. Concentration du surnageant viral

1. Ajouter 1 volume de froid (4 ° C) PEG-il Precipitation Solution Virus tous les 4 volumes de lentiviral contenant des particules surnageant. Précipitation de particules de lentiviraux de gros volumes peut être réalisé avec des tubes de 250 ml Corning centrifugeuses en polypropylène. Mélanger la solution par les temps les tubes retournant plusieurs, mais ne pas vortexer le mélange.
2. Réfrigérer la solution à 4 ° C pendant au moins 12 heures (jusqu'à 4 jours est acceptable). Ne pas secouer ou faire pivoter les tubes lors de l'étape de réfrigération.
3. Centrifuger le surnageant / PEG-il mélange à 1500 xg pendant 30 minutes à 4 ° C. Après centrifugation, les particules lentiviraux apparaît comme une pastille ou beige au fond du tube. Verser le supernatant.
4. Retirer toutes les traces de liquide par aspiration, en prenant soin de ne pas déranger les particules précipitées lentiviraux dans le culot. Des traces de résidus de PEG-il diluer le virus (réduisant ainsi le titre), mais ne sera pas atteinte à l'intégrité des cellules cibles depuis le PEG-il est inerte et non toxique.
5. Remettre en suspension et mélanger les particules en lentiviraux 1/100 du volume d'origine en utilisant le froid (4 ° C), le phosphate de stérile ou une solution saline tamponnée DMEM contenant 25 mM de tampon HEPES.
6. Aliquoter dans stériles fioles cryogéniques et conserver à -70 ° C jusqu'à ce que prêt à l'emploi.

3. Titrage virale et la transduction des cellules cibles

1. Nous recommandons titrage des particules lentiviraux avant transduction la cible des cellules d'intérêt et le calcul de la multiplicité approprié d'infection (MOI) pour les cellules cibles pour la cohérence entre les expériences. Pour titrage viral, nous vous recommandons d'utiliser des cellules HT1080 comme une ligne de commande facile à infecter positif. Plla facilité noter que le protocole titrage implique la transduction des cellules HT1080 avec une petite aliquote des particules lentiviraux vous avez emballés. Une fois que le titre est connu, les cellules cibles d'intérêt peut également être transduites avec les particules produites lentiviraux. Un protocole titrage recommandons peut être trouvé à: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Plaque de mire 50.000 cellules d'intérêt par puits dans une plaque de 24 puits dans les milieux de culture de cellules. Utiliser les médias que les cellules sont normalement cultivées in cultiver les cellules pendant la nuit à leurs conditions de culture spécifiques. Cellules doit être compris entre 50 à 70% confluente le jour de la transduction.
3. Le jour de la transduction, aspirer les médias à partir des cellules. Combinez milieu de culture avec TransDux à une concentration x 1 finale (par exemple, 2,5 TransDux ul à 500 ul de milieu de culture). Puis transférer le TransDux-CEll mélange milieu de culture dans chaque puits.
4. Introduire à la pipette le volume approprié de virus qui correspond à la MOI optimale pour les cellules cibles dans chaque puits. Si la MOI optimale est inconnue, nous vous recommandons d'essayer toute une gamme de différents IAM (comme une MOI de 1, 2 et 5 pour facile à infecter les cellules de culture de tissus, et une MOI de 1, 10 et 20 pour plus difficile à -infecter les cellules primaires). Si la concentration des particules lentiviraux n'est pas connu (tel que déterminé par un protocole titrage du virus), des volumes différents de virus peut être essayé, tels que pi 1, 2 et 5 du virus. Le virus peut rester en contact avec les cellules cibles pour un maximum de 72 heures.
5. D'autres expériences avec les cellules transduites d'intérêt cibles ne peut être intentée 72 heures après la transduction, une fois la construction virale a intégré dans le génome de la cellule hôte. Changer le support et le passage de la cible les cellules d'intérêt en fonction de leurs besoins spécifiques.

4. Les résultats représentatifs

La densité de départ des cellules 293TN est critique pour l'emballage virale réussie. 293TN cellules doit être comprise entre 60 -80% de confluence du jour de transfection (figure 2). Si les cellules sont 293TN moins de 60% de confluence, leur permettre de croître pendant quelques heures plus avant de tenter la transfection. Si les cellules sont confluentes 293TN> 80%, ils devraient être réétalées avant la transfection.

Si en utilisant une GFP lentivector exprimant, au moins 90% des cellules 293TN doit fluorescence verte 24 heures après la transfection, indiquant une transfection avec succès (figure 3). Si moins de 90% des cellules sont GFP-positives, ne pas procéder à l'étape suivante, car cela indique que la transfection n'a pas réussi, et les titres viraux sera faible. Au lieu de cela, la plaque de nouvelles cellules 293TN et recommencer, faire en sorte que les cellules 293TN sont à la densité cellulaire appropriée, avant la transfection.

Cellules 293TN peut retirer les plaques de culture tissulaire 48-72 heures après la transfection. Cela ne veut pas nuire à la production de particules lentiviraux.

Titrage avec des cellules HT1080

Les titres viraux peuvent être calculés à l'aide du kit de SBI mondial Titrage ultrarapide selon les instructions du fabricant. Ce système utilise qPCR pour mesurer l'intégration de la séquence virale WPRE à partir du vecteur lentiviral dans des cellules HT1080 et la compare à une courbe standard, basé sur une séquence de référence pour mesurer avec précision génomique unités infectieuses par ml (Figure 4).

La transduction des cellules cibles

Si vous utilisez des particules lentiviraux exprimant un marqueur GFP constitutivement active, les cellules GFP-positives devraient commencer à apparaître dans les 12-24 heures de la transduction, si la réaction est la transduction de travail. Expression de la GFP devrait se poursuivre après la construction lentiviral intègre de manière stable dans til accueillera génome de la cellule. Si transduction avec IAM différentes, la fluorescence GFP devrait approximativement correspondre à la MOI, MOI, où de faibles montrent une fluorescence GFP et moins élevés IAM présentent une augmentation de fluorescence de la GFP (figure 5).

Figure 1. Vue d'ensemble du protocole de production virale. Les plasmides d'emballage et de lentivector PPACK sont mélangés et co-transfectés dans des cellules 293TN. Après 48 -72 heures, le surnageant est recueilli virale, et les particules virales sont précipités avec du PEG-ci. Après titrage des particules lentiviraux, ils peuvent être utilisés pour transduire des cellules de la cible d'intérêt. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. L'image en contraste de phase de cellules 293TN. Densit portabley doit être comprise entre 60-80% de confluence le jour de la transfection.

Figure 3. L'image fluorescente des cellules GFP-positives 293TN 24 heures après transfection avec Purefection, pPACKH1, et une construction codant pour la GFP lentivector.

Figure 4. Résultats de qPCR WPRE et la courbe standard obtenue à l'aide du kit de SBI mondial Titrage ultrarapide pour calculer MOI et le titre correspondant de emballés particules virales.

Figure 5 images. Fluorescentes de cellules HT1080 transduites avec des quantités croissantes de lentivirus. Les images sont de 72 heures après transduction.

Discussion

Cet emballage virale et de la transduction des cellules cibles du protocole a été optimisé pour une utilisation avec des réactifs SBI emballage virales. Substitution d'autres réactifs peuvent influer sur l'issue du protocole. Ce protocole n'a été optimisé pour la production lentivirale et peut ne pas être aptes à la production d'autres types de virus ou pseudovirus.

Le succès d'emballage virale dépend de plusieurs étapes clés. Les cellules 293TN exprimer l'antigène T de SV40 grande, qui est absolument nécessaire pour la sécrétion des particules lentiviraux dans le surnageant de culture cellulaire. La densité au cours de laquelle les cellules sont 293TN au moment de la transfection est particulièrement important pour que le réactif PureFection suffisamment transférer le lentivector et des plasmides d'emballage dans les cellules. Ajout du mélange PureFection à la plaque de culture de tissus d'une manière goutte à goutte puis soigneusement tourbillonnant de la plaque est important pour la dispersion des plasmides d'emballageet de construire tout au long lentivector toutes les cellules. Défaut de façon appropriée la distribution des vecteurs peut entraîner l'insuffisance des particules lentiviraux sont produites. La réaction d'emballage virale peut être élargi pour la production de virus à titre élevé, sur la base de la surface des plaques de culture de tissus. On peut choisir de plaques de plusieurs boîtes de culture tissulaire de cellules 293TN par construction qui doit être emballé. Concentration des surnageants viraux est particulièrement utile dans la création à titre élevé de virus. Surnageant viral à partir de plusieurs plaques de cellules peuvent être combinées et concentrées pour une utilisation dans des expériences in vivo, ou pour les cellules qui sont difficiles à transduire.

Titrage les particules produites lentiviraux est important pour calculer une précision IAM à utiliser pour la transduction de cellules cibles. Connaissant la MOI qui a été utilisé dans une transduction donnée permet le dépannage dans le cas où la transduction n'est pas couronnée de succès. Par exemple, en utilisant un MOI qui esttrop faible peut entraîner dans les cellules cibles exprimant très peu de la construction d'intérêts. L'utilisation d'un MOI qui est trop élevé, cependant, peut entraîner dans les cellules cibles qui montrent des signes de stress. L'objectif est d'utiliser une MOI qui maximise l'expression de la construction d'intérêts tout en préservant la santé des cellules. Bien que nous recommandions un protocole titrage qPCR basée sur ce que les mesures copies intégrées de la construction lentiviral dans des cellules HT1080, les approches titrage d'autres peuvent également être utilisés, tels que p24 ELISA ou l'estimation du pour cent de la GFP-positives cellules.

Transduction des cellules cibles avec succès dépend également de plusieurs facteurs clés. TransDux est un réactif unique qui permet l'infection efficacités de transduction élevées, mais ce n'est pas toxique pour les cellules. TransDux peut être utilisé à la place de polybrène, qui est souvent toxique pour les cellules cibles. L'inclusion de TransDux dans la transduction des cellules cibles aide à neutraliser les charges sur les particules virales et permet le virus dans la cellules. Depuis TransDux n'est pas toxique pour les cellules, on peut permettre aux particules lentiviraux de rester en contact avec les cellules pour jusqu'à 72 heures (l'heure à laquelle les constructions virales ont intégré dans le génome de la cellule hôte), augmentant ainsi la probabilité de la des particules virales entrant dans la cellule. Pour certaines cellules difficiles à transduisent, transductions peut être répétée plusieurs jours de suite pour augmenter l'efficacité de transduction. Par exemple, transduire les cellules sur le jour 1, permettent aux cellules de se reposer le jour 2, puis transduire les cellules de nouveau le jour 3. Il est important d'attendre 72 heures après la transduction dernière avant la sélection début, d'autres expériences ou la caractérisation des cellules cibles.

Efficaces emballage virale est également dépendant de la taille de la construction lentivirale, entre l'extrémité 5 'et régions 3'LTR. Cette partie de la construction lentivirale doit être d'environ 9 kb ou moins, ce qui correspond à la taille du génome natif VIH. Le dépassement de 9 kb peut deaugmentation du titre des particules produites pseudoviral. Les nouvelles technologies, tels que les vecteurs de transposons PiggyBac, permettent un fonctionnement fiable, une intégration stable des transgènes jusqu'à 100 kb par une transfection unique. Cette approche peut être utilisée pour des constructions qui dépassent la limite de taille pour les vecteurs lentiviraux, dans les cas où il est possible de transfecter des cellules cibles, et offre l'avantage supplémentaire de ne pas nécessiter une étape de l'emballage virale ^9,10.

Les particules produites pseudoviral utilisant ce protocole sont contagieux en ce sens qu'ils peuvent infecter les types de cellules de mammifères les plus. Les produits utilisés dans le présent protocole, sont cependant de troisième génération biosécuritaire en ce qu'elles produisent non-réplicatif et auto-inactivant pseudovirus. Par conséquent, une fois dans les cellules cibles transduites ou les animaux, les cellules cibles ou des animaux ne sont pas infectieuse ou contagieuse. Substitution d'autres plasmides lentivector qui ne sont pas de troisième génération biosécuritaire est possible mais pas recommandé à partir d'une prévention des risques biotechnologiquesperspective. Le protocole de production et de la transduction virale subséquente des cellules cibles devraient être menées dans le cadre de biosécurité de niveau 2, selon les directives du NIH ^11, et les chercheurs doivent toujours porter une blouse de laboratoire et des gants lorsque vous manipulez les particules virales. Occasion cellules productrices 293TN, tubes de particules virales, et des pipettes jetables doivent être jetés dans un conteneur pour déchets biologiques. Les pipettes réutilisables et la verrerie doivent être décontaminés avec l'eau de Javel et l'autoclavage à réduire l'exposition du personnel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1