Summary
Lentiviral अभिव्यक्ति वैक्टर stably विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं स्तनधारी और पूरे जीवों में विभिन्न प्रेरक अणुओं या रिपोर्टर constructs व्यक्त करने के लिए सबसे प्रभावी वाहनों रहे हैं. यहाँ हम कैसे pseudoviral कणों में lentivector अभिव्यक्ति constructs के पैकेज के लिए और लक्ष्य pseudoviral कणों का उपयोग कर कक्षों transduce पर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Protocol
1. 293TN कक्ष की पैकेजिंग प्लास्मिड के साथ प्रोटोकॉल और अभिव्यक्ति का निर्माण
- 7.0 बीज - 8.0 x 10 15 सेमी संस्कृति DMEM 4 मिमी एल glutamine, 4.5 छ / एल ग्लूकोज, और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना भ्रूण गोजातीय सीरम (10%) के साथ पूरक मध्यम युक्त मध्यम के 20 मिलीलीटर में 2 संस्कृति प्लेट प्रति 6 293TN कोशिकाओं. 37 ° C पर 18-24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ आगे बढ़ें ताकि सेल घनत्व अभिकर्मक के समय में 60-80% confluency तक पहुँचता है. कुछ मामलों में, यह बीज कोशिकाओं की कई प्लेटें लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन के लिए एक उच्च पर्याप्त अनुमापांक प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- कक्षों की एक थाली के लिए, एक autoclaved 2 मिलीलीटर Eppendorff है ट्यूब 1.6 मिलीलीटर सीरम मुक्त DMEM है. 45 आपके lentivector है μl pPACKH1 या pPACKF1 और 4.5 μg pipetting और नीचे द्वारा DMEM और मिश्रण निर्माण जोड़ें.
- उसी ट्यूब में PureFection की 55 μl जोड़ें. 10 सेकंड के लिए भंवर. कमरे के तापमान च DMEM - PureFection - प्लास्मिड मिश्रण सेते हैंया 15 मिनट.
- ऊतक संस्कृति थाली ड्रॉप - वार और ज़ुल्फ़ धीरे थाली भर में समान रूप से फैलाने के लिए DMEM - PureFection - प्लास्मिड मिश्रण जोड़ें. इनक्यूबेटर में पकवान वापस जाएँ और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने.
- कोई अभिकर्मक के बाद मीडिया को बदलने की जरूरत है. यदि आपके lentivector निर्माण GFP की तरह एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन एन्कोडिंग व्यक्त, अभिकर्मक के बाद 12-24 घंटे एक खुर्दबीन के नीचे अपनी कोशिकाओं की जाँच करें. > 90% GFP-पॉजिटिव कोशिकाओं को देखने के लिए सक्षम हो, यह दर्शाता है कि अभिकर्मक सफल था चाहिए.
- एक 50 मिलीलीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब के बाद 48 सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और 72 घंटे में ले लीजिए. यह सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला अब संक्रामक pseudoviral कणों के शामिल हैं. 15 कमरे के तापमान पर गोली मिनट सेलुलर मलबे के लिए 1500 XG पर अपकेंद्रित्र (बीएसएल-2 सुरक्षा वर्ग के साथ काम करने के लिए सिफारिश की दिशा निर्देशों का पालन करें.). एक नया ट्यूब, गोली परेशान नहीं सुनिश्चित करने के लिए वायरल सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
- 293TN कोशिकाओं है कि वायरल पैकेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है एक biohazard कंटेनर में से निपटाया जाना चाहिए और वायरल पैकेजिंग के आगे दौर के लिए इस्तेमाल किया जा नहीं कर रहे हैं.
2. वायरल सतह पर तैरनेवाला की एकाग्रता
- ठंड की मात्रा 1 (4 डिग्री सेल्सियस) वायरस खूंटी यह वर्षा lentiviral कण युक्त सतह पर तैरनेवाला के हर 4 संस्करणों के लिए समाधान. बड़ी मात्रा से lentiviral कणों की तेज़ी Corning 250 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूबों के साथ प्राप्त किया जा सकता है. Inverting ट्यूबों कई बार द्वारा समाधान मिश्रण, लेकिन मिश्रण भंवर नहीं है.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 12 घंटे के समाधान के लिए ठण्डा (4 दिन स्वीकार्य है). क्या हिला प्रशीतन चरण के दौरान ट्यूबों को बारी बारी से या नहीं.
- 4 में 30 मिनट के लिए 1500 XG पर सतह पर तैरनेवाला मिश्रण / खूंटी अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस Centrifugation के बाद, lentiviral कणों एक बेज रंग या सफेद गोली के रूप में ट्यूब के तल पर दिखाई देगा. बाहर supernata डालोNT के.
- आकांक्षा से तरल पदार्थ के सभी निशान हटाने, देखभाल करने के लिए गोली में उपजी lentiviral कणों को परेशान नहीं. के निशान अवशिष्ट खूंटी यह वायरस कमजोर (इस प्रकार अनुमापांक को कम करने), लेकिन लक्ष्य कोशिकाओं की अखंडता को प्रभावित नहीं किया जाएगा के बाद से खूंटी यह निष्क्रिय है और विषाक्त नहीं है.
- Resuspend और मूल मात्रा का 1/100 में lentiviral कणों गठबंधन ठंड (4 सी °) का उपयोग कर, बाँझ खारा फॉस्फेट बफर या DMEM 25 मिमी HEPES बफर युक्त.
- उपयोग के लिए तैयार है जब तक बाँझ क्रायोजेनिक और -70 में दुकान डिग्री सेल्सियस शीशियों में अशेष भाजक.
3. वायरल और लक्ष्य कोशिकाओं के Titering पारगमन
- हम लक्ष्य कोशिकाओं के हित transducing और प्रयोगों के बीच स्थिरता के लिए लक्ष्य की कोशिकाओं के लिए संक्रमण का उचित बहुलता (MOI), की गणना से पहले lentiviral कणों titering सलाह देते हैं. वायरल titering के लिए, हम नियंत्रण रेखा के रूप में आसान करने के लिए संक्रमित सकारात्मक HT1080 कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं. Plकृपया ध्यान दें कि titering प्रोटोकॉल lentiviral कणों आप पैक है एक छोटे से अशेष भाजक के साथ HT1080 कोशिकाओं transducing शामिल आसानी. लक्ष्य कोशिकाओं के हित एक बार अनुमापांक जाना जाता है, भी उत्पादन lentiviral कणों के साथ transduced किया जा सकता है. : एक titering की सिफारिश प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7.
- प्लेट +५०००० लक्ष्य सेल संस्कृति मीडिया में 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की ब्याज. मीडिया का प्रयोग करें कि कोशिकाओं को सामान्य रूप से अंदर संवर्धित कर रहे हैं अपने निर्दिष्ट संस्कृति शर्तों को रातोंरात कोशिकाओं बढ़ो. कोशिकाओं के बीच 50 से 70% संगामी पारगमन का दिन होना चाहिए.
- पारगमन के दिन पर, कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण (व्यंजन). TransDux साथ एक 1 x अंतिम एकाग्रता (उदाहरण के लिए, 2.5 μl TransDux संस्कृति के माध्यम के 500 μl) के लिए मध्यम संस्कृति का मिश्रण. तब TransDux-CE हस्तांतरणकरेंगे संस्कृति मध्यम प्रत्येक अच्छी तरह से मिश्रण.
- विंदुक वायरस की उचित मात्रा है जो प्रत्येक में अच्छी तरह से लक्ष्य कोशिकाओं के लिए MOI के इष्टतम से मेल खाती है. यदि इष्टतम MOI के अज्ञात है, हम अलग Mois की एक सीमा (जैसे एक टिशू कल्चर कोशिकाओं को संक्रमित आसान करने के लिए 1, 2 और 5 के MOI, और 1, 10 और अधिक करने के लिए मुश्किल के लिए 20 के MOI के रूप में की कोशिश कर की सिफारिश प्राथमिक कोशिकाओं को संक्रमित). यदि lentiviral कणों की एकाग्रता (रूप एक वायरस titering प्रोटोकॉल के माध्यम से निर्धारित) नहीं जाना जाता है, वायरस के विभिन्न मात्रा में वायरस की 1, 2 और 5 μl रूप में की कोशिश की, कर सकते हैं. वायरस 72 घंटे के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के साथ संपर्क में रह सकते हैं.
- आगे के प्रयोगों के साथ लक्ष्य कोशिकाओं के हित transduced पारगमन के 72 घंटे बाद शुरू किया जा सकता है, एक बार वायरल निर्माण मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत किया गया है. मध्यम और लक्ष्य पारित होने के अपने विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार कोशिकाओं के हित बदलें.
4. प्रतिनिधि परिणाम
293TN कोशिकाओं के शुरू घनत्व सफल वायरल पैकेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है. 293TN कोशिकाओं के बीच 60 -80% अभिकर्मक का दिन (चित्रा 2) मिला हुआ होना चाहिए. यदि 293TN कोशिकाओं को कम से कम 60% संगामी हैं, उन्हें कुछ अधिक घंटे के लिए अभिकर्मक प्रयास करने से पहले विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. यदि 293TN कोशिकाओं> 80% संगामी हैं, वे अभिकर्मक पहले replated किया जाना चाहिए है.
एक lentivector व्यक्त GFP का उपयोग अगर, 293TN कोशिकाओं के कम से कम 90% अभिकर्मक के बाद हरी 24 घंटे प्रतिदीप्ति, एक सफल अभिकर्मक (चित्रा 3) का संकेत चाहिए. यदि कक्षों की कम से कम 90% GFP-सकारात्मक रहे हैं, अगले कदम के लिए आगे बढ़ना नहीं है क्योंकि यह इस बात का संकेत है कि अभिकर्मक सफल नहीं था, और वायरल titers कम हो जाएगा. इसके बजाय नई प्लेट 293TN कोशिकाओं, और अधिक शुरू, सुनिश्चित करें कि 293TN कोशिकाओं उचित सेल घनत्व में से पहले transfecting.
293TN कोशिकाओं से अभिकर्मक के बाद 48-72 घंटे टिशू कल्चर प्लेटें खींच सकते हैं. यह नकारात्मक में lentiviral कणों के उत्पादन को प्रभावित नहीं करता.
HT1080 कक्ष के साथ Titering
वायरल titers निर्माता के निर्देशों के अनुसार भारतीय स्टेट बैंक के ग्लोबल UltraRapid Titering किट का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है. इस प्रणाली qPCR का इस्तेमाल करने के लिए lentiviral वेक्टर से HT1080 कोशिकाओं में वायरल WPRE अनुक्रम के एकीकरण को मापने और एक मानक वक्र के लिए यह तुलना जीनोमिक संदर्भ के लिए सही मिलीग्राम प्रति संक्रामक इकाइयों (चित्रा 4) को मापने के अनुक्रम पर आधारित है,.
लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन
Lentiviral एक अनिवार्यता से सक्रिय GFP मार्कर व्यक्त कणों का उपयोग अगर, GFP सकारात्मक कोशिकाओं के पारगमन के 12-24 घंटे के भीतर प्रदर्शित होने शुरू, अगर पारगमन प्रतिक्रिया काम कर रहा है. GFP अभिव्यक्ति के बाद lentiviral निर्माण stably टी में एकीकृत जारी रखना चाहिएवह सेल जीनोम की मेजबानी. अगर अलग Mois साथ transducing, GFP प्रतिदीप्ति लगभग MOI, जहां कम Mois कम GFP प्रतिदीप्ति और उच्च Mois दिखा शो GFP प्रतिदीप्ति (चित्रा 5) बढ़ मैच चाहिए.
चित्रा 1 वायरल उत्पादन प्रोटोकॉल का अवलोकन. lentivector और pPACK पैकेजिंग प्लास्मिड और मिश्रित कर रहे हैं 293TN कोशिकाओं में सह ट्रांसफ़ेक्ट. 48 -72 घंटे के बाद, वायरल सतह पर तैरनेवाला एकत्र की है, और वायरल कणों खूंटी यह उपजी हैं. Lentiviral कणों titering के बाद, वे ब्याज कोशिकाओं लक्ष्य transduce इस्तेमाल किया जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 293TN कोशिकाओं के चरण 2. इसके विपरीत छवि. सेल density के 60-80% संगामी अभिकर्मक के दिन के बीच होना चाहिए.
चित्रा 3 अभिकर्मक के बाद 24 घंटे Purefection, pPACKH1, और एक lentivector निर्माण एन्कोडिंग GFP के साथ GFP-सकारात्मक 293TN कोशिकाओं की प्रतिदीप्त छवि.
चित्रा 4 WPRE qPCR परिणाम और मानक वक्र प्राप्त एसबीआई विश्व UltraRapid Titering किट का उपयोग कर MOI और पैक वायरल कणों की इसी अनुमापांक के गणना.
HT1080 कोशिकाओं के चित्रा 5 प्रतिदीप्त छवियों lentivirus की बढ़ती मात्रा के साथ transduced. छवियाँ 72 घंटे के पारगमन के बाद से कर रहे हैं.
Discussion
इस वायरल पैकेजिंग और लक्ष्य कोशिकाओं प्रोटोकॉल के पारगमन को एसबीआई वायरल पैकेजिंग अभिकर्मकों के साथ प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. अन्य अभिकर्मकों के प्रतिस्थापन प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रभावित कर सकता है. यह प्रोटोकॉल केवल से lentiviral उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया है और हो वायरस या pseudoviruses के अन्य प्रकार के उत्पादन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता.
सफल वायरल पैकेजिंग कई महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर है. 293TN कोशिकाओं SV40 बड़ी टी प्रतिजन, जो बिल्कुल सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में lentiviral कणों के स्राव के लिए आवश्यक है व्यक्त करते हैं. घनत्व जिस पर 293TN कोशिकाओं अभिकर्मक के समय में कर रहे हैं PureFection अभिकर्मक के लिए आदेश में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के लिए पर्याप्त और कोशिकाओं में lentivector के पैकेजिंग प्लास्मिड हस्तांतरण. एक बूंद के लिहाज से अच्छी तरह से थाली घूमता के बाद ढंग से टिशू कल्चर थाली लिए PureFection मिश्रण जोड़ने से पैकेजिंग plasmids के प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैऔर lentivector कोशिकाओं के सभी भर में निर्माण. वैक्टर करने के लिए उचित रूप से वितरित करने में विफलता अपर्याप्त lentiviral कणों का उत्पादन किया जा रहा में परिणाम कर सकते हैं. वायरल पैकेजिंग प्रतिक्रिया उच्च अनुमापांक वायरस के उत्पादन के लिए बढ़ाया जा सकता है ऊतक संस्कृति प्लेट की सतह क्षेत्र के आधार पर. एक थाली है निर्माण करने के लिए पैक किया जाना चाहिए प्रति 293TN कोशिकाओं के कई ऊतक संस्कृति बर्तन करने के लिए चुन सकते हैं. वायरल supernatants की एकाग्रता विशेष रूप से उच्च अनुमापांक वायरस बनाने में सहायक है. कोशिकाओं के कई प्लेटों से वायरल सतह पर तैरनेवाला और संयुक्त में, vivo प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है, या कोशिकाओं है कि transduce मुश्किल कर रहे हैं के लिए.
उत्पादन lentiviral कणों Titering एक सही MOI के लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन के लिए उपयोग की गणना के लिए महत्वपूर्ण है. MOI जानते हुए भी कि किसी दिए गए पारगमन में इस्तेमाल किया गया था इस घटना में है कि पारगमन सफल नहीं है में समस्या निवारण सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एक MOI है कि का उपयोगबहुत कम बहुत कुछ लक्ष्य निर्माण के हित व्यक्त कोशिकाओं में हो सकता है. एक MOI कि बहुत अधिक है का प्रयोग, तथापि, लक्ष्य कोशिकाओं है कि तनाव के लक्षण दिखाने में परिणाम कर सकते हैं. लक्ष्य एक MOI कि अधिकतम निर्माण के ब्याज की अभिव्यक्ति है, जबकि कोशिकाओं के स्वास्थ्य के संरक्षण का उपयोग है. जब तक हम एक titering qPCR आधारित प्रोटोकॉल है कि HT1080 कोशिकाओं में lentiviral निर्माण के एकीकृत प्रतियां उपायों की सिफारिश, अन्य titering के दृष्टिकोण ऐसे p24 एलिसा या GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत के अनुमान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है,.
लक्ष्य कोशिकाओं के सफल पारगमन भी कई महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर है. TransDux एक अद्वितीय संक्रमण अभिकर्मक है कि उच्च पारगमन क्षमता के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन है कि कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है. TransDux polybrene, जो अक्सर लक्ष्य कोशिकाओं को विषाक्त के बजाय प्रयोग किया जा सकता है. TransDux के लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन में शामिल वायरल कणों पर आरोप बेअसर में मदद करता है और सेल में वायरस की अनुमति देता हैहै. के बाद से TransDux कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है, एक lentiviral कण कोशिकाओं के साथ संपर्क में रहने के लिए 72 घंटे (जो समय पर वायरल constructs मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत है) के लिए की अनुमति देते हैं, इस प्रकार की संभावना में वृद्धि कर सकते हैं वायरल कणों सेल में प्रवेश. कुछ कठिन करने के लिए transduce कोशिकाओं के लिए, transductions लगातार दिन पर दोहराया जा सकता है लिए पारगमन दक्षता को बढ़ावा देने. उदाहरण के लिए, 1 दिन कोशिकाओं transduce, कोशिकाओं 2 दिन आराम करने की अनुमति है, और तब कक्षों 3 दिन फिर transduce. यह शुरुआत चयन, आगे के प्रयोग या लक्ष्य कोशिकाओं के लक्षण वर्णन से पहले पिछले पारगमन के बाद 72 घंटे प्रतीक्षा करने के लिए महत्वपूर्ण है.
कुशल वायरल पैकेजिंग भी है है lentiviral निर्माण के आकार पर निर्भर 5 'और 3'LTR क्षेत्रों के बीच,. Lentiviral निर्माण के इस अनुभाग के लगभग 9 केबी या कम, जो देशी एचआईवी जीनोम के आकार से मेल खाती होनी चाहिए. 9 केबी सकता डे से अधिकक्रीज उत्पादन pseudoviral कणों की अनुमापांक. नई प्रौद्योगिकी, ऐसे piggyBac transposon वैक्टर के रूप में, transgenes की विश्वसनीय, स्थिर एक अभिकर्मक के माध्यम से 100 केबी के लिए एकीकरण के लिए अनुमति देते हैं. यह दृष्टिकोण constructs कि lentiviral वैक्टर आकार मामलों में जहां यह संभव है करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं transfect, सीमा से अधिक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और की आवश्यकता होती है एक वायरल पैकेजिंग 9,10 कदम नहीं की अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.
pseudoviral कणों का उत्पादन इस प्रोटोकॉल का उपयोग संक्रामक में है कि वे सबसे स्तनधारी सेल प्रकार को संक्रमित कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया उत्पादों, लेकिन तीसरी पीढ़ी BIOSAFE में है कि वे गैर replicative और स्वयं निष्क्रिय pseudoviruses के उत्पादन कर रहे हैं. इसलिए, एक बार में transduced लक्ष्य कक्षों या जानवर, लक्ष्य कक्षों या जानवरों संक्रामक या संक्रामक नहीं हैं. हालांकि एक जैव सुरक्षा से अनुशंसित नहीं है कि तीसरी पीढ़ी BIOSAFE नहीं हैं अन्य lentivector प्लास्मिड का प्रतिस्थापन संभव हैपरिप्रेक्ष्य. वायरल उत्पादन प्रोटोकॉल और लक्ष्य कोशिकाओं के बाद पारगमन जैवसुरक्षा स्तर 2 के तहत बाहर किया जाना चाहिए, एनआईएच 11 के दिशा निर्देशों के अनुसार, और शोधकर्ताओं हमेशा एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनने के लिए जब वायरल कणों से निपटने चाहिए. खेतों में प्रयुक्त किए गए 293TN उत्पादक कोशिकाओं, एक उपयुक्त biohazard कंटेनर में वायरल कणों, और प्रयोज्य pipettes ट्यूबों का निपटारा किया जाना चाहिए. पुर्नप्रयोग योग्य pipettes और कांच के बने पदार्थ ब्लीच साथ decontaminated और वाष्पदावी विसंक्रण कर्मियों के जोखिम को कम किया जाना चाहिए.
Disclosures
उत्पादन और इस वीडियो लेख को नि: शुल्क प्रवेश प्रणाली बायोसाइंसेज द्वारा प्रायोजित है.
Acknowledgments
हम इन प्रोटोकॉल के विकास और परीक्षण में उनके समर्थन के लिए कर्मचारियों और एसबीआई में वैज्ञानिकों को स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11995-073 | |
| 293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
| pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
| pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
| Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
| Purefection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 | |
| PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 | |
| Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
| TransDux | SBI | LV850A-1 |
References
- RNA Viruses. A Practical Approach. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).
- Gould, D. J., Favorov, P. Vectors for the treatment of autoimmune diseases. Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Dull, T., Zufferey, R. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Federico, M. Lentivirus Gene Engineering Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2003).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).
- Manual Titer Kit. , Available from: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf (2011).
- Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L. Jr, Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Mol. Cell Biochem. , (2011).
- NIH Office of Biotechnology Activities. Guidance on Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors. , Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2011).
