Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

Summary

Vettori di espressione lentivirali sono i veicoli più efficaci per esprimere stabilmente diverse molecole effettrici o costrutti reporter nel dividere e non la divisione delle cellule di mammiferi e di interi organismi. Qui forniamo un protocollo su come confezionare costrutti di espressione lentivector particelle pseudoviral e di trasdurre cellule bersaglio utilizzando le particelle pseudoviral.

Abstract

Come standard di vettori plasmidici, è possibile per trasfettare lentivectors in forma plasmide in cellule a basso-medio efficienza per ottenere l'espressione transiente di effettori. Costrutti di espressione di imballaggio lentivirali in particelle pseudoviral, tuttavia, consente fino al 100% trasduzione, anche difficile trasfezione le cellule, come primario, staminali, e cellule differenziate. Inoltre, la consegna lentivirale non produce le risposte cellulari specifiche tipicamente associati con trasfezioni chimici, quali la morte cellulare risultante dalla tossicità del reagente di trasfezione ^{1, 2.} Quando trasdotta in cellule bersaglio, il costrutto lentivirale integra nel DNA genomico e fornisce espressione stabile del forcina RNA piccolo (shRNA), gene cDNA, microRNA reporter o ^{3, 4.} Le cellule bersaglio esprimono stabilmente la molecola effettrice può essere isolato utilizzando un marcatore selezionabile contenuta nel costrutto vettore di espressione come puromicina o GFP. Dopo la psparticelle eudoviral infettare cellule bersaglio, non possono replicarsi all'interno di cellule bersaglio perché i geni virali strutturali sono assenti e le ripetizioni terminali lunghe (LTR) sono progettati per essere auto-inattivante sulla trasduzione ^{5, 6.}

Ci sono tre componenti principali necessari per imballaggio efficiente lentivirale ^{1, 5, 6, 7.}

1. Il vettore di espressione lentivirale che contiene alcuni degli elementi genetici necessari per il confezionamento, l'integrazione stabile del costrutto di espressione virale nel DNA genomico, e l'espressione del effettrice o reporter.
2. I plasmidi di imballaggio lentivirali che forniscono le proteine ​​essenziali per la trascrizione e confezionamento di una copia di RNA del costrutto di espressione ricombinanti in particelle pseudoviral. Questo protocollo utilizza il plasmidi PPACK (SBI) che codificano per gag, pol, e riv dal genoma di HIV o FIV e proteine ​​di virus stomatite vescicolare g (VSV-G) per la proteina di rivestimento virale.
3. 293TN produrre r (cellule derivate da cellule HEK293) che esprimono la SV40 antigene T grande, che è richiesto per la produzione ad alto titolo lentivirale e un gene di resistenza a neomicina, utile per riselezionare le celle per la manutenzione.

Una panoramica del protocollo produzione virale può essere visto in Figura 1. Produzione virale inizia co-trasfezione di cellule produttrici 293TN con il vettore di espressione lentivirale ed i plasmidi confezionamento. Particelle virali vengono secreti nei media. Dopo 48-72 ore i mezzi di coltura cellulare viene raccolta. Detriti cellulare viene rimosso dal supporto di coltura cellulare, e le particelle virali vengono precipitati tramite centrifugazione con PEG-per concentrazione. Prodotte particelle lentivirali vengono poi titolati e può essere utilizzato per trasdurre cellule bersaglio. Dettagli di titolazione virale non sono inclusi in questo protocollo, ma si possono trovare all'indirizzo:

ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando i prodotti specifici indicati. Altri reagenti possono essere sostituiti, ma gli stessi risultati non può essere garantita.

Protocol

1. Trasfezione di cellule 293TN con i plasmidi di imballaggio e il costrutto di espressione

1. Seme 7,0-8,0 x 10 ⁶ cellule per 293TN 15 cm ² piastra di coltura in 20 ml di terreno di coltura contenente DMEM supplementato con 4 mM L-glutammina, 4,5 g / l glucosio, e siero fetale bovino (10%) senza antibiotici. Crescere per 18-24 ore a 37 ° C con 5% CO _{2 in} modo che la densità cellulare raggiunge il 60-80% di confluenza al momento della transfezione. In alcuni casi, potrebbe essere necessario piastre semi diversi di cellule per ottenere un alto titolo sufficiente per la trasduzione delle cellule bersaglio.
2. Per ogni piatto di cellule, aggiungere 1,6 ml di siero-free DMEM ad un tubo sterilizzato 2 ml Eppendorff. Aggiungere 45 microlitri pPACKH1 o pPACKF1 e 4,5 microgrammi di costruire il tuo lentivector al DMEM e mescolare pipettando su e giù.
3. Aggiungere 55 pl di PureFection nel tubo stesso. Vortex per 10 secondi. Incubare il plasmide-PureFection DMEM f miscela a temperatura ambienteo 15 min.
4. Aggiungere il plasmide-PureFection DMEM miscela alla piastra di coltura tissutale e goccia a goccia e agitare delicatamente per disperdere in modo uniforme in tutto il piatto. Ritorna il piatto per l'incubatore e di crescere a 37 ° C con 5% di CO _2.
5. Non è necessario modificare il media dopo trasfezione. Se il costrutto lentivector esprime un gene che codifica una proteina fluorescente GFP come, controllare le cellule sotto il microscopio 12-24 ore dopo la trasfezione. Dovreste essere in grado di vedere le cellule> 90% GFP-positive, indicando che la transfezione ha avuto successo.
6. Raccogliere il supernatante di coltura cellulare dopo 48 e 72 ore in una provetta da centrifuga 50 ml sterile. Il supernatante di coltura cellulare contiene ora particelle infettive pseudoviral. (Seguire le linee guida consigliate per lavorare con classe di sicurezza BSL-2.) Centrifugare a 1500 xg per 15 minuti a temperatura ambiente per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante virale in una nuova provetta, assicurando non disturbare il pellet.
7. 293TN cellule che sono state usate per il confezionamento virale devono essere smaltiti in un contenitore rischio biologico e non devono essere utilizzati per cicli di confezionamento virale.

2. Concentrazione del surnatante virale

1. Aggiungere 1 volume di freddo (4 ° C) PEG-it soluzione precipitazioni Virus per ogni 4 volumi di lentivirale contenente particelle supernatante. Precipitazione di particelle lentivirali da grandi volumi può essere realizzato con Corning 250 provette per centrifuga in polipropilene ml. Mescolare la soluzione invertendo i tubi diverse volte, ma non vortex la miscela.
2. Refrigerare la soluzione a 4 ° C per almeno 12 ore (fino a 4 giorni è accettabile). Non agitare o ruotare i tubi durante la fase di refrigerazione.
3. Centrifugare il supernatante / PEG-si miscela a 1.500 xg per 30 minuti a 4 ° C. Dopo centrifugazione, le particelle lentivirali apparirà come un beige o bianco pellet sul fondo del tubo. Versare il supernatant.
4. Eliminare tutte le tracce di liquido per aspirazione, facendo attenzione a non disturbare le particelle precipitate lentivirali nel pellet. Tracce di residuo PEG-verrà diluire il virus (riducendo così il titolo), ma non compromette l'integrità delle cellule bersaglio dal PEG-è inerte e non tossico.
5. Risospendere e combinare le particelle lentivirali in 1/100 del volume originale usando freddo (4 ° C), fosfato sterile o soluzione salina tamponata con DMEM contenente 25 mM di tampone HEPES.
6. Aliquotare in fiale sterili criogenici e conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso.

3. Titolazione virale e trasduzione delle cellule bersaglio

1. Si consiglia di titolazione delle particelle lentivirali prima trasduzione celle di destinazione d'interesse e calcolando la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per le cellule bersaglio per la coerenza tra esperimenti. Per la titolazione virale, si consiglia di utilizzare le cellule HT1080 come facile da infettare positivo linea di controllo. Plfacilità di notare che il protocollo di titolazione coinvolge trasduzione HT1080 cellule con una piccola aliquota delle particelle lentivirali che hai confezionato. Una volta che il titolo è noto, le cellule bersaglio d'interesse può anche essere trasdotti con le particelle prodotte lentivirali. Un consiglio protocollo titolazione è disponibile all'indirizzo: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Piatto 50.000 cellule bersaglio d'interesse per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in terreni di coltura delle cellule. Utilizzare i mezzi di comunicazione che le cellule sono normalmente coltivate dentro crescere le cellule durante la notte nelle loro specifiche condizioni di coltura. Le cellule devono essere tra il 50 al 70% confluenti il ​​giorno di trasduzione.
3. Il giorno di trasduzione, aspirare i mezzi dalle cellule. Combinare mezzo di coltura con TransDux ad una concentrazione finale di 1 x (per esempio, 2,5 TransDux pl a 500 pl di mezzo di coltura). Poi trasferire il TransDux ce-ll mezzo di miscela di coltura in ciascun pozzetto.
4. Pipettare il volume appropriato di virus che corrisponde alla MOI ottimale per le cellule bersaglio in ciascun pozzetto. Se la MOI ottimale è sconosciuto, si consiglia di provare una gamma di MOI diversi (ad esempio un MOI di 1, 2 e 5 per facili da infettare-colture tissutali, e un MOI di 1, 10 e 20 per più di difficile -infettare le cellule primarie). Se la concentrazione delle particelle lentivirali non è nota (come determinato mediante un protocollo di titolazione virus), diversi volumi di virus può essere processato, come pl 1, 2 e 5 di virus. Virus può rimanere in contatto con le cellule bersaglio fino a 72 ore.
5. Ulteriori esperimenti con le cellule trasdotte-di-interesse bersaglio può essere iniziata 72 ore dopo la trasduzione, una volta che il costrutto virale è integrato nel genoma della cellula ospite. Modificare il medium e il passaggio celle di destinazione d'interesse in base alle loro specifiche esigenze.

4. Risultati rappresentativi

La densità iniziale delle cellule 293TN critiche per imballaggio virale. Cellule 293TN deve essere compresa tra 60% -80 confluenti il giorno di trasfezione (Figura 2). Se le cellule 293TN sono inferiori al 60% confluenti, permettere loro di crescere per qualche ora in più prima di tentare la transfezione. Se le cellule confluenti sono 293TN> 80%, devono essere ripiastrate prima della transfezione.

Se si utilizza un GFP lentivector esprime, almeno il 90% delle cellule 293TN dovrebbero fluorescenza verde 24 ore dopo la trasfezione, indicando una trasfezione con successo (Figura 3). Se meno del 90% delle cellule sono GFP-positive, non procedere alla fase successiva, perché questo indica che la trasfezione non ha avuto successo, i titoli virali e sarà basso. Invece, piastre nuove cellule 293TN e ricominciare da capo, facendo in modo che le cellule 293TN sono la densità delle cellule corretto prima di trasfezione.

Cellule 293TN può tirare fuori le piastre di coltura di tessuto 48-72 ore dopo la trasfezione. Ciò non influisca negativamente sulla produzione di particelle lentivirali.

Titolazione con cellule HT1080

Titoli virali può essere calcolata utilizzando il kit globale SBI di Titolazione Ultrarapid secondo le istruzioni del produttore. Questo sistema utilizza qPCR per misurare l'integrazione della sequenza virale WPRE dal vettore lentivirale in HT1080 cellule e lo confronta con una curva standard, sulla base di una sequenza genomica di riferimento per misurare accuratamente unità infettive per ml (Figura 4).

Trasduzione delle cellule bersaglio

Se si utilizza particelle lentivirali che esprimono un marcatore GFP costitutivamente attiva, le cellule GFP positive iniziative dovrebbe prendere forma entro 12-24 ore di trasduzione, se la reazione di trasduzione sta lavorando. Espressione di GFP dovrebbe continuare anche dopo il costrutto lentivirale integra stabilmente in tegli ospitare genoma della cellula. Se trasduzione con MOI differenti, la fluorescenza GFP dovrebbe corrispondere approssimativamente la MOI, in cui MOI bassi mostrano fluorescenza GFP inferiore e superiore MOI mostrano un aumento di fluorescenza GFP (Figura 5).

Figura 1. Panoramica del disciplinare di produzione virale. I plasmidi di confezionamento lentivector e PPACK vengono mescolati e co-transfettato in cellule 293TN. Dopo 48 -72 ore, il surnatante virale viene raccolto, e le particelle virali vengono fatte precipitare con PEG-esso. Dopo la titolazione delle particelle lentivirali, possono essere utilizzati per trasdurre celle di destinazione d'interesse. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Contrasto di fase di cellule 293TN. Cella Density deve essere compresa tra 60-80% confluenti il ​​giorno di trasfezione.

Figura 3. Immagine fluorescente di cellule GFP-positive 293TN 24 ore dopo la trasfezione con Purefection, pPACKH1, e un lentivector codifica GFP costrutto.

Figura 4. Risultati qPCR WPRE e la curva standard ottenuta utilizzando il kit globale SBI di Titolazione Ultrarapid per calcolare MOI e titolo corrispondente confezionati particelle virali.

Immagini di Figura 5. Fluorescenti di HT1080 cellule trasdotte con quantità crescenti di lentivirus. Le immagini sono da 72 ore dopo la trasduzione.

Discussion

Questo imballaggio virale e trasduzione del protocollo di cellule bersaglio è stato ottimizzato per l'utilizzo con i reagenti SBI di imballaggi virali. Sostituzione di altri reagenti possono influenzare l'esito del protocollo. Questo protocollo è solo stato ottimizzato per la produzione lentivirale e può non essere adatto per la produzione di altri tipi di virus o pseudoviruses.

Il successo di imballaggio virale dipende diversi passaggi chiave. Le cellule 293TN esprimono il SV40 antigene T grande, che è assolutamente necessaria per la secrezione delle particelle lentivirali nel supernatante di coltura cellulare. La densità con cui le cellule sono 293TN al momento della transfezione è particolarmente importante per il reagente PureFection sufficiente per trasferire il lentivector e plasmidi confezionamento nelle cellule. Aggiungere la miscela PureFection alla piastra di coltura tissutale in un goccia a goccia modo seguito dal fondo agitando la piastra è importante per la dispersione dei plasmidi imballaggioe lentivector costruire durante tutte le celle. La mancata distribuire opportunamente i vettori possono causare insufficiente particelle lentivirali essere prodotte. La reazione imballaggio virale può essere scalato per la produzione di virus titolo alto, basato sulla superficie delle piastre di coltura dei tessuti. Si può scegliere di tessuto diversi piatti di coltura di cellule piastra 293TN per costrutto che deve essere confezionato. Concentrazione dei surnatanti virale è particolarmente utile nella creazione di alta titolo virus. Surnatante virale da piastre multiple di cellule possono essere combinati e concentrati per l'uso in esperimenti in vivo, o per cellule che sono difficili da trasdurre.

Titolazione delle particelle prodotte lentivirali è importante per calcolare un accurato MOI da utilizzare per la trasduzione delle cellule bersaglio. Sapendo che la MOI è stato utilizzato in una trasduzione dato consente risoluzione nel caso in cui la trasduzione non è riuscita. Ad esempio, utilizzando un MOI che siatroppo bassa può causare cellule bersaglio pochissimi esprimono il costrutto d'interesse. Utilizzo di un MOI che è troppo elevato, tuttavia, può causare cellule bersaglio che mostrano segni di stress. L'obiettivo è di utilizzare un MOI che massimizza l'espressione del costrutto-di-interesse preservando la salute delle cellule. Mentre si consiglia una qPCR protocollo basato titolazione che misura copie integrate lentivirale del costrutto in cellule HT1080, titolazione altri approcci possono essere utilizzati, come p24 ELISA o stima della percentuale di cellule positive-GFP.

Trasduzione delle cellule bersaglio successo dipende anche da diversi fattori chiave. TransDux è un reagente infezione unico che consente alte efficienze di trasduzione, ma che non è tossico per le cellule. TransDux può essere usato invece di polibrene, che spesso è tossica per le cellule bersaglio. L'inclusione di TransDux nella trasduzione delle cellule bersaglio aiuta a neutralizzare le cariche sulle particelle virali e permette il virus nella cellulas. Poiché TransDux non è tossico per le cellule, si può consentire alle particelle lentivirali di rimanere in contatto con le cellule per un massimo di 72 ore (il momento in cui i costrutti virali hanno integrato nel genoma della cellula ospite), aumentando così la probabilità particelle virali entrare nella cellula. Per alcuni di difficile trasdurre cellule, trasduzioni può essere ripetuta in giorni successivi per aumentare l'efficienza di trasduzione. Ad esempio, la trasduzione delle cellule al giorno 1, permettere alle cellule di riposare il giorno 2, e quindi le celle trasdurre nuovamente al giorno 3. È importante attendere 72 ore dopo la trasduzione ultima selezione prima dell'inizio, ulteriori esperimenti o caratterizzazione delle cellule bersaglio.

Efficiente imballaggio virale dipende anche dalle dimensioni del costrutto lentivirale, tra il 5 'e le regioni 3'LTR. Questa sezione del costrutto lentivirale deve essere di circa 9 kb o meno, che corrisponde alla dimensione del genoma HIV nativo. Superiore a 9 kb può depiega il titolo delle particelle prodotte pseudoviral. La nuova tecnologia, come ad esempio piggyBac vettori trasposoni, consentono affidabile, l'integrazione stabile di transgeni fino a 100 kb attraverso una singola trasfezione. Questo approccio può essere utilizzato per costrutti che superano il limite di dimensione per vettori lentivirali, nei casi in cui è possibile trasfettare cellule bersaglio, e fornisce l'ulteriore vantaggio di non richiedere una fase di confezionamento virale ^9,10.

Le particelle prodotte pseudoviral che utilizzano questo protocollo sono contagiosi, in quanto possono infettare più tipi di cellule di mammifero. I prodotti utilizzati in questo protocollo, però sono di terza generazione BIOSAFE nel senso che producono non-replicativa e di auto-inattivanti pseudoviruses. Pertanto, una volta all'interno delle cellule bersaglio trasdotte o animali, le cellule bersaglio o gli animali non sono infettive o contagiose. Sostituzione di altri plasmidi lentivector che non sono di terza generazione BIOSAFE è possibile sebbene non sia raccomandato da un biosicurezzaprospettiva. Il protocollo di produzione virale e la successiva trasduzione delle cellule bersaglio deve essere effettuata sotto livello di biosicurezza 2, secondo le linee guida NIH ^11, ei ricercatori devono sempre indossare un camice da laboratorio e guanti quando si maneggiano le particelle virali. Usate cellule produttrici 293TN, tubi di particelle virali, e pipette monouso devono essere smaltiti in un apposito contenitore a rischio biologico. Pipette di vetro riutilizzabili e devono essere decontaminati con candeggina e autoclave per ridurre l'esposizione del personale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1