Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

Summary

Vectores de expressão lentivirais são os veículos mais eficazes para expressando estavelmente diferentes moléculas efectoras ou construções repórter em divisão e não se dividem as células de mamíferos e organismos inteiros. Aqui nós fornecemos um protocolo sobre como empacotar construções de expressão lentivector em partículas pseudoviral e transdução de células alvo, utilizando as partículas pseudoviral.

Abstract

Tal como com vectores plasmídicos padrão, é possível para transfectar lentivectors em forma de plasmídeo em células com baixo a médio eficiência para obter a expressão transiente de efectores. Construções de embalagem lentivirais expressão em partículas pseudoviral, contudo, permite-se a transdução de 100%, mesmo com difícil de transfectar células, tais como caule, primário, e as células diferenciadas. Além disso, a entrega lentiviral não produz as respostas celulares específicas tipicamente associados com transfecções químicos, tais como a morte celular resultante da toxicidade do reagente de transfecção ^{1, 2.} Quando transduzida em células alvo, o construto lentiviral integra no DNA genómico e fornece a expressão estável do pequeno hairpin RNA (shRNA), microRNA, ADNc ou gene repórter ^{3, 4.} As células alvo de forma estável que expressam a molécula efectora pode ser isolado usando um marcador seleccionável contido no vector de expressão, tais como construir puromicina ou GFP. Depois pspartículas eudoviral infectar as células-alvo, eles não podem replicar dentro das células alvo, porque os genes virais estruturais estão ausentes e as repetições terminais longas (LTR) são concebidos para ser auto-inactivação após transdução ^{5, 6.}

Existem três componentes principais que são necessárias para a embalagem lentiviral eficiente ^{1, 5, 6, 7.}

1. O vector de expressão que contém lentiviral alguns dos elementos genéticos necessários para a embalagem, a integração estável do expressão viral construir no ADN genómico, e expressão do efectora ou repórter.
2. Os plasmídeos de empacotamento lentivirais que fornecem as proteínas essenciais para a transcrição e embalagem de uma cópia de RNA da construção de expressão em partículas recombinantes pseudoviral. Este protocolo utiliza a plasmídeos PPACK (SBI) que codificam para gag, pol e rev a partir do genoma do HIV ou FIV e Virus da Estomatite Vesicular g de proteína (VSV-G) para a proteína de revestimento virai.
3. 293TN produzir células r (derivado de células HEK293) que expressam o antigénio T de SV40 grande, o que é necessário para a produção de título elevado lentiviral e um gene de resistência à neomicina, útil para reselecting as células para a manutenção.

Uma visão geral do protocolo de produção virai pode ser visto na Figura 1. Produção virai começa por co-transfecção de células produtoras 293TN com o vector de expressão lentiviral e os plasmídeos de empacotamento. As partículas virais são secretados na mídia. Depois de 48-72 horas os meios de cultura de células é colhida. Detritos celulares é removido dos meios de cultura de células, e as partículas virais são precipitadas por centrifugação com PEG-lo para a concentração. Produzidos partículas lentivirais são então titulado e pode ser usado para transduzir células alvo. Detalhes da titulação viral não estão incluídos neste protocolo, mas pode ser encontrado em:

ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Este protocolo foi optimizado usando os produtos específicos indicados. Outros reagentes podem ser substituídos, mas os mesmos resultados não pode ser garantida.

Protocol

1. Transfecção de células 293TN com plasmídeos de empacotamento e a construção de expressão

1. Semente 7,0-8,0 x 10 ⁶ 293TN células por placa de cultura de 15 centímetros ² em 20 ml de meio de cultura contendo meio DMEM suplementado com 4 mM L-glutamina, 4,5 g de glicose / l, e soro fetal de bovino (10%) sem antibióticos. Crescer durante 18-24 horas a 37 ° C com 5% de CO _{2, de} modo que a densidade celular alcança 60-80% de confluência no momento da transfecção. Em alguns casos, pode ser necessário para placas de semente várias das células para se obter um título suficientemente elevado para a transdução de células alvo.
2. Para cada placa de células, adicionar 1,6 ml de DMEM isento de soro para um tubo de 2 ml autoclavado Eppendorff. Adicionar 45 mg pPACKH1 ou pPACKF1 e 4,5 ul de seu lentivector construir o DMEM e misture pipetando para cima e para baixo.
3. Adicionar 55 ul de PureFection no mesmo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar a DMEM-PureFection Plasmid-mistura em temperatura ambiente fou 15 min.
4. Adicione o DMEM-PureFection Plasmid-mistura para a placa de cultura de tecido, gota a gota e agite cuidadosamente para dispersar uniformemente em todo o prato. Retornar o prato para a incubadora e crescer a 37 ° C com 5% de CO _2.
5. Não há necessidade de alterar o suporte após a transfecção. Se a sua construção lentivector expressa um gene que codifica uma proteína fluorescente como GFP, verificar as suas células sob um microscópio de 12-24 horas após a transfecção. Deverá ser capaz de ver> células 90% GFP-positiva, indicando que a transfecção foi bem sucedida.
6. Recolher o sobrenadante da cultura celular após 48 e 72 horas em um tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante da cultura celular agora contém partículas infecciosas pseudoviral. (Seguir as orientações recomendadas para trabalhar com NBS-2 classe de segurança.) Centrifugar a 1.500 xg durante 15 min à temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante viral para um novo tubo, assegurando para não perturbar o sedimento.
7. Células 293TN que têm sido utilizados para a embalagem viral devem ser eliminados de um recipiente de risco biológico e não são para ser utilizado para outras rondas de embalagem viral.

2. Concentração do sobrenadante viral

1. Adicionar 1 volume de frio (4 ° C) de PEG-se da solução de precipitação de vírus a cada 4 volumes de sobrenadante de partícula contendo lentiviral. Precipitação de partículas lentivirais de grandes volumes pode ser conseguido com Corning 250 ml tubos de centrífuga de polipropileno. Misturar a solução por vezes invertendo os vários tubos, mas não vórtice da mistura.
2. A solução no frigorífico a 4 ° C durante pelo menos 12 horas (até 4 dias é aceitável). Não agitar ou girar os tubos durante a etapa de refrigeração.
3. Centrifugar a mistura / PEG-se o sobrenadante a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Após centrifugação, as partículas lentivirais aparecerá como um bege ou pelete branco no fundo do tubo. Despeje a supernatant.
4. Remova todos os vestígios de fluidos por aspiração, tomando cuidado para não perturbar as partículas precipitadas lentivirais no sedimento. Vestígios de residual de PEG-vai diluir o vírus (reduzindo assim a titulação), mas não vai afectar a integridade das células alvo desde PEG-é inerte e não tóxico.
5. Ressuspender e combinar as partículas lentivirais em 1/100 do volume original usando frio (4 ° C), fosfato estéril ou solução salina tamponada com DMEM contendo 25 mM de tampão HEPES.
6. Alíquota em frascos estéreis criogénicos e armazenar a -70 ° C até estar pronto para utilização.

3. A titulação viral e Transdução de células-alvo

1. Sugerimos titulação das partículas de lentivirais antes transduzir células alvo de interesse e calculando a multiplicidade apropriado de infecção (MOI) para as células-alvo para a consistência entre experiências. Para titulação viral, recomendamos o uso de células HT1080 como uma linha de controle fácil de infectar positivo. Plfacilidade notar que o protocolo de titulação envolve transduzir células HT1080 com uma pequena alíquota das partículas lentivirais tiver embalados. Uma vez que o título é conhecido, as células-alvo de interesse também podem ser transduzidas com as partículas produzidas lentivirais. Um protocolo de titulação recomendo pode ser encontrado em: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Placa de 50.000 células-alvo de interesse por poço numa placa de 24 poços em meios de cultura de células. Utilize os meios de comunicação que as células são normalmente cultivadas dentro crescer as células durante a noite em suas condições de cultura especificadas. Células deve ser entre 50 a 70% confluentes no dia da transdução.
3. No dia da transdução, aspirar os meios de comunicação das células. Combinar meio de cultura com TransDux a uma concentração final de 1 x (por exemplo, 2,5 TransDux uL a 500 uL de meio de cultura). Em seguida, transferir o TransDux-cemistura médio ll cultura a cada poço.
4. Pipetar o volume apropriado de vírus que corresponde ao óptimo MOI para as células-alvo em cada poço. Se o MOI óptima é desconhecida, é recomendável tentar uma gama de MOIs diferentes (tal como um MOI de 1, 2 e 5, para fácil de infectar as células de cultura de tecidos, e uma MOI de 1, 10 e 20 para mais difícil -infectar as células primárias). Se a concentração das partículas lentivirais não é conhecido (tal como determinado através de um protocolo de titulação do vírus), diferentes volumes de vírus pode ser tentado, tal como 1, 2 e 5 ul de vírus. O vírus pode permanecer em contacto com as células-alvo por até 72 horas.
5. Outras experiências com a células transduzidas de interesse-alvo pode ser iniciado 72 horas após a transdução, uma vez que o construto viral tem integrado no genoma da célula hospedeira. Alterar a médio e passagem a células alvo de interesse de acordo com suas necessidades específicas.

4. Os resultados representativos

A densidade de partida das células 293TN é crítica para a embalagem viral bem sucedida. Células 293TN deve estar entre 60 -80% confluentes no dia da transfecção (Figura 2). Se as células 293TN são menos do que 60% confluentes, permitir-lhes a crescer durante mais algumas horas antes de se tentar a transfecção. Se as células são 293TN> confluente a 80%, eles devem ser replated antes da transfecção.

Se usando um GFP lentivector expressando, pelo menos 90% das células 293TN deve fluorescência verde 24 horas após a transfecção, indicando uma transfecção bem sucedida (Figura 3). Se menos de 90% das células são GFP-positiva, não se prosseguir para o passo seguinte, porque isso indica que a transfecção não foi bem sucedida, e os títulos virais será baixa. Em vez disso, placas novas células 293TN e começar de novo, certificando-se que as células 293TN estão na densidade celular adequada antes da transfecção.

Células 293TN podem retirar as placas de cultura de tecidos de 48-72 horas após a transfecção. Isso não afeta negativamente a produção de partículas lentivirais.

Titulação com células HT1080

Os títulos virais pode ser calculada usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida de acordo com as instruções do fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir a integração virai da sequência WPRE a partir do vector lentiviral em células HT1080 e compara esta com uma curva padrão, com base numa sequência de referência genómico para medir com precisão unidades infecciosas por ml (Figura 4).

Transdução de células alvo

Se o uso de partículas lentivirais que expressam um marcador GFP constitutivamente activa, células GFP positivas devem começam a aparecer dentro de 12-24 horas de transdução, se a reacção de transdução está a funcionar. Expressão GFP deve continuar após a construção lentiviral estavelmente integra-se tele hospedar genoma da célula. Se transdução com MOIs diferentes, a fluorescência da GFP deve coincidir com a aproximadamente MOI, em que MOI baixas mostram fluorescência menos GFP e MOIs superiores mostram aumento GFP de fluorescência (Figura 5).

Figura 1. Visão geral do protocolo de produção viral. Os plasmídeos de empacotamento lentivector e PPACK são misturados e co-transfectados em células 293TN. Depois de 48 -72 horas, o sobrenadante viral é recolhido, e partículas virais são precipitadas com PEG-lo. Após titulação das partículas de lentivirais, eles podem ser usados ​​para transduzir células-alvo de interesse. para ver figura maior .

Figura 2. Imagem de contraste de fase das células 293TN. Densit celulary deverá estar entre 60-80% confluentes no dia da transfecção.

Figura 3. Imagem fluorescente de células GFP positivas 293TN 24 horas após a transfecção com Purefection, pPACKH1, e uma codificação de GFP lentivector construto.

Figura 4. Resultados qPCR WPRE e curva padrão obtida usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida para calcular MOI e titulação correspondente de embalados partículas virais.

Figura 5. Imagens fluorescentes das células HT1080 transduzidas com quantidades crescentes de lentivírus. As imagens são de 72 horas pós-transdução.

Discussion

Esta embalagem viral e transdução de protocolo de células-alvo foi otimizado para uso com reagentes virais SBI da embalagem. A substituição de outros reagentes podem afectar o resultado do protocolo. Este protocolo só foi optimizado para a produção de lentiviral e pode não ser adequado para produzir outros tipos de vírus ou pseudoviruses.

Embalagem viral de sucesso é dependente de vários passos-chave. As células 293TN expressar o antigénio T de SV40 grande, o que é absolutamente necessário para a secreção das partículas lentivirais para o sobrenadante da cultura celular. A densidade a qual as células são 293TN no momento da transfecção é especialmente importante para que o reagente PureFection para transferir o suficientemente lentivector e plasmídeos de embalagem para as células. Adicionando-se a mistura PureFection à placa de cultura de tecido de uma maneira gota a gota, seguido por agitação completamente a placa é importante para a dispersão dos plasmídeos de empacotamentoe lentivector construir longo de todas as células. A falta de apropriadamente distribuir os vectores podem resultar em partículas insuficientes lentivirais sendo produzidos. A reacção de embalagem viral pode ser dimensionada para cima para a produção de vírus de título elevado, com base na área de superfície das placas de cultura de tecidos. Pode-se escolher a placa pratos de tecido de cultura de várias células 293TN por construção que tem de ser embalado. Concentração dos sobrenadantes virais é especialmente útil na criação de alta título de vírus. Sobrenadante viral a partir de placas múltiplas de células podem ser combinadas e concentradas para utilização em experiências in vivo, ou para as células que são difíceis de transduzir.

Titulação das partículas produzidas lentivirais é importante para o cálculo preciso uma MOI para usar para a transdução de células alvo. Conhecendo o MOI que foi usado na transdução de uma dada permite solução de problemas no caso em que a transdução não é bem sucedido. Por exemplo, usando uma MOI que édemasiado baixa pode resultar em células alvo que expressam muito poucos o constructo de interesse. Usando uma MOI que é demasiado elevado, no entanto, pode resultar em células alvo que mostram sinais de stress. O objectivo é usar uma MOI que maximiza a expressão do construto de interesse, preservando a saúde das células. Embora recomendamos um protocolo de titulação qPCR baseado que mede cópias integradas do construto lentiviral em células HT1080, as abordagens titulação outros podem também ser utilizados, tais como ELISA p24 ou estimativa da percentagem de células positivas para GFP.

Transdução de sucesso das células-alvo também depende vários fatores importantes. TransDux é um reagente de infecção único que permite eficiências de transdução elevados, mas que não é tóxico para as células. TransDux pode ser usado em vez de polibreno, que é frequentemente tóxicos para as células-alvo. A inclusão de TransDux na transdução das células alvo ajuda a neutralizar cargas sobre as partículas virais e permite que o vírus na células. Uma vez que TransDux não é tóxico para as células, pode-se permitir que as partículas lentivirais a permanecer em contacto com as células durante até 72 horas (o tempo em que as construções virais foram integrados no genoma da célula hospedeira), aumentando assim a probabilidade de o partículas virais de entrar na célula. Para algumas células de difícil transduzir, transduções pode ser repetido em dias sucessivos para aumentar a eficiência de transdução. Por exemplo, transduzir as células no dia 1, permitir que as células para descansar no dia 2 e, em seguida transduzir as células novamente no dia 3. É importante que esperar 72 horas após a transdução última antes da selecção início, experiências adicionais ou caracterização das células alvo.

Embalagem viral eficiente é também dependente do tamanho do construto lentiviral, entre a 5 'e as regiões LTR 3'. Esta secção do construto lentiviral deve ser de aproximadamente 9 kb ou menos, o que corresponde ao tamanho do genoma do HIV nativo. Superior a 9 de maio de kbtítulo vinque o das partículas produzidas pseudoviral. A nova tecnologia, tais como vectores piggyBac transposão, permitir a integração, fiável estável de transgenes até 100 kb, através de uma transfecção único. Esta abordagem pode ser utilizada para construções que excedem o limite de tamanho para lentivirais, nos casos em que é possível transfectar células alvo, e proporciona a vantagem adicional de não necessitar de um passo de embalagem viral ^9,10.

As partículas pseudoviral produzidos utilizando este protocolo são infecciosas em que eles podem infectar os tipos de células mais de mamíferos. Os produtos utilizados neste protocolo, no entanto, são de terceira geração Biosafe em que eles produzem não-replicativa e auto-inativadoras pseudoviruses. Portanto, uma vez em células alvo transduzidas ou animais, as células alvo ou animais não são infecciosas ou contagiosas. A substituição de outros plasmídeos lentivector que não são de terceira geração Biosafe é possível, embora não recomendado a partir de um biossegurançaperspectiva. O protocolo de produção viral e subseqüente de transdução de células alvo deve ser realizada sob o Nível de Biossegurança 2, de acordo com as diretrizes do NIH ^11, e os pesquisadores devem sempre usar um jaleco e luvas ao manusear as partículas virais. Utilizadas células produtoras 293TN, tubos de partículas virais, e pipetas descartáveis ​​devem ser eliminados em um recipiente adequado de risco biológico. Pipetas de vidro reutilizáveis ​​e devem ser descontaminados com água sanitária e autoclave para diminuir a exposição do pessoal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1