Summary
Lentiviral ifade vektörlerinin stably memeli hücreleri ve tüm organizma bölünmesi ve non-bölünmesi farklı efektör moleküller ya da reporter yapıları ifade etmek için en etkili araçlardır. Burada pseudoviral parçacıklar lentivector ifade yapıları paketlemek için ve pseudoviral parçacıkları kullanarak hedef hücreleri transdüksiyonu için nasıl bir protokol sağlar.
Abstract
Standart plazmid vektörler de olduğu gibi, bu efektörlerinin geçici ifade elde etmek için düşük-orta verimlilik ile hücrelere plazmid formunda lentivectors transfekte etmek mümkündür. Pseudoviral partiküller halinde ambalaj lentiviral ifade yapıları, buna karşın, primer, gövde ve farklılaşmış hücreler olarak zor olan transfekte hücreleri ile,% 100 transdüksiyon kadar sağlar. Dahası, tipik olarak bu tür dağıtım lentiviral transfeksiyon reaktifi 1, 2 toksisitesi kaynaklanan hücre ölümü gibi kimyasal Transfeksiyonlar, ile ilişkili özel hücresel yanıtları üretmemektedir. Hedef hücrelere transdük zaman, lentiviral yapı genomik DNA entegre ve küçük bir firkete RNA (shRNA), cDNA, mikroRNA ya da reporter gene 3, 4 ve stabil ifadesi sağlar. Stably efektör molekülü ifade hedef hücreler gibi ekspresyon vektörü puromycin veya GFP olarak inşa içinde bulunan bir seçilebilir işaretleyici kullanılarak izole edilebilir. Sonra psViral yapısal genler bulunmadığı ve uzun terminali tekrarlar (LTR) transdüksiyonu 5, 6 halinde kendi kendine inaktive olacak şekilde tasarlanmıştır, çünkü eudoviral parçacıkların hücreleri enfekte hedefi, bunlar hedef hücreler içindeki çoğaltmak olamaz.
Verimli lentiviral ambalaj 1, 5, 6, 7 için gerekli olan üç ana bileşen vardır.
- Ambalaj için gerekli olan genetik öğeleri içeren bazı lentiviral ifade vektörü, viral ifade stabil entegrasyon genomik DNA oluşturmak ve efektör ya da reporter ifadesi.
- Ifade RNA kopyası transkripsiyonu ve paketleme için gerekli proteinleri sağlamak lentiviral ambalaj rekombinant plazmid pseudoviral parçacıklar halinde inşa. Bu protokol viral kat protein için HIV veya FIV genomu ve veziküler stomatit Virüs gr protein (VSV-G) pPACK gag şifreleyen plazmit (SBI), pol, ve devir kullanır.
- 293TN üretmek Yüksek titresi lentiviral üretimi ve bakım için hücreler yeniden oluşturulması için kullanışlı bir neomisin direnç geni, gereklidir SV40 büyük T antijen, hücre ifade r (HEK293 hücrelerden türetilmiş).
Viral üretimi protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de görülebilir. Viral üretimi lentiviral ekspresyon vektörü ve ambalaj plazmit ile ko-transfekte 293TN yapımcı hücreleri tarafından başlatılır. Viral partiküllerin ortam içine salgılanan. 48-72 saat sonra, hücre kültür ortamı hasat edilir. Hücre döküntüleri hücre kültür ortamından kaldırılır ve viral partiküllerin konsantrasyonu için PEG-onunla santrifüj yoluyla çökeltilir. Üretilen lentiviral parçacıklar daha sonra titre edilmiştir ve hedef hücreler transdüksiyonu için kullanılabilir. Viral titering detayları bu protokol dahil değildir, fakat bulunabilir:
ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
Bu protokol, gösterilen özel ürünleri kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler ikame edilebilir, fakat aynı sonuçlar garanti edilemez.
Protocol
1. Ambalaj Plazmidler ile 293TN Hücreleri transfeksiyonu ve Expression Construct
- Tohum 7,0-8,0 x 10 4 mM L-glutamin, 4,5 g / l glukoz ve antibiyotikler olmadan fetal sığır serumu (% 10) ile desteklenmiş DMEM ortamı içeren kültür aracı maddesi 20 ml 15 cm 2 kültürü plakası başına 6 293TN hücreleri. Hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında konfluent% 60-80 ulaştığında, böylece 2 CO% 5 ile 37 ° C'de 18-24 saat boyunca büyür. Bazı durumlarda, hedef hücrelerin transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titresi elde etmek için hücre tohumu birkaç plakaları için gerekli olabilir.
- Her bir hücre plakası, bir otoklav 2 ml Eppendorff tüpüne 1.6 ml serum içermeyen DMEM ekleyebilir. Lütfen lentivector 45 ul pPACKH1 veya pPACKF1 ve 4.5 mikrogram aşağı pipetleme tarafından DMEM ve karıştırın inşa ekleyin.
- Aynı tüpe PureFection 55 ul ekleyin. 10 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında f DMEM-Plazmid-PureFection karışımı inkübeya da 15 dak.
- Doku kültürü plakası eşit plaka boyunca dağıtmak için hafifçe açılır bilge ve girdap DMEM-Plazmid-PureFection karışımı ekleyin. Inkübatöre çanak dönün ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de büyür.
- Transfeksiyondan sonra ortamı değiştirmek için gerek yoktur. Lütfen lentivector yapı GFP gibi bir floresan proteini kodlayan bir gen ifade varsa, 12-24 saat transfeksiyondan sonra mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Sen transfeksiyon başarılı olduğunu belirten,>% 90 GFP pozitif hücreler görmek gerekir.
- 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne steril bir hücre kültürü 48 sonrası supernatant toplamak ve 72 saat. Bu, hücre kültür yüzey artık bulaşıcı pseudoviral parçacıklar içerir. Pelet oda sıcaklığında 15 dakika hücresel enkaz 1.500 xg'de (BSL-2 emniyet sınıfı ile çalışmak için önerilen yönergeleri izleyin.) Santrifüj. Pelet bozmayacak sağlayacak yeni tüp için viral süpernatant aktarın.
- Viral ambalaj için kullanılmış olan hücre, bir 293TN biohazard kap içinde elden ve viral ambalaj daha tur için kullanılmak üzere değildir edilmelidir.
2. Viral Süpernatant konsantrasyonu
- 1 soğuk hacmi (4 ° C) lentiviral parçacık içeren süpernatant her 4 cilt için PEG-it Virüs Yağış Çözüm. Ekle Büyük miktarlar lentiviral parçacıkların Çökelti Corning 250 ml polipropilen santrifüj tüpü ile elde edilebilir. Ters tüpler tarafından bir kaç kez çözeltisi karıştırın, fakat karışımı vorteks yoktur.
- (4 güne kadar kabul edilebilir), en azından 12 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta çözelti soğutmak. Sallamayın veya soğutma adım sırasında tüpleri döndürmeyin.
- 4 de 30 dakika boyunca 1500 x g'de süpernatan / PEG-it karışımı santrifüje ° C. Santrifüjünden sonra lentiviral parçacıklar tüp alt kısmında bir bej veya beyaz bir pelet şeklinde görünür. Supernata dökmeknt.
- Pelet içinde çöken lentiviral parçacıklar rahatsız özen, aspirasyon sıvısı tüm izlerini silmek. Izleri kalıntı PEG-it virüsü seyreltik edecek (böylece titresi azaltarak) fakat PEG-etkisiz ve toksik olmayan yana hedef hücrelerin bütünlüğü etkilemez.
- Yeniden süspanse ve (4 ° C) kullanılarak soğuk orijinal hacminin 1/100 içinde lentiviral parçacıklar birleştirmek, steril fosfat tamponlu salin ya da DMEM 25 mM HEPES tampon içeren.
- Kullanıma hazır olana kadar steril kriyojenik flakon ve -70 ° C mağaza içine tablet.
3. Hedef Hücre Viral Titering ve İletimi
- Biz hedef hücrelerin-of-ilgi transducing ve deneyler arasında tutarlılık için hedef hücreler için enfeksiyon uygun çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamadan önce lentiviral parçacıklar titering öneririz. Viral titering için, bir kolay enfekte pozitif kontrol hattı olarak HT1080 hücreleri kullanmanızı öneririz. Pltitering protokolü paketledim lentiviral parçacıkların küçük bir kısım ile HT1080 hücreleri transducing içerdiğini unutmayın kolaylığı. Titresi bilinmektedir sonra, hedef hücreler-of-ilgi de üretilen lentiviral partikülleri ile transdük edilebilir. : Bir tavsiye titering protokol bulunabilir http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7.
- Hücre kültür ortamına bir 24-iyi plaka iyi başına Plaka 50.000 hedef hücrelerin-of-faiz. Hücreler normalde belirtilen kültür koşullarında in kültüre hücrelerin gecede büyümek olduğunu ortamları kullanın. Hücreler transdüksiyon gününde konfluent% 50 ile 70 arasında olmalıdır.
- Transdüksiyon gününde, hücrelerden medya aspire. Bir 1 x nihai konsantrasyon (örneğin, 2.5 ul TransDux üzere 500 ul kültür ortamı) ile TransDux ile kültür ortamı birleştirir. Sonra TransDux-ce aktarmakher oyuğa ll kültür ortamı karışımı.
- Her oyuğuna hedef hücreler için MOI optimum tekabül virüsünün uygun hacimde Pipeti. Optimum MOI bilinmiyorsa, farklı Mois bir dizi (örneğin, bir MOI 1, 2 ve 5 doku kültür hücre kolay-enfekte için, ve bir MOI daha zor-etmek için 1, 10 ve 20 olarak çalışan önermektedir ) birincil hücreleri enfekte. Lentiviral parçacıkların konsantrasyonu (gibi bir virüs titering protokolü ile belirlenir) bilinmiyorsa, virüsün farklı birimleri gibi virüs 1, 2 ve 5 ul olarak, denenebilir. Virüs 72 saate kadar için hedef hücreler ile temas halinde kalabilmektedir.
- Ile daha da deneyler hedef hücreler-of-ilgi transdük viral yapı konak hücrenin genomu içine entegre sonra, transdüksiyon 72 saat sonra başlatılabilir. Kendi özel ihtiyaçlarına göre hücre-of-ilgi orta ve geçit hedef değiştirin.
4. Temsilcisi Sonuçlar
293TN hücrelerin başlangıç yoğunluğu başarılı viral ambalaj için önemlidir. 293TN hücrelerinin transfeksiyonu gün (Şekil 2)% 60 -80 arasındaki konfluent olmalıdır. 293TN hücrelerin% 60 konfluent daha az varsa, onları transfeksiyon başlamadan önce bir kaç saat daha büyümeye olanak sağlar. 293TN hücreleri>% 80 konfluent olduklarında, transfeksiyondan önce kaplandı edilmelidir.
Bir lentivector ifade GFP kullanılıyorsa, 293TN hücrelerin en az% 90, başarılı bir transfeksiyon (Şekil 3) gösteren, transfeksiyondan 24 saat sonra, yeşil floresan gerekir. Hücrelerin% 90'ından daha az GFP-olumlu ise, bu transfeksiyon olabilecek şekilde başarılı olmadığı gösterir, ve viral titreleri düşük olacaktır, çünkü, sonraki adıma değildir. Bunun yerine, plaka yeni 293TN hücreleri ve transfekte önce 293TN hücrelerin uygun hücre yoğunluğu az olduğundan emin olarak, baştan başlamak.
293TN hücreleri 48-72 saat transfeksiyondan sonra doku kültürü plakaları çekip olabilir. Bu olumsuz lentiviral partiküllerin üretimi etkilemez.
HT1080 Hücreleri ile Titering
Viral titreleri üreticinin talimatlarına göre SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak hesaplanabilir. Bu sistem, hücreleri içine HT1080 lentiviral vektöründen WPRE sekansının viral entegrasyonu ölçmek için qPCR kullanmaktadır ve doğru bir ml için enfeksiyöz birimi (Şekil 4) ölçmek için bir genomik dizisi referans dayanan, bir standart eğri ile kıyaslar.
Hedef Hücre İletimi
Bir yapısal olarak aktif GFP işaretleyici ifade lentiviral parçacıklar kullanıyorsanız transdüksiyon reaksiyon çalışıyorsa, GFP pozitif hücrelerin, iletimi 12-24 saat içinde görünmeye başlayacaktır. Lentiviral yapı stabil t entegre sonra GFP devam etmeliO hücre genomu ev sahipliği yapacak. Farklı Mois ile transducing ise, GFP floresans yaklaşık İçişleri Bakanlığı, düşük Mois GFP floresans (Şekil 5) artış gösterirler az GFP floresans ve yüksek Mois gösterin eşleşmesi gerekir.
Şekil 1. Viral üretim protokol bakış. Lentivector ve pPACK ambalaj plazmidler karıştırılır ve 293TN hücrelerine birlikte transfekte edilir. 48 -72 saat sonra, süpernatan viral toplanır, ve viral partiküllerin PEG-it ile çökeltilir. Lentiviral parçacıklar titering sonra, hücre-of-faiz hedef transdüksiyonu için kullanılabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
293TN hücrelerinin Şekil 2. Faz kontrastlı görüntü. Hücre Density% 60-80 konfluent transfeksiyon gününde arasında olmalıdır.
Şekil 3. 24 saat Purefection, pPACKH1, ve bir kodlama GFP lentivector yapı ile transfeksiyondan sonra GFP-pozitif hücrelerinin 293TN Fluorescent görüntüsü.
Şekil 4. WPRE qPCR sonuçlar ve İçişleri Bakanlığı ve ambalajlı viral parçacıkların ilgili titresi hesaplamak için SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak elde edilen standart eğri.
HT1080 hücre Şekil 5. Floresan görüntüleri lentivirüs artan miktarlarda ile transdük. Görüntüler 72 saat sonrası transdüksiyon gelmektedir.
Discussion
Bu viral ambalaj ve hedef hücreleri protokol iletimi SBI viral ambalaj reaktifleri ile kullanım için optimize edilmiştir. Diğer ajanların ikamesi protokol sonucu etkileyebilir. Bu protokol, sadece lentiviral üretimi için optimize edilmiş ve virüsler veya pseudoviruses diğer tip üretilmesi için uygun olmayabilir.
Başarılı viral ambalaj birkaç önemli adım bağlıdır. 293TN hücrelerin hücre kültür yüzey içine lentiviral parçacıkların salgılanması için mutlaka gerekli olan SV40 büyük T antijeni eksprese eder. 293TN hücreler transfeksiyondan sırasında hangi az yoğunlukta yeterince hücrelerine lentivector ve ambalaj plazmidler aktarmak için PureFection reaktifin için özellikle önem taşımaktadır. Iyice plakası girdapladıktan takiben bir damla-akıllı şekilde doku kültür levhasına PureFection karışımı ekleme ambalaj plasmidlerin dağıtılması için önemlidirve lentivector hücrelerin tümü boyunca inşa. Uygun vektörler dağıtmak için yetmezliği üretilen yetersiz lentiviral partikülleri ile sonuçlanabilir. Viral ambalaj reaksiyon doku kültür plakaları yüzey alanı üzerine dayanan, yüksek titresi virüsünün üretimi için büyütülebilir. Bir paketlenmiş gereken yapı başına 293TN hücre plakası çeşitli doku kültürü yemekleri seçebilirsiniz. Viral süpernatantları konsantrasyonu yüksek titrede virus oluşturmada özellikle yararlıdır. Hücrelerinin birden plakalardan viral süpernatan bir araya getirilmiş ve in vivo deneyler içinde kullanım için konsantre edilebilir, veya transdüksiyonu için zordur hücreleri için.
Üretilen lentiviral parçacıklar Titering hedef hücrelerin transdüksiyonu için kullanılacak MOI doğru bir hesaplanması için de önemlidir. Belirli bir iletim kullanılabilir olduğunu bilmek MOI transdüksiyon başarılı olmadığı durumlarda giderme sağlar. Örneğin, bir MOI olduğu kullanılarakçok düşük bir yapı-of-ilgi eksprese eden çok az Hedef hücrelerin sebep olabilir. Bir MOI çok yüksek olduğu kullanarak, ancak, stres belirtilerini gösteren hedef hücreler ile sonuçlanabilir. Hedefi, bir MOI hücrelerinin sağlığı korurken yapı-of-ilgi ifadesi maksimize olduğu kullanmaktır. Bu HT1080 hücrelerinde lentiviral yapı ile entegre bir kopya ölçen bir qPCR bazlı titering protokolü önermektedir iken, diğer titering yaklaşımlar, aynı zamanda örneğin p24 ELISA veya GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi tahmin edilmesi gibi, kullanılabilirler.
Hedef hücrelerin Başarılı iletimi de birkaç önemli faktöre bağlıdır. TransDux yüksek iletim verimliliği sağlayan benzersiz bir enfeksiyon reaktif olduğunu, ancak hücreleri için toksik değildir. TransDux genellikle hedef hücreler için toksik olup polybrene, yerine kullanılabilir. Hedef hücrelerin transdüksiyonu TransDux dahil edilmesi, viral partiküllerin üzerindeki yükleri nötralize etmek için yardımcı olur ve hücre içine virüsü olanaks. TransDux hücrelere toksik değildir, çünkü bu nedenle tek bir olasılığını arttırır lentiviral partiküller 72 saate kadar (viral yapıları konak hücre genomunun içine bütünleşik olan süreyi) etmek için hücre ile temas içinde kalmalarının izin verebilir viral parçacıkların hücreye girerek. Bazı zor olan iletiminde hücreleri için transductions transdüksiyon etkinliğini artırmak için izleyen günlerde tekrar edilebilir. Örneğin, 1. günde hücreleri transdüksiyonu, hücrelerin gün 2 dayanmasına izin ve sonra 3. günde tekrar hücreleri transdüksiyonu. Bu, hedef hücrelerin seçimini başlangıcında, başka deneyler ya karakterizasyonu önce son transdüksiyon sonra 72 saat beklemek için önemlidir.
Verimli viral ambalaj 5 've 3'LTR bölgeler arasında, aynı zamanda lentiviral yapı boyutuna bağlıdır. Lentiviral yapının Bu bölüm, yerli HIV genomunun boyutu karşılık yaklaşık 9 kb veya daha az, olmalıdır. 9 kb mayıs de aşılmasıüretilen pseudoviral parçacıkların kırışıklık titresi. Yeni teknoloji, böyle piggyBac transpozon vektörler gibi, kadar tek bir transfeksiyon ile 100 kb transgenlerin güvenilir, istikrarlı bir entegrasyon için izin verir. Bu yaklaşım, hedef hücre transferinde mümkündür durumlarda lentiviral vektörler için boyut sınırı, aşan yapılar için kullanılan ve viral bir ambalaj adım 9,10 gerek kalmadan ek bir avantaj sağlar olabilir.
Bu protokol kullanılarak üretilen pseudoviral parçacıklar çoğu memeli hücre tipleri bulaşabileceğini de bulaşıcıdır. Bu protokolde kullanılan ürünler, ancak bunlar non-kopyelenebilir ve kendinden inaktive pseudoviruses üreten üçüncü nesil biosafe vardır. Bu nedenle, bir hedef hücre ya da hayvanlarda enfeksiyöz veya bulaşıcı olmayan hedef hücre ya da hayvanlarda, içine transdük. Bir biyogüvenlik tavsiye edilen olmamakla birlikte, üçüncü nesil biosafe olmayan başka lentivector plasmidlerin ikamesi mümkündürbakış açısı. Viral üretim protokolü ve hedef hücrelerin sonraki transdüksiyon NIH yönergelere 11 göre, Biyogüvenlik Seviyesi 2 altında yapılmalıdır ve viral parçacıkların tutarken araştırmacıların her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymelidir. İkinci 293TN üreticisi hücreler, viral parçacıkların, ve tek kullanımlık pipetler tüpleri uygun bir biyolojik tehlikeli kaba atılmalıdır. Yeniden pipetler ve cam suyu ile dekontamine ve personelin maruz azaltmak için otoklav edilmelidir.
Disclosures
Bu video makaleye Üretim ve Serbest Erişim Sistemi Biosciences tarafından desteklenmektedir.
Acknowledgments
Biz bu protokollerin geliştirme ve test verdikleri destek için SBI az personel ve bilim adamları kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11995-073 | |
| 293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
| pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
| pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
| Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
| Purefection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 | |
| PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 | |
| Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
| TransDux | SBI | LV850A-1 |
References
- RNA Viruses. A Practical Approach. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).
- Gould, D. J., Favorov, P. Vectors for the treatment of autoimmune diseases. Gene Therapy. 10, 912-927 (2003).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F. H. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Dull, T., Zufferey, R. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).
- Federico, M. Lentivirus Gene Engineering Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2003).
- Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors. Mol. Ther. 1, 31-38 (2000).
- Manual Titer Kit. , Available from: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf (2011).
- Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L. Jr, Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343-1348 (2010).
- Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Mol. Cell Biochem. , (2011).
- NIH Office of Biotechnology Activities. Guidance on Biosafety Considerations for Research with Lentiviral Vectors. , Available from: http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidance/LentiVirus_Containment/pdf/Lenti_Containment_Guidance.pdf (2011).
