Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

Summary

Lentivirale Expressionsvektoren sind die wirksamsten Fahrzeuge für verschiedene stabil exprimieren Effektormoleküle oder Reporter-Konstrukte in Teilen auch sich nicht teilende Säugerzellen und ganzen Organismen. Hier stellen ein Protokoll, wie lentivector Expressionskonstrukte in pseudoviral Teilchen zu verpacken und Zielzellen unter Verwendung der pseudoviral Teilchen zu transduzieren.

Abstract

Wie bei Standard-Plasmid-Vektoren, ist es möglich, lentivectors in Form Plasmid in Zellen mit niedriger bis mittlerer Wirkungsgrad zu transfizieren, um die transiente Expression von Effektoren zu erhalten. Verpackung lentiviralen Expressionskonstrukte in pseudoviral Partikel ermöglicht jedoch bis zu 100% Transduktion, auch mit schwer zu transfizierende Zellen, wie primäre, Stammzellen und differenzierten Zellen. Darüber hinaus lässt der lentiviral nicht zu den spezifischen zellulären Reaktionen typischerweise mit chemischen Transfektionen, wie der Zelltod durch Toxizität des Transfektionsreagenz ^{1, 2} verbunden. Wenn transduziert in Zielzellen, integriert das lentivirale Konstrukt in die genomische DNA und liefert eine stabile Expression des kleinen doppelsträngige RNA (shRNA), cDNA, microRNA oder Reportergen ^{3, 4.} Ziel-Zellen, die Effektor-Molekül isoliert unter Verwendung einen selektierbaren Marker in dem Expressionsvektor wie Puromycin oder GFP-Konstrukt enthalten sein. Nach pseudoviral Teilchen Zielzellen zu infizieren, können sie nicht in Zielzellen zu replizieren, da die viralen Strukturgenen fehlen und die langen terminalen Wiederholungen (LTR) ausgelegt sind, sich selbst-inaktivierende nach Transduktion ^{5, 6.}

Es gibt drei wesentliche Komponenten, die für effizienten lentiviralen Verpackung ^{1, 5, 6, 7.}

1. Die lentiviralen Expressionsvektor, der einige der genetische Elemente für eine Verpackung enthält, eine stabile Integration der viralen Expression in genomische DNA-Konstrukt, und die Expression des Effektor oder Reporter.
2. Die lentiviralen Verpackung Plasmide, die die Proteine ​​liefern wesentlich für die Transkription und Verpackung von einer RNA-Kopie des Ausdrucks in rekombinante pseudoviral Partikel zu konstruieren. Dieses Protokoll verwendet die PPACK Plasmide (SBI), die für gag codieren, pol und rev aus dem HIV-oder FIV-Genoms und vesikuläre Stomatitis Virus G-Protein (VSV-G) für das virale Hüllprotein.
3. 293TN produzieren r Zellen (abgeleitet von HEK293-Zellen), die das SV40 große T-Antigen, das für HD-Titer lentiviralen Produktion und ein Neomycin-Resistenzgen, nützlich für erneute Auswahl der Zellen für eine Wartung erforderlich ist exprimieren.

Ein Überblick über die virale Produktion Protokoll kann in 1 gesehen werden. Virale Produktion beginnt durch Co-Transfektion 293TN Produzentenzellen mit dem lentiviralen Expressionsvektor und der Verpackung Plasmide. Virale Partikel werden in das Medium sekretiert. Nach 48-72 Stunden die Zellkulturmedien geerntet wird. Zelltrümmer aus dem Zellkulturmedium entfernt, und die viralen Partikel werden durch Zentrifugation mit PEG-Konzentration es ausgefällt. Hergestellte lentiviralen Partikel werden dann titriert und kann verwendet werden, um Zielzellen zu transduzieren. Details der viralen Titerung sind nicht in diesem Protokoll enthalten, aber sind zu finden unter:

ANK "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Dieses Protokoll wurde optimiert mit den spezifischen Produkten angegeben. Andere Reagenzien können substituiert sein, aber die gleichen Ergebnisse nicht gewährleistet werden kann.

Protocol

1. Transfektion von Zellen mit 293TN Packaging Plasmide und das Expressionskonstrukt

1. Samen von 7,0 bis 8,0 x 10 ⁶ Zellen pro 293TN 15 cm ² Kulturplatte in 20 ml Kulturmedium, das DMEM-Medium mit 4 mM L-Glutamin, 4,5 g / l Glucose und fötales Rinderserum (10%) ohne Antibiotika ergänzt. Wachsen für 18-24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2, so dass die Zelldichte 60-80% Konfluenz erreicht zum Zeitpunkt der Transfektion. In einigen Fällen kann es notwendig sein, mehrere Platten Saatgut von Zellen, um eine ausreichend hohe Titer für die Transduktion von Zielzellen zu erhalten.
2. Für jede Platte von Zellen, fügen 1,6 ml serumfreiem DMEM einer autoklavierten 2 ml Eppendorff Rohr. In 45 ul pPACKH1 oder pPACKF1 und 4,5 ug Ihre lentivector zu konstruieren, um die DMEM zugeben und durch Auf-und Abpipettieren.
3. In 55 ul PureFection in das gleiche Rohr. Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren Sie die DMEM-Plasmid-PureFection Mischung bei Raumtemperatur foder 15 min.
4. Fügen Sie das DMEM-Plasmid-Mischung auf die PureFection Gewebekulturplatte tropfenweise und behutsam schwenken, um gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Senden Sie das Gericht in den Inkubator und wachsen bei 37 ° C mit 5% CO _2.
5. Es besteht keine Notwendigkeit, die Medien nach der Transfektion zu ändern. Wenn Ihr lentivector Konstrukt drückt ein Gen für ein fluoreszierendes Protein wie GFP, überprüfen Sie Ihre Zellen unter einem Mikroskop 12-24 Stunden nach der Transfektion. Sie sollten in der Lage,> 90% GFP-positive Zellen zu sehen, was darauf hinweist, dass die Transfektion erfolgreich war.
6. Sammeln der Zellkulturüberstand nach 48 und 72 Stunden in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen. Dieser Zellkulturüberstand enthält nun infektiöse Partikel pseudoviral. (Befolgen Sie die empfohlenen Richtlinien für die Arbeit mit BSL-2 Schutzklasse.) Zentrifuge bei 1.500 xg für 15 min bei Raumtemperatur zu Pellet die Zelltrümmer. Übertragen der viralen Überstand in ein neues Röhrchen, so dass nicht zu stören, um das Pellet.
7. 293TN Zellen, die für virale Verpackung verwendet wurden sollten in die dafür Behälters angeordnet sein und sind nicht für weitere Runden der viralen Verpackung verwendet werden.

2. Die Konzentration der viralen Überstand

1. Fügen Sie ein Volumen von kaltem (4 ° C) PEG-it Virus Niederschlag Lösung aller 4 Bände von lentiviralen Partikel enthaltenden Überstand. Niederschlag von lentiviralen Partikel aus großen Volumina können mit Corning 250 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen erreicht werden. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen der Röhrchen mehrere Male, aber nicht vortexen die Mischung.
2. Kühlschrank der Lösung bei 4 ° C für mindestens 12 Stunden (bis zu 4 Tage sind möglich). Nicht schütteln oder drehen die Rohre während der Kälte-Schritt.
3. Zentrifugieren der Überstand / PEG-Mischung ist bei 1.500 × g für 30 Minuten bei 4 ° C Nach der Zentrifugation werden die lentivirale Partikel als beige oder weiß Pellet am Boden des Röhrchens zu sehen. Gießen Sie das supernatant.
4. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch Absaugen, dabei nicht um die abgeschiedenen Lentivirale Partikel im Pellet zu stören. Spuren von restlichen PEG-wird das Virus verdünnen (wodurch die Titer) aber keinen Einfluss auf die Integrität der Zielzellen, da es PEG-inert ist und nicht toxisch.
5. Resuspendieren und kombinieren Sie die lentiviralen Partikeln in 1/100 des ursprünglichen Volumens mit kaltem (4 ° C), steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder DMEM mit 25 mM HEPES-Puffer.
6. Aliquotieren in sterile Kryoröhrchen und bei -70 ° C bis zur Verwendung.

3. Virale Titrierung und Transduktion von Zielzellen

1. Wir empfehlen die Titrierung Lentivirale Partikel vor Transduktion der Zielzellen-of-Interest und die Berechnung des jeweiligen Multiplizität der Infektion (MOI) für die Zielzellen für Kohärenz zwischen den Experimenten. Für virale Titerung, empfehlen wir die Verwendung HT1080-Zellen als einfach zu infizieren positive Steuerleitung. PlErleichterung fest, dass die Titrierung Protokoll transduzierenden HT1080-Zellen mit einem kleinen Aliquot der Lentivirale Partikel verpackt haben Sie sich bringt. Wenn der Titer bekannt ist, können die Zielzellen-von-Interesse auch mit den lentiviralen hergestellt Teilchen transduziert werden. : A empfehlen Titerung Protokoll finden Sie unter http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Tafel 50.000 Zielzellen-von-Interesse-pro Well in einer 24-Well-Platte in Zellkulturmedien. Verwenden Sie die Medien, dass die Zellen werden normalerweise in. wachsen die Zellen über Nacht bei ihr angegebenen Kulturbedingungen kultiviert. Die Zellen sind zwischen 50 bis 70% konfluent sein am Tag der Transduktion.
3. Am Tag der Transduktion, saugen die Medien aus den Zellen. Kombinieren Sie Kulturmedium mit TransDux zu einer Endkonzentration 1 x (z. B. 2,5 ul TransDux zu 500 ul Kulturmedium). Übertragen Sie anschließend die TransDux-CEll Kulturmedium Mischung in jede Vertiefung.
4. Pipettieren Sie das entsprechende Volumen des Virus, das auf die optimale MOI für die Zielzellen in jede Vertiefung entspricht. Wenn der optimale MOI unbekannt ist, empfehlen wir versuchen eine Reihe von verschiedenen MOI (z. B. einer MOI von 1, 2 und 5 für einfach zu infizieren Gewebekulturzellen, und einer MOI von 1, 10 und 20 für mehr schwer -primären Zellen zu infizieren). Wenn die Konzentration der lentiviralen Partikel nicht bekannt ist (wie durch einen Virus Titrierung Protokoll bestimmt) können unterschiedliche Mengen des Virus getestet, zum Beispiel 1, 2 und 5 ul-Virus werden. Das Virus kann in Kontakt mit den Zielzellen bleiben bis zu 72 Stunden.
5. Weitere Experimente mit den transduzierten Zielzellen-von-Interesse kann begonnen werden 72 Stunden nach Transduktion, wenn die viralen Konstrukts in das Genom der Wirtszelle integriert ist. Ändern Sie den mittel-und Durchgang der Zielzellen-of-Interest entsprechend ihren spezifischen Bedürfnissen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Der Ausgangspunkt Dichte der 293TN Zellen ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Verpackung. 293TN Zellen müssen zwischen 60 bis 80% konfluent Tag der Transfektion (2). Wenn die 293TN Zellen weniger als 60% konfluent sind, damit sie für ein paar Stunden, bevor die Transfektionseffizienz zu wachsen. Wenn die 293TN Zellen> 80% konfluent sind, sollten sie vor der Transfektion ausplattiert werden.

Bei Verwendung eines lentivector GFP exprimieren, sollte mindestens 90% der Zellen fluoreszieren 293TN grün 24 Stunden nach der Transfektion, die eine erfolgreiche Transfektion (Abbildung 3). Wenn weniger als 90% der Zellen GFP-positiv sind, nicht zu dem nächsten Schritt fort, da dies anzeigt, dass die Transfektion nicht erfolgreich war, und die viralen Titer niedrig sein wird. Stattdessen neue Platte 293TN Zellen und von vorn beginnen, um sicherzustellen, dass die 293TN Zellen an der richtigen Zelldichte sind vor Transfektion.

293TN Zellen können Abziehen des Gewebekulturplatten 48-72 Stunden nach der Transfektion. Dies gilt nicht negativ auf die Produktion von lentiviralen Partikeln.

Titrieren mit HT1080-Zellen

Virale Titer kann unter Verwendung SBI Global ultraschnellen Titrierung Kit nach den Anweisungen des Herstellers werden. Dieses System verwendet, um virale Integration qPCR der WPRE Sequenz aus der lentiviralen Vektors in HT1080-Zellen zu messen und vergleicht diese mit einer Standardkurve, basierend auf einer genomischen Referenzsequenz genau zu messen infektiösen Einheiten pro ml (Abbildung 4).

Transduktion von Zielzellen

Bei Verwendung von lentiviralen Partikel Ausdruck einer konstitutiv aktive GFP-Markierung, sollte GFP-positiven Zellen anfangen, innerhalb von 12-24 Stunden nach der Transduktion erscheinen, wenn die Reaktion Transduktion funktioniert. GFP-Expression sollte auch weiterhin nach dem lentiviralen Konstrukt stabil in ter Wirtszellgenom. Wenn Transduktion mit unterschiedlichen MOIs, sollte die GFP-Fluoreszenz ungefähr der MOI, wo niedrige MOIs zeigen weniger GFP-Fluoreszenz und höhere MOIs zeigen erhöhte GFP-Fluoreszenz (Abbildung 5).

1. Überblick über die virale Produktion Protokoll. Die lentivector und PPACK Verpackung Plasmide werden gemischt und in 293TN Zellen co-transfiziert. Nach 48 -72 Stunden, wird die virale Überstand gesammelt und viralen Partikel werden mit PEG-it ausgefällt. Nach Titrierung der lentiviralen Partikel, können sie verwendet, um die Zielzellen-of-Interest transduzieren werden. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. Phasenkontrast-Bild von 293TN Zellen. Zelle Density sollte zwischen 60-80% konfluent Tag der Transfektion werden.

3. Fluoreszenzbild von GFP-positiven 293TN Zellen 24 Stunden nach Transfektion mit Purefection, pPACKH1, und lentivector GFP-codierenden Konstrukts.

Abbildung 4. WPRE qPCR Ergebnisse und Standardkurve unter Verwendung SBI Global ultraschnellen Titrierung Kit MOI und entsprechende Titer von verpackten viralen Partikel berechnen.

Bild 5. Fluoreszenzbilder von HT1080-Zellen transduziert mit steigenden Mengen von Lentivirus. Bilder von 72 Stunden nach der Transduktion.

Discussion

Diese virale Verpackung und Transduktion von Zielzellen-Protokoll wurde für die Verwendung mit viralen Verpackung SBI Reagenzien optimiert. Substitution anderer Reagenzien kann Einfluss auf das Ergebnis des Protokolls. Dieses Protokoll wurde nur für lentivirale Produktion optimiert und eignet sich daher nicht für die Herstellung anderer Arten von Viren oder pseudoviruses.

Erfolgreiche viralen Verpackung hängt von mehreren wichtigen Schritte. Die 293TN Zellen exprimieren das SV40 große T-Antigen, die absolut notwendig für die Sekretion der lentiviralen Partikel in dem Zellkulturüberstand ist. Die Dichte, mit der die 293TN Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion ist besonders wichtig, um für die PureFection Reagenz ausreichend übertragen lentivector und Verpackung Plasmide in die Zellen. Hinzufügen des PureFection Mischung auf die Gewebekultur Platte in einer Art und Weise tropfenweise durch gründliches Schwenken der Platte gefolgt ist für die Verbreitung der Verpackung Plasmide wichtigund lentivector in alle Zellen zu konstruieren. Die Nichteinhaltung entsprechend zu verteilen Die Vektoren können zu einer unzureichenden Lentivirale Partikel produziert führen. Die viralen Verpackung Reaktion kann bis zur Herstellung von Virus mit hohem Titer skaliert werden, basierend auf der Oberfläche der Gewebekulturplatten. Man kann an der Platte mehrere Gewebekulturschalen von 293TN Zellen pro Konstrukt, das die verpackt werden muss, wählen. Die Konzentration der viralen Überstände ist besonders hilfreich bei der Schaffung von High-Titer-Virus. Viralem Überstand aus mehreren Platten von Zellen kombiniert und konzentriert werden zur Verwendung in in-vivo-Experimente, oder Zellen, die schwer zu transduzieren.

Titrierung der produzierten lentiviralen Partikel ist für die Berechnung eine genaue MOI für die Transduktion von Zielzellen verwenden wichtig. Die Kenntnis der MOI dass wurde in einer vorgegebenen Transduktion verwendet wird, ermöglicht Problemlösungen den Fall, dass die Transduktion nicht erfolgreich ist. Zum Beispiel, unter Verwendung eines MOI dhzu niedrig, kann in sehr wenigen Zellen, die das Ziel-Konstrukt-of-Interest führen. Mit einer MOI, die zu hoch ist, kann jedoch in Zielzellen, die Anzeichen von Stress zeigen, führen. Das Ziel ist es, ein MOI, die Expression des Konstrukts-von-Interesse maximiert und gleichzeitig die Gesundheit der Zellen zu verwenden. Während wir eine qPCR-basierte Titerung Protokoll, das integrierte Kopien des lentiviralen Konstrukt in HT1080-Zellen Maßnahmen zu empfehlen sind auch andere Ansätze Titerung auch verwendet, wie zB p24 ELISA oder Abschätzung der Prozent der GFP-positiven Zellen werden.

Erfolgreiche Transduktion von Zielzellen hängt auch von mehreren Schlüsselfaktoren. TransDux ist eine einzigartige Infektion Reagenz mit hoher Transduktionswirksamkeiten ermöglicht, aber das ist für Zellen nicht toxisch. TransDux kann anstelle von Polybren, die oft toxisch für die Zielzellen verwendet werden. Aufnahme TransDux bei der Transduktion von Zielzellen hilft Ladungen auf den viralen Teilchen zu neutralisieren und ermöglicht das Virus in die Zelles. Da TransDux nicht toxisch für die Zellen, kann man es den lentiviralen Partikel in Kontakt mit den Zellen für bis zu 72 Stunden (der Zeitpunkt, zu dem die viralen Konstrukte in das Genom der Wirtszelle integriert haben) bleiben, wodurch die Wahrscheinlichkeit der virale Partikel in die Zelle eintritt. Für manche schwer zu transduzieren Zellen können Transduktionen an aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt werden, um die Transduktionseffizienz zu steigern. Zum Beispiel transduzieren die Zellen an Tag 1, um die Zellen an Tag 2 zu liegen, und dann die Zellen transduzieren wieder am Tag 3. Es ist wichtig zu 72 Stunden nach der letzten Transduktion vor Beginn Auswahl, weitere Experimente oder Charakterisierung der Zielzellen zu warten.

Effiziente viralen Verpackung ist auch abhängig von der Größe des lentiviralen Konstrukt, zwischen dem 5 'und 3'-LTR Regionen. Dieser Abschnitt des lentiviralen Konstrukt sollte etwa 9 kb oder weniger, die der Größe des nativen HIV-Genoms entspricht. Mehr als 9 kb de MaiAnstieg der Titer der produzierten pseudoviral Partikel. Neue Technologien, wie zum Beispiel piggyBac Transposon-Vektoren, für eine zuverlässige, stabile Integration der Transgene bis zu 100 kb über ein einziges Transfektion ermöglichen. Dieser Ansatz kann für Konstrukte, die die maximale Größe für lentivirale Vektoren, in Fällen, wo es möglich ist, Zielzellen zu transfizieren überschreitet verwendet werden, und bietet den zusätzlichen Vorteil, dass keine für ein virales Verpackungsschritt ^9,10.

Die pseudoviral Teilchen erzeugt mit diesem Protokoll sind infektiös, da sie die meisten Säuger-Zelltypen zu infizieren. Die in diesem Protokoll verwendet, jedoch sind der dritten Generation in BIOSAFE, die sie produzieren nicht-replikativen und Selbst-inaktivierende pseudoviruses. Daher wird, sobald transduziert in Zielzellen oder Tieren, die Ziel-Zellen oder Tiere sind nicht infektiös oder ansteckend. Die Substitution von anderen lentivector Plasmide, die nicht der dritten Generation BIOSAFE ist möglich wenn auch nicht aus einer biologischen Sicherheit empfohlenPerspektive. Die virale Produktion Protokoll und nachfolgende Transduktion von Zielzellen sollten unter biologischen Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden, nach den NIH-Richtlinien ¹¹ und Forscher sollten immer einen Laborkittel und Handschuhe beim Umgang mit den Viruspartikeln. Gebrauchte 293TN Produzent Zellen sind Tuben von Viruspartikeln und Einwegpipetten der in einem entsprechenden Behälter für biologischen Sondermüll entsorgt werden. Wieder verwendbare Pipetten und Gläser sind mit Bleichmittel dekontaminiert werden und Autoklavieren, um die Exposition des Personals zu verringern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1