Summary
Lentiviral 표현 벡터가 안정적으로 포유 동물 세포와 전체 생명체를 나누어와 비 나누어에서 다른 이펙터 분자 또는 리포터 구조를 표현하는 가장 효과적인 수단입니다. 여기 pseudoviral 입자에 lentivector 표현 구조를 패키지하고 pseudoviral 입자를 사용하여 대상 세포를 transduce하는 방법에 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
표준 플라스미드 벡터와 마찬가지로 그것은 effectors의 일시적인 표현을 얻기 위해 로우 - 투 - 매체 효율과 세포에 플라스미드 형태 lentivectors을 transfect 수 있습니다. pseudoviral 입자로 포장 lentiviral 표현 구조 그러나, 심지어는 같은 주, 줄기, 그리고 차별화된 세포와 같은 어려운 - 투 - transfect 세포로, 100 %의 형질 도입까지 가능합니다. 또한, lentiviral 배달 일반적으로 transfection 시약 1, 2의 독성으로 인한 세포 사망과 같은 화학 transfections와 관련된 특정 세포 반응을 생산하지 않습니다. 대상 세포에 transduced 때, lentiviral 구조는 게놈 DNA에 통합하고 작은 머리핀 RNA (shRNA), cDNA, microRNA 또는 리포터 유전자 3, 4의 안정적인 표현을 제공합니다. 안정적으로 이펙터 분자를 표현 대상 세포 발현 벡터 등 puromycin 또는 GFP로서 구성에 포함된 선택 가능한 마커를 사용하여 격리 수 있습니다. 이후 PS바이러스 구조 유전자 부재이며 긴 터미널 반복합니다 (LTRs) 도입 5, 6에 따라 자체 운영을 중지시키지되도록 설계되기 때문에 eudoviral 입자가 대상 세포를 감염, 그들은 표적 세포 내에서 복제할 수 없습니다.
효율적인 lentiviral 포장 1, 5, 6, 7을 위해 필요한 세 가지 주요 구성 요소가 있습니다.
- 포장에 필요한 유전 요소의 일부를 포함 lentiviral 발현 벡터는 바이러스 표현의 안정적인 통합 게놈의 DNA로 구성하고, 효과기 또는 기자의 표현.
- 표현의 RNA 사본의 해독과 포장을 위해 필수적인 단백질을 제공 lentiviral 포장 plasmids은 재조합 pseudoviral 입자로 구성. 이 프로토콜은 바이러스 코트 단백질에 대한 HIV 또는 FIV 게놈과 기공을 갖는 구염 바이러스 g 단백질 (VSV-G)에서 pPACK 개그를 위해 인코딩 plasmids (SBI), POL, 그리고 레브를 사용합니다.
- 293TN은 생산 높은 titer lentiviral 제작 및 유지 보수를위한 세포를 reselecting에 유용 네오 마이신 저항 유전자, 필요 SV40 큰 T 항원을 표현하는 R 세포 (HEK293 세포에서 파생).
바이러스 생산 프로토콜의 개요는 그림 1에서 볼 수 있습니다. 바이러스성 생산 lentiviral 발현 벡터 및 포장 plasmids와 공동 transfecting 293TN 생산 세포에 의해 시작됩니다. 바이러스성 입자가 미디어로 분비됩니다. 48-72시간 후 세포 배양 매체가 수확됩니다. 세포 파편은 세포 배양 매체에서 삭제되고, 바이러스 입자 농도를위한 PEG-그걸로 원심 분리에 의해 시켰던 있습니다. 제작 lentiviral 입자 그런 다음 titered되고 대상 세포를 transduce하는 데 사용할 수 있습니다. 바이러스 titering의 세부 사항은이 규정에 포함되지 않지만에서 찾을 수 있습니다 :
ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
이 프로토콜은 표시된 특정 제품을 사용하여 최적화되었습니다. 기타 시약은 대체 수 있지만 동일한 결과를 보장할 수 없습니다.
Protocol
1. 포장 Plasmids있는 293TN 세포의 Transfection과 표현이 건설
- 종자 7.0-8.0 X 10 4 MM L-글루타민, 4.5 g / L 포도당과 항생제없이 태아 소 혈청 (10 %)로 보완 DMEM 매체를 포함하는 배지 20 ML에서 15cm이 문화 판 당 6 293TN 세포. 세포 밀도가 transfection시 confluency 60~80%에 도달되도록 2 5 %의 CO와 37 ° C에서 18~24시간 동안 성장. 어떤 경우에는 그것은 표적 세포의 형질 도입에 대한 높은만큼 titer를 얻기 위해 세포의 씨앗 몇 접시로 필요할 수 있습니다.
- 세포의 각 플레이트의 경우 autoclaved이 ML Eppendorff 튜브 1.6 ML 혈청이없는 DMEM를 추가합니다. 당신의 lentivector 45 μl pPACKH1 또는 pPACKF1 및 4.5 μg 아래로 pipetting 및하여 DMEM과 믹스에 건설을 추가합니다.
- 같은 튜브에 PureFection의 55 μl를 추가합니다. 10 초 동안 와동. 실내 온도 F에서 DMEM-플라스미드-PureFection 혼합물을 품어15 분.
- 조직 배양 플레이트 골고루 접시에 걸쳐 분산하여 부드럽게 드롭 현명하고 소용돌이에 DMEM-플라스미드-PureFection 혼합물을 추가하십시오. 인큐베이터에 접시를 반환 5 % CO 2와 37 ° C에서 성장.
- transfection 후 미디어를 변경할 필요는 없습니다. 당신의 lentivector 구조가 GFP와 같은 형광 단백질을 인코딩 유전자를 표현하는 경우 12-24시간 transfection 후 현미경으로 세포를 확인합니다. 당신은 transfection에 성공했다는 의미> 90% GFP 양성 세포를 볼 수 있습니다.
- 50 ML 멸균 원심 튜브에 세포 배양 48 후 뜨는 및 72 시간 수집합니다. 이것은 세포 배양 뜨는 지금 전염성 pseudoviral 입자를 포함하고 있습니다. 펠렛에 상온에서 15 분 세포 파편을위한 1,500 XG에서 (BSL-2 안전 클래스 작업에 대한 권장 지침을 따르십시오.) 원심 분리기. 펠렛을 방해하지 않도록 보장하는 새로운 튜브에 바이러스 표면에 뜨는을 전송합니다.
- 바이러스성 포장에 사용되었습니다 293TN 세포 생물 학적 용기에 폐기 및 바이러스 포장의 추가 라운드에 사용할 수 없습니다되어야합니다.
2. 바이러스성 뜨는의 농도
- 한 감기 부피 (4 ℃) lentiviral 입자 함유 뜨는의 모든 4 권까지 PEG-그것 바이러스 강수량 솔루션입니다. 추가 큰 볼륨에서 lentiviral 입자의 강수는 코닝 250 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 구현할 수 있습니다. 반전 튜브를 여러 번하여 솔루션을 섞어지만, 혼합물 와동하지.
- (최대 4 일 수용) 최소한 12 시간 동안 4 ° C에서 솔루션을 냉장. 흔들거나 냉각 단계에서 튜브를 회전하지 마십시오.
- 4에서 30 분 1,500 XG에 뜨는 / PEG-그 혼합물을 원심 ° C. 원심 분리 후, lentiviral 입자 튜브 하단의 베이지색이나 흰색 펠렛으로 표시됩니다. supernata을 붓고NT.
- 펠렛의 시켰던 lentiviral 입자를 방해하지 않도록 돌보는 열망에 의해 유체의 모든 흔적을 제거합니다. 성분이 잔류 PEG-그것이 바이러스를 희석합니다 (따라서 titer를 줄여)하지만 PEG-그것이 불활성과 독성이되지 않기 때문에 대상 세포의 무결성에 영향을주지 않습니다.
- Resuspend (4 ℃) 추위를 사용하여 원래 볼륨의 1 / 100 lentiviral 입자를 결합, 멸균 인산은 식염수 버퍼 혹은 DMEM이 25 밀리미터 HEPES 버퍼를 포함.
- 사용할 준비까지 살균 극저온 튜브와 -70에서 매장 ° C로 나누어지는.
3. 대상 세포의 바이러스성 Titering 및 형질 도입
- 우리는 표적 세포 -의 - 관심을 transducing과 실험 사이의 일관성을위한 대상 세포에 대한 감염의 적절한 다수를 (방어) 계산 전에 lentiviral 입자를 titering 좋습니다. 바이러스성 titering 위해서는 쉬운 감염 긍정적인 제어 라인으로 HT1080 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 경기수titering 프로토콜 당신이 포장했습니다 lentiviral 입자의 작은 나누어지는로 HT1080 세포를 transducing 포함합니다을 쉽게. titer가 알려져되면, 대상 세포 -의 - 관심은 또한 생산 lentiviral 입자로 transduced 수 있습니다. : 권장 titering 프로토콜에서 찾을 수 http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7.
- 세포 배양 매체에서 24 잘 판에 잘마다 플레이트 50,000 표적 세포 -의 - 관심. 세포가 정상적으로 자신의 특정 문화 상황에서 인치 배양해 세포가 하룻밤 사이에 성장하고있는 미디어를 사용하십시오. 세포는 형질 도입 당일 합류 % 70-50 사이 여야합니다.
- 형질 도입의 날에는 세포에서 미디어를 기음. 1 X 최종 농도 (예를 들어, 2.5 μl TransDux 500 문화 매체 μl)로 TransDux와 문화 매체를 결합. 그런 다음 TransDux-CE를 전송각도에 표시됩니다 배지 혼합.
- 각도에 목표 세포에 대한 방어 최적에 해당하는 바이러스의 적절한 볼륨을 피펫. 최적 입니다만 알 수있다면, 우리는 다른 MOIs의 범위 (예 : 방어 1, 2, 5의 조직 배양 세포를 손쉽게 감염을위한, 그리고 입니다만 더 어렵습 대 1, 10, 20 등 노력하는 것이 좋습니다 ) 기본 세포를 감염. lentiviral 입자의 농도는 (같은 바이러스 titering 프로토콜을 통해 결정) 알려져 있지 않은 경우, 바이러스의 서로 다른 볼륨이 같은 바이러스의 1, 2, 5 μl로 재판을받을 수 있습니다. 바이러스가 72시간에 대한 타겟 세포와 접촉에 남아있을 수 있습니다.
- 과 추가 실험 대상 세포를 중 - 관심 transduced 바이러스 구조가 숙주 세포의 게놈에 통합되면, 도입 후 72 시간 시작됩니다. 그들의 특정 요구에 따라 세포 -의 - 관심 매체와 통과 목표를 변경합니다.
4. 대표 결과
293TN 세포의 시작 밀도는 성공적인 바이러스성 포장에 중요합니다. 293TN 세포는 transfection의 날 (그림 2) % -80 60 사이에 합류해야합니다. 293TN 세포가 60 % 합류 미만의 경우 그들 transfection을 시도하기 전에 몇 시간 동안 성장할 수 있습니다. 293TN 세포가> 80 %의 합류있다면, 그들은 transfection하기 전에 replated해야합니다.
lentivector 표현 GFP를 사용하는 경우 293TN 세포의 적어도 90 %는 성공적인 transfection (그림 3)을 나타내는 transfection 후 24 시간 안에 녹색 형광한다. 세포의 미만 90 %가 GFP 양성면이 transfection이 성공적이지 않았음을 나타냅니다, 그리고 바이러스 titers 낮게되므로, 다음 단계로 진행하지 않습니다. 대신 플레이트 새로운 293TN 세포 transfecting 전에 293TN 세포가 적절한 세포 밀도에서한지 만드는 시작.
293TN 세포 48~72시간 transfection 후 조직 배양 플레이트라고 결론 지었다 수 있습니다. 이것은 부정적인 lentiviral 입자의 생산에 영향을주지 않습니다.
HT1080 세포와 Titering
바이러스성 titers는 제조 업체의 지침에 따라 SBI의 글로벌 UltraRapid Titering 키트를 사용하여 계산하실 수 있습니다. 이 시스템은 HT1080 세포로 lentiviral 벡터에서 WPRE 순서 바이러스 통합을 측정하는 qPCR을 활용하고 정확하게 ML 당 전염성 단위 (그림 4)을 측정할 수있는 게놈 참조 시퀀스를 기반으로, 표준 곡선에 이것을 비교합니다.
대상 세포의 형질 도입
constitutively 활성 GFP를 마커를 표현하는 lentiviral 입자를 사용하는 경우 형질 도입 반응이 작동하는 경우, GFP 양성 세포는 형질 도입의 12~24시간 이내에 나타나기 시작합니다. lentiviral 구조가 안정적으로 t으로 통합 후 GFP 발현은 계속한다그는 세포 게놈을 호스팅할. 다른 MOIs으로 transducing 경우, GFP 형광은 약 입니다만, 낮은 MOIs는 GFP 형광을 (그림 5) 증가 않음 이하 GFP의 형광과 높은 MOIs 표시 위치와 일치해야합니다.
그림 1. 바이러스 생산 프로토콜의 개요. lentivector 및 pPACK 포장 plasmids은 혼합 및 293TN 세포로 공동 transfected 있습니다. 48 -72 시간이 흐른 바이러스 뜨는가 수집되고, 바이러스 입자는 PEG-그것으로 시켰던 있습니다. lentiviral 입자 titering 후, 그들은 세포 -의 - 관심 대상을 transduce하는 데 사용할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .
293TN 세포의 그림 2. 위상 콘트라스트 이미지입니다. 세포 density는 60-80%의 합류 transfection 당일 사이 여야합니다.
그림 3. 24시간 Purefection, pPACKH1 및 lentivector 구조 인코딩 GFP로 transfection 후 GFP 양성 293TN 세포의 형광 이미지입니다.
그림 4. WPRE의 qPCR 결과와 방어 및 포장 바이러스 입자의 대응 titer를 계산하는 SBI의 글로벌 UltraRapid Titering 키트를 이용하여 얻은 표준 곡선.
HT1080 세포의 그림 5. 형광 이미지 lentivirus의 증가 금액으로 transduced. 이미지 72 시간 이후부터 도입입니다.
Discussion
이 바이러스성 포장 및 대상 세포 프로토콜의 도입은 SBI의 바이러스 포장 시약에서 사용하도록 최적화되었습니다. 다른 시약의 대체는 프로토콜의 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 lentiviral 생산을 위해 최적화되었으며, 바이러스 또는 pseudoviruses 다른 유형의 생산에 적합하지 않을 수 있습니다.
성공적인 바이러스성 포장은 몇 가지 주요 단계에 의존적일 수 밖에 없습니다. 293TN 세포는 세포 배양 뜨는로 lentiviral 입자의 분비 위해 절대적으로 필요한 SV40 큰 T 항원을 표현. 293TN 세포 transfection시 것인지를 밀도가 충분히 세포로 lentivector과 포장 plasmids를 전송 PureFection 시약 위해서 특히 중요합니다. 철저하게 접시를 소용돌이 치는 다음 드롭 현명한 방식으로 조직 배양 플레이트에 PureFection 혼합물을 추가하면 포장 plasmids의 분산을 위해 중요하다그리고 lentivector은 세포의 모든 전반에 걸쳐 구축. 적절하게 벡터를 배포하지 않으면 생산되고 부족한 lentiviral 입자가 발생할 수 있습니다. 바이러스성 포장 반응은 조직 배양 플레이트의 표면 면적을 기준으로, 높은 titer의 바이러스 생산을 위해 확장할 수 있습니다. 하나는 포장해야 구문 당 293TN 세포의 플레이트 여러 조직 문화 요리를 선택할 수 있습니다. 바이러스 supernatants의 농도가 높은 titer 바이러스를 만드는 데 특히 유용합니다. 세포의 여러 접시에서 바이러스성 뜨는가 결합하여 생체내 실험에서에 사용하기 위해 집중해야하거나 transduce하기 어려운 세포입니다.
생산 lentiviral 입자를 Titering하는 대상 세포의 형질 도입에 사용할 입니다만 정확한 계산을 위해 중요합니다. 특정 형질 도입에 사용되었다 그 전부다 아는 것은 형질 도입이 성공하지 못할 경우 문제 해결을 가능하게합니다. 예를 들어, 방어는 그것을 사용하는너무 낮은 구조 -의 - 관심 표현이 거의 표적 세포에서 발생할 수 있습니다. 입니다만 너무 높으 그 사용하지만, 스트레스의 징후를 보여 대상 세포에서 발생할 수 있습니다. 목표는 방어 세포의 건강을 유지하면서 구조 -의 - 관심의 표현을 극대화 그것을 사용하는 것입니다. 우리가 HT1080 세포에서 lentiviral 구조의 통합 사본을 측정 qPCR 기반 titering 프로토콜을 추천하는 동안, 다른 titering 접근 방식은 또한 p24 엘리사 또는 GFP 양성 세포 %의 추정으로 사용할 수 있습니다.
표적 세포의 성공적인 도입은 또한 몇 가지 주요 요인에 의존적일 수 밖에 없습니다. TransDux 높은 형질 도입 효율을 가능하게 독특한 감염 시약이지만, 그 세포에 독성이 없습니다. TransDux는 종종 대상 세포에 대한 독성 polybrene, 대신 사용할 수 있습니다. 대상 세포의 형질 도입에 TransDux의 포함은 바이러스 입자에 요금을 무력화하는 데 도움이되며 세포에 바이러스를 수의. TransDux는 세포에 독성이되지 않기 때문에, 하나는 따라서 확률을 증가 lentiviral 입자가 72시간 (바이러스 구조가 숙주 세포의 게놈에 통합했습니다되는 시간)에 대해 세포와 접촉에 남아있을 수 있습니다 바이러스성 입자는 세포를 입력. 어떤 어려운 - 투 - transduce 세포의 경우 transductions은 형질 도입 효율을 향상하기 위해 연속 날이 반복 수 있습니다. 예를 들어, 하루 1 세포를 transduce, 세포가 하루 2 쉴 수 있도록하고 일 3 일에 다시 세포를 transduce. 그것은 목표 세포의 초기 선택, 추가 실험하거나 특성화하기 전에 마지막으로 형질 도입 후 72 시간 기다려야하는 것이 중요합니다.
효율적인 바이러스성 포장은 5 '와 3'LTR 지역 사이에도 lentiviral 구조의 크기에 의존적일 수 밖에 없습니다. lentiviral 구조의이 섹션에서는 네이티브 에이즈 게놈의 크기에 해당하는 약 9킬로바이트 이하,이어야합니다. 9킬로바이트 5 월 드를 초과생산 pseudoviral 입자의 포복 절도 titer. 새로운 기술은 이러한 piggyBac transposon 벡터로, 최대 단일 transfection을 통해 1백킬로바이트에 transgenes의 안정적이고 안정적인 통합을 허용합니다. 이 접근법은 그것이 대상 세포를 transfect 수 있습니다 경우에 lentiviral 벡터의 크기 제한을 초과 구조에 사용, 그리고 바이러스성 포장 단계 9,10을 필요로하지의 추가 이점을 제공받을 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하여 제작 pseudoviral 입자들은 대부분의 포유 동물 세포 유형을 감염시킬 수에 전염성이있다. 이 프로토콜에서 사용되는 제품은, 그러나 그들이 아닌 replicative 및 자체 운영을 중지시키지 pseudoviruses를 만들어 그에서 3 세대 biosafe입니다. 그러므로, 일단 표적 세포 또는 동물 전염성 또는 전염성이없는 표적 세포 또는 동물에 transduced. biosafety에서 권장하지 않지만 타사 세대 biosafe 아닌 다른 lentivector plasmids의 대체 가능관점. 바이러스 생산 프로토콜과 대상 세포의 후속 형질 도입은 NIH 가이드라인 11에 의하면, Biosafety 레벨 2 아래 진행되어야하고, 바이러스 입자를 다룰 때 연구자는 항상 실험 복과 장갑을 착용해야합니다. 사용 293TN 생산 세포는 바이러스성 입자, 그리고 일회용 pipettes의 튜브는 적절한 보호복 용기에 폐기되어야한다. 재사용 가능한 pipettes 및 유리 제품은 표백제로 소독하고 직원의 노출을 줄일 autoclaving해야합니다.
Disclosures
이 비디오 문서에 대한 생산 및 무료 액세스 시스템 Biosciences의 후원됩니다.
Acknowledgments
우리는이 프로토콜의 개발과 테스트 그들의 지원을 위해 SBI에서 직원들과 과학자들이 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11995-073 | |
| 293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
| pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
| pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
| Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
| Purefection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 | |
| PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 | |
| Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
| TransDux | SBI | LV850A-1 |
References
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