Förpackning HIV-eller FIV-baserade Lentivector Konstrukt Expression och Transduction av VSV-G pseudotypade virala partiklar

Summary

Lentivirala expressionsvektorer är de mest effektiva vehiklar för stabilt uttrycker olika effektor-molekyler eller konstruktioner reportergrupper i delande och icke delande däggdjursceller och hela organismer. Här erbjuder vi ett protokoll om hur man paketerar lentivector uttryck konstruktioner i pseudoviral partiklar och att omvandla målceller med hjälp av pseudoviral partiklarna.

Abstract

Som med standardmetoder plasmidvektorer, är det möjligt att transfektera lentivectors i plasmiden formen in i celler med låg-till-mediet effektivitet för att erhålla transient expression av effektorer. Förpackning lentivirala expressionskonstruktioner i pseudoviral partiklar, men medger att upp till 100% transduktion, även med svåra att transfektera celler, såsom primära, stam, och differentierade celler. Dessutom producerar inte lentivirala leverans inte de specifika cellulära svar som normalt förknippas med kemiska transfektioner, såsom celldöd som följer toxicitet transfektionsreagens ^{1, 2.} När transducerade in i målceller, integrerar den lentivirala konstruktionen i genomisk DNA och tillhandahåller stabilt uttryck av den lilla hårnålen RNA (shRNA), cDNA-, mikro-RNA eller reportergen ^{3, 4.} Mål-celler som stabilt uttrycker den verkställande molekylen kan isoleras med användning av en selekterbar markör som finns i expressionsvektorn konstruktion såsom puromycin eller GFP. Efter pseudoviral partiklar infektera målceller, kan de inte replikera inuti målcellerna eftersom de virala strukturella generna är frånvarande och de långa terminala upprepningarna (LTR) är utformade för att vara själv-inaktiverande på transduktion ^{5, 6.}

Det finns tre huvudsakliga komponenter som krävs för effektiv lentiviral förpackning ^{1, 5, 6, 7.}

1. Den lentivirala vektor för uttryck som innehåller några av de genetiska element som krävs för förpackning, stabil integrering av det virala expressionskonstruktionen i genomiskt DNA, och expression av effektor-eller rapportörmolekyl.
2. De lentivirala förpackningar plasmider som ger de proteiner som är väsentliga för transkription och förpackning av en RNA-kopia av expressionskonstruktionen i rekombinanta pseudoviral partiklar. Detta protokoll används PPACK plasmider (SBI) som kodar för gag-, pol-och rev från HIV-eller FlV-genomet och vesikulärt stomatitvirus G-protein (VSV-G) för det virala höljesproteinet.
3. 293TN producera r-celler (härledda från HEK293-celler) som uttrycker SV40 stor T-antigen, som krävs för hög titer lentivirala produktion och en neomycinresistensgen, användbara för återvälja cellerna för underhåll.

En översikt av den virala produktionen protokoll kan ses i figur 1. Viral produktion börjar genom att samtransfektera 293TN producerande celler med den lentivirala vektor för uttryck och plasmiderna förpackningar. Viruspartiklar utsöndras i mediet. Efter 48-72 timmar av cellodlingsmedia skördas. Cellrester avlägsnas från cellodlingsmedier, och de virala partiklarna utfälldes genom centrifugering med PEG-det för koncentrering. Framställda lentivirala partiklama får därpå titrerades och kan användas för att transducera målceller. Information om viral titrering ingår inte i detta protokoll, men kan hittas på:

ank "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8.

Detta protokoll har optimerats med hjälp av specifika produkter som anges. Andra reagens kan vara substituerad, men samma resultat kan inte garanteras.

Protocol

1. Transfektion av 293TN Celler med Packaging Plasmider och uttryckskonstruktionen

1. Frö från 7,0 till 8,0 x 10 ⁶ 293TN celler per 15 cm ² odlingsplatta i 20 ml odlingsmedium innehållande DMEM-medium kompletterat med 4 mM L-glutamin, 4,5 g / I glukos, och fetalt bovint serum (10%) utan antibiotika. Växa under 18-24 timmar vid 37 ° C med _5% CO2, så att celldensiteten når 60-80% konfluens vid tidpunkten för transfektion. I vissa fall kan det vara nödvändigt att ympa flera plattor av celler för att erhålla en tillräckligt hög titer för transduktion av målceller.
2. För varje platta med celler, tillsätt 1,6 ml serumfritt DMEM till en autoklaverad 2 ml Eppendorff röret. Tillsätt 45 pl pPACKH1 eller pPACKF1 och 4,5 pg av en lentivector konstruera till DMEM och blanda genom pipettering upp och ned.
3. Tillsätt 55 pl av PureFection in i samma rör. Virvel i 10 sekunder. Inkubera DMEM-Plasmid-PureFection blandningen vid rumstemperatur feller 15 min.
4. Tillsätt DMEM-Plasmid-PureFection blandning av vävnadskulturplattan droppvis och virvla försiktigt för att jämnt dispergera hela plattan. Återföra skålen till inkubatorn och växa vid 37 ° C med _5% CO2.
5. Det finns inget behov att ändra mediet efter transfektion. Om din lentivector konstruktion uttrycker en gen som kodar för ett fluorescerande protein som GFP, kontrollera dina celler i mikroskop 12-24 timmar efter transfektion. Man bör kunna se> 90% GFP-positiva celler, vilket indikerar att transfektion var framgångsrik.
6. Samla upp supernatanten cellkultur efter 48 och 72 timmar i en 50 ml sterilt centrifugrör. Detta cellkultursupernatant innehåller nu infektiösa pseudoviral partiklar. (Följ de rekommenderade riktlinjer för att arbeta med BSL-2 säkerhetsklass.) Centrifugera vid 1.500 xg under 15 min vid rumstemperatur för pelletering av cellrester. Överföra den virala supematanten till ett nytt rör, vilket säkerställer att inte störa pelleten.
7. 293TN celler som har använts för viral förpackningar ska kasseras på ett biologiskt behållare och får inte användas för ytterligare omgångar av viral förpackningar.

2. Koncentrationen av den virala supematanten

1. Tillsätt 1 volym kall (4 ° C) PEG-det virus fällningslösningen att var 4 volymer av lentiviralt partikel-innehållande supernatanten. Utfällning av lentivirala partiklar från stora volymer kan åstadkommas med Corning 250 ml centrifugrör av polypropen. Blanda lösningen genom att vända rören flera gånger, men inte virvel blandningen.
2. Kyla lösningen vid 4 ° C under minst 12 timmar (upp till 4 dagar är acceptabelt). Skaka inte eller rotera rören under kylningen.
3. Centrifugera supernatanten / PEG-blandningen den vid 1500 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Efter centrifugering, kommer de lentivirala partiklarna visas som en beige eller vit pellet vid botten av röret. Häll ut supernatant.
4. Ta bort alla spår av vätska genom aspiration, noga med att inte störa de utfällda Lentiviral Particles i pelleten. Spår av kvarvarande PEG-den kommer att späda ut-virus (vilket minskar titern) men kommer inte att påverka integriteten av målcellerna efter PEG-den är inert och inte toxisk.
5. Återsuspendera och kombinera de lentivirala partiklarna i 1/100 av den ursprungliga volymen med användning av kall (4 ° C), buffrad steril fosfatbuffrad saltlösning eller DMEM innehållande 25 mM HEPES-buffert.
6. Alikvotera in i sterila kryogena flaskor och förvara vid -70 ° C tills klar för användning.

3. Viral Bestämning av antikroppnivå och transduktion av målceller

1. Vi rekommenderar titrering de lentivirala partiklarna före transduktion av målceller av intresse och att beräkna lämplig multiplicitet av infektion (MOI) för målcellerna på överensstämmelsen mellan experimenten. För viral titrering rekommenderar vi att du använder HT1080 celler som ett lätt att infektera positiv kontroll linje. Plunderlätta notera att titrering Protokollet involverar transduktion HT1080-celler med en liten alikvot av de lentivirala partiklarna man har förpackats. När väl titern är känd, kan målcellerna av intresse också transduceras med de producerade lentivirala partiklarna. En rekommendation titrering protokoll kan hittas på: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf ^7.
2. Plattan 50,000 målceller av intresse per brunn i en 24-brunnsplatta i cellodlingsmedia. Använd media som cellerna normalt odlas i. Odla cellerna över natten på deras angivna odlingsbetingelser. Celler bör vara mellan 50 till 70% sammanflytande på dagen för transduktion.
3. På dagen för transduktion, aspireras mediet från cellerna. Kombinera odlingsmedium med TransDux till en 1 x slutlig koncentration (t ex 2,5 ^ il TransDux till 500 | il av odlingsmediet). Sedan överföra TransDux-cell odlingsmedium blandningen till varje brunn.
4. Pipettera den lämpliga volymen av virus som motsvarar den optimala MOI för målcellerna till varje brunn. Om den optimala MOI är okänd, rekommenderar vi försöker en rad olika molekyler av intresse (t.ex. en MOI av 1, 2 och 5 för enkel att infektera vävnadskulturceller, och en MOI av 1, 10 och 20 för mer svåra att -infektera primära celler). Om koncentrationen av Lentiviral Particles inte är känd (som bestäms genom ett virus titrering protokoll), kan olika volymer av virus prövas, såsom 1, 2 och 5 pl virus. Viruset kan förbli i kontakt med målcellerna i upp till 72 timmar.
5. Ytterligare experiment med de transducerade målceller av intresse kan påbörjas 72 timmar efter transduktion, när den virala konstruktet har integrerats i värdcellens genom. Ändra mediet och passage målceller av intresse beroende på deras specifika behov.

4. Representativa resultat

Utgångs-densitet 293TN celler är kritiskt för framgångsrik viruspackning. 293TN cellerna måste vara mellan 60 -80% konfluenta dagen för transfektion (fig 2). Om 293TN cellerna är mindre än 60% sammanflytande, låta dem växa ytterligare några timmar innan du försöker transfektion. Om 293TN cellerna är> 80% sammanflytande, bör de återutströks före transfektion.

Om du använder en lentivector uttrycker GFP, bör minst 90% av de 293TN cellerna fluorescerar grönt 24 timmar efter transfektion, vilket tyder på en lyckad transfektion (Figur 3). Om mindre än 90% av cellerna är GFP-positiva, fortsätt inte vidare till nästa steg, eftersom detta indikerar att transfektion var inte framgångsrika, och de virala titrar kommer att vara låg. Istället platta nya 293TN celler och börja om, och se till att 293TN cellerna blir rätt celldensiteten före transfektion.

293TN celler kan dra bort de vävnadsodlingsplattor 48-72 timmar efter transfektion. Detta inte negativt påverka produktionen av Lentiviral Particles.

Titrering med HT1080-celler

Virustitrar kan beräknas med hjälp SBI: s Global ultrasnabba Bestämning av antikroppnivå kit enligt tillverkarens instruktioner. Detta system använder qPCR att mäta viral integration av WPRE-sekvensen från den lentivirala vektor in HT1080-celler och jämför detta med en standardkurva, baserat på en genomisk referenssekvens för att noggrant mäta infektiösa enheter per ml (figur 4).

Transduktion av målceller

Om du använder Lentiviral Particles uttrycker en konstitutivt aktiv GFP markör bör GFP-positiva celler börjar uppträda inom 12-24 timmar efter transduktion, om transduktion reaktionen fungerar. GFP-uttryck bör fortsätta efter lentiviral konstruktionen stabilt integreras i than värdcellens genom. Om transducerande med olika MOI bör GFP-fluorescens motsvarar ungefär MOI, där MOI låga visar mindre GFP-fluorescens och högre MOI visar ökad GFP-fluorescens (fig 5).

Figur 1. Översikt av den virala produktionen protokollet. De lentivector och PPACK förpackning plasmider blandas och samtransfekteras in i 293TN celler. Efter 48 -72 timmar, är den virala supematanten uppsamlades och virala partiklar fälls ut med PEG-den. Efter titrering av Lentiviral Particles, kan de användas för att omvandla mål cellerna av intresse. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Faskontrast bild av 293TN celler. Cell Density bör vara mellan 60-80% sammanflytande dagen för transfektion.

Figur 3. Fluorescerande bild av GFP-positiva 293TN celler 24 timmar efter transfektion med Purefection, pPACKH1, och en lentivector konstrukt som kodar för GFP.

Figur 4. WPRE qPCR resultat och standardkurva erhållen med SBI: s Global ultrasnabba Bestämning av antikroppnivå kit för att beräkna MOI och motsvarande titer av förpackade viruspartiklar.

Figur 5. Fluorescerande bilder av HT1080-celler transducerade med ökande mängder av lentivirus. Bilderna är från 72 timmar efter transduktion.

Discussion

Detta viral förpackning och transduktion av målceller protokoll har optimerats för användning med SBI: s virala förpackningar reagens. Substitution av andra reagenser kan påverka resultatet av protokollet. Detta protokoll har endast optimerats för lentiviral produktion och får inte vara lämplig för att producera andra typer av virus eller pseudoviruses.

Framgångsrik viral förpackningar är beroende av flera viktiga steg. De 293TN celler uttrycker SV40 stor T-antigen, vilket är absolut nödvändig för utsöndring av de lentivirala partiklarna in i cellkultursupernatanten. Densitet vid vilken 293TN cellerna är vid tidpunkten för transfektion är särskilt viktigt för att den PureFection reagens för att tillräckligt överföra lentivector och plasmider förpackningsmaterial in i cellerna. Tillsats av den PureFection blandningen till vävnadsodlingsplattan i en droppvis sätt följt av noga virvling plattan är viktig för spridning av det förpackningsmaterial plasmideroch lentivector konstruera hela alla cellerna. Misslyckande att korrekt fördela de vektorer kan resultera i otillräcklig lentivirala partiklar som produceras. Den virala förpackningen Reaktionen kan skalas upp för produktion av höga titrar viruset, baserad på ytan av de vävnadsodlingsplattor. Man kan välja att plattan flera vävnadsodlingsskålar av 293TN celler per konstrukt som ska paketeras. Koncentration av de virala supernatanterna är särskilt användbart för att skapa hög titer virus. Viral supernatant från multipla plattor av celler kan kombineras och koncentreras för användning i in vivo experiment, eller för celler som är svåra att transducera.

Titrering de producerade lentivirala partiklarna är viktig för att beräkna en korrekt MOI att använda för transduktion av målceller. Att veta MOI som användes i ett visst transduktion gör felsökning i händelse av att transduktionen inte lyckas. Exempelvis med användning av en MOI som äralltför låg kan resultera i mycket få målceller som uttrycker konstruktionen av intresse. Användning av en MOI som är alltför hög kan emellertid resultera i målceller som uppvisar tecken på stress. Målet är att använda en MOI som maximerar uttryck av konstruktionen av intresse och samtidigt bevara hälsan hos cellerna. Även om vi rekommenderar en qPCR-baserat titrering protokoll som mäter integrerade kopior av lentiviral konstruktionen i HT1080 celler kan andra titrering metoder också användas, såsom p24 ELISA eller uppskattning av den procentuella GFP-positiva celler.

Framgångsrik transduktion av målceller är också beroende av flera viktiga faktorer. TransDux är en unik infektion reagens som möjliggör höga transduktionsmekanismer effektivitet, men det är inte giftigt för celler. TransDux kan användas i stället för polybren, som ofta är toxiska för målcellerna. Införandet av TransDux i transduktion av målceller hjälper till att neutralisera eventuell på de virala partiklarna och låter viruset in i cellens. Eftersom TransDux inte är toxisk för cellerna, kan man tillåta de lentivirala partiklarna att förbli i kontakt med cellerna under upp till 72 timmar (den tid vid vilken de virala konstruktionerna har integrerats i värdcellens genom), vilket ökar sannolikheten för att virala partiklar som kommer in i cellen. För vissa är svåra att omvandla celler kan transduktioner upprepas på varandra följande dagar för att öka transduktion effektivitet. Exempelvis transducera celler på dag 1, tillåta cellerna att vila på dag 2, och därefter omvandla cellerna åter på dag 3. Det är viktigt att vänta 72 timmar efter den sista transduktionen Innan du börjar val ytterligare experiment eller karakterisering av målceller.

Effektiv viral förpackning är också beroende av storleken av den lentivirala konstruktionen mellan de 5 'och 3' LTR regioner. Denna sektion av lentiviralt konstruktionen bör vara ca 9 kb eller mindre, vilket motsvarar storleken av den nativa HIV-genomet. Högst 9 kb maj deveck titern av de producerade pseudoviral partiklarna. Ny teknik, såsom piggyBac transposonmutanter vektorer, låt för tillförlitlig och stabil integrering av transgener upp till 100 kb genom en enda transfektion. Detta tillvägagångssätt kan användas för konstruktioner som överskrider den tillåtna storleken på lentivirala vektorer, i fall där det är möjligt att transfektera målceller, och ger den ytterligare fördelen att inte kräva en viral förpackningssteget ^9,10.

De pseudoviral producerade partiklar med hjälp av detta protokoll är smittsamma att de kan infektera de flesta däggdjur celltyper. De produkter som används i detta protokoll, men är tredje generationens BioSafe att de producerar icke-replikativ och själv-inaktiverande pseudoviruses. Därför, när omvandlade till målceller eller djur, de målceller eller djur inte är smittsam. Substitution av andra lentivector plasmider som inte är tredje generationens BioSafe är möjligt men inte rekommenderat ett biosäkerhetperspektiv. Den virala produktionen protokollet och efterföljande transduktion av målceller bör utföras under biosäkerhetsnivå 2, enligt NIH riktlinjerna ^11, och forskare bör alltid bära skyddsrock och handskar vid hantering av viruspartiklar. Används 293TN producerande celler, bör rör med virala partiklar, och engångspipetter tas om hand i en lämplig biologiskt behållare. Återanvändbara pipetter och glas ska saneras med blekmedel och autoklavering för att minska exponering av personal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM High Glucose Medium	GIBCO, by Life Technologies	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
Purefection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1