Summary
En metod beskrivs för att photoactivate enskilda celler innehållande en bur fluorescerande protein med två-foton-absorption från en Ti: Sapphire femtosecond laseroscillatorn. För ödet karta fotoaktiverad cell, immunohistokemi används. Denna teknik kan tillämpas på varje celltyp.
Abstract
Förmågan att differentiellt märka enstaka celler har viktiga följder i utvecklingsbiologi. Till exempel bestämma hur hematopoetiska, lymfatiska och blodkärl linjer uppstår i utvecklingen embryon kräver öde kartläggning och härstamning spårning av odifferentierade prekursorceller. Nyligen fotoaktiverbara proteiner som inkluderar: har Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 och KikGR 9, 10 fick stor intresse som cell spåra prober. Fluorescensspektrumet för dessa ljuskänsliga proteiner kan lätt omvandlas med UV-excitering, tillåter en population av celler som skall särskiljas från intilliggande. Emellertid kan photoefficiency av den aktiverade proteinet begränsar långvarig cell spårning 11. Som ett alternativ till fotoaktiverbara proteiner, bur fluorescein-dextran har använts i stor utsträckning i system embryo modell 7, 12-14. Traditionellt, att uncage fluorescein-dextran, UV spännandetion från en fluorescens-lampa hus eller en enda foton UV-laser har använts, men sådana källor begränsar den rumsliga upplösningen i fotoaktivering. Här rapporterar vi ett protokoll till öde karta, härstamning spår, och upptäcka enstaka märkta celler. Enstaka celler i embryon som injicerats med bur fluorescein-dextran fotoaktiveras med nära-infraröda laserpulser som framställts av en titan safir femtosecond laser. Denna laser är brukligt i alla två-photon konfokala mikroskop som LSM 510 META NLO mikroskop som används i detta dokument. Eftersom biologisk vävnad är transparent för nära infraröd strålning 15, kan laserpulserna fokuseras djupt inne i embryot utan uncaging celler över eller under den valda fokalplanet. Därför är icke-linjär två-fotonabsorption inducerade endast vid den geometriska fokus uncage fluorescein-dextran i en enda cell. För att upptäcka den cell som innehåller Uncaged fluorescein-dextran, beskriver vi en enkel immunohistokemi protokoll 16 för att snabbt visuaLize den aktiverade cellen. Aktiveringen och upptäckt protokoll som presenteras i denna uppsats är mångsidig och kan tillämpas på alla modellsystem.
Obs: De reagens som används i detta protokoll kan hittas i tabellen bifogad i slutet av artikeln.
Protocol
1. Syntes av bur fluorescein-dextran (anpassad från ref 14).
- Bered en 0,1 M lösning av natriumborat utspädd i DDH 2 O.
- Mät 4 mg 10 kDa aminodextran och lägga till det i CMNB-bur fluorescein rör.
- Lägg 500 il av den framställda natriumboratlösning (steg 1,1) till CMNB-bur fluorescein röret. Förslut röret och vortexa i 30 sekunder för att lösa upp blandningen.
- Låt blandningen reagera över natten på ett nutator vid rumstemperatur. Täck röret med metallfolie för att förhindra exponering av blandningen till omgivande ljus.
- Skaffa en Zeba AVSALTA spinnkolonn och skruva av nedre locket. Markera en prick på kolonnen, som kommer att användas för att orientera kolonnen vid centrifugering. Placera kolonnen i en 15 ml koniskt Falcon-rör. Anmärkning: lösningen i spinnkolonn är kolonnbuffert.
- Lossa den övre locket på AVSALTA spinnkolonn. Placera 15 ml koniska Falcon röret som inrymmer AVSALTA spinnkolonn i CENTRifuge. Orientera spinnkolonn med markerad punkt (steg 1,4) vänd mot centrum av centrifugrotorn. Centrifugera röret vid 1000 xg under 2 minuter vid rumstemperatur.
- Efter centrifugering, ta bort AVSALTA spinnkolonn från Falcon röret. Kassera både det uppsamlade flödet genom och 15 ml koniskt rör. Skaffa en ny 15 ml koniskt Falcon rör och placera AVSALTA spinnkolonn i den nya Falcon-rör. Obs: Efter centrifugering ska kolumnen hartsbädden verkar komprimeras. Använd kolonnen omedelbart.
- Skaffa reagerade blandningen (bur fluorescein-dextran) i steg 1,3. Ta bort locket från spinnkolonn och aspirera reagerade blandningen och tillämpa den sakta till mitten av AVSALTA spinnkolonn. Efter applicering av reagerade blandningen, sätt tillbaka locket på spinnkolonn.
- Placera Falcon-rör som inrymmer AVSALTA spinnkolonn i en centrifug. Såsom görs i steg 1,5, orientera spinnkolonn med den markerade punkten mot centrum centrifugrotorn. Centrifugeringseffekte röret vid 1000 xg under 2 minuter vid rumstemperatur.
- Efter centrifugering, kommer en gul blandning (bur fluorescein-dextran) samlas (ca 400 pl) i 15 ml Falcon-rör. Överför bur fluorescein-dextran blandningen till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Omedelbart täcka röret med metallfolie för att förhindra exponering av blandningen till omgivande ljus. Lyofilisera bur fluorescein-dextran blandningen i en SpeedVac. Lyofilisering av 350 pl tar ungefär 4 timmar.
- Efter fullständig lyofilisering, resuspendera pulvret (ca 3 mg) i DDH 2 O till en slutlig koncentration av ca 1% vikt / volym Blanda med kort vortexa att avbryta pulvret.
- Alikvotera den bur fluorescein-dextran i separata metall täckta folie rör och lagra dem vid -20 ° C.
2. Skörd av embryon och mikroinjektion av bur fluorescein-dextran
* Denna procedur använder zebrafiskeftersom djurmodellsystem.
- På dagen före injektioner, inrättat zebrafisk kors antingen 1:1 manlig-till-kvinnligt eller 2:1 manlig-till-kvinnligt i avel tankar med avdelare.
- Nästa morgon byta vatten avel tanken och ta bort delarna. Omedelbart framställa en 5 pl 1/10 utspädd arbetslösning av inburat fluorescein-dextran i antingen 1 X Danieau media (se Framställning av lösningar) eller DDH 2 O. Täck arbetslösningen röret med metallfolie för att förhindra exponering för ljus.
- Pipettera den förberedda bur fluorescein-dextran-lösning (steg 2,2) in i nålen. Innan du skär nålspetsen till en lämplig storlek under dissektion mikroskop, placera en bit transparent gul filter framför det vita ljuskällan. Den gula filtret förhindrar spontan uncaging av fluorescein-dextran under injektioner. När man tittar igenom den okulära okularet bör ljuskällan verkar gult.
- Samla embryon och pipettera dem till en microinjection mögel facket. Ställ mikroinjektion tid att leverera 3 till 4 nL av inburat fluorescein-dextran. Enligt dissektion mikroskop, Orient embryon med pincett och injicera (3 till 4 nL) bur fluorescein-dextran i basen av blastomer celler (blastomer-gula gränssnitt). Embryostadiet för injektion bör vara 1 - till 2-cellstadiet.
- Efter injektion, ta bort embryon från mikroinjektion mögel facket och placera dem i en ren petriskål innehållande färsk fisk vatten. Metylenblått kan sättas till fisken vattnet för att förhindra svamptillväxt på en slutlig koncentration av 0,02% vikt / volym Täck petriskål med metallfolie för att förhindra uncaging av den injicerade bur fluorescein-dextran.
- Höj injicerade embryona till ett stadium när cellerna av intresse måste fotoaktiveras. För fotoaktivering, förbereda en 0,6% lågsmältande agaros lösning i DDH 2 O. Beroende på embryostadiet, Tricaine (MS222) kan sättas till lågsmältande agaros. För att göra detta, späd 0,02% Tricaine i lågsmältande agaros till en slutlig koncentration av 0,0014%.
- Så snart embryona når det lämpliga utvecklingsstadiet, dechorionate embryona i 1 X Danieau media med pincett. När dechorionating, se till att en transparent gul filter placeras i vägen för den vita ljuskällan (se steg 2,3).
- Värm 0,6% lågsmältande agaros-lösning till 37 ° C. Pipettera 1 ml av lågsmältande agaros i brunnen av en LabTek kamrar täckglas bild. Montera försiktigt 3 till 4 embryon i lågsmältande agaros och orientera dem med pincett med de celler som skall fotoaktiverade nedåt mot botten täckglaset.
- Låt agaros stelna. Efter stelning, pipett 1 ml av 1 X Danieau medier över agarosen.
- Upprepa steg från 2,8 till 2,9 för fler embryon.
3. Två-foton aktivering av inburat fluorescein-dextran
* Den här proceduren förutsätter att embryot uttrycker reporter GFP. Embryot ses med argonjon (488 nm) laserkälla bifogas LSM 510 META NLO mikroskop. En enda GFP positiv cell väljs och fotoaktiveras med Mai Tai lasern (femtosecond laser) kopplad till LSM 510. Proceduren är densamma för icke-fluorescerande embryon. Alternativt, kan vitt ljus användas för att hitta den cell som skall aktiveras, följt av aktivering med Mai Tai laserkällan.
- Ladda LSM 510 programvaran. Placera en genomskinlig gul filter i det vita ljuset strålgången.
- Välj Skanna Ny bild och klicka på Starta Expertläge.
- Välj Laser fliken. Slå på argonjon (488 nm) och Mai Tai (femtosecond) laserkällor.
- Ställ Mai Tai våglängden på 740 nm.
- Välj fliken Konfig. Ställ den optiska banan konfigurationen för argon-jon och Mai Tai laser.
- Välj fliken Skanna. Ändra målet att 20X/0.8.
- Ställ in max skanningshastighet genom att klicka på Max.
- SET-läge, metod och nummer till linje, Mean, och 1.
- Enligt Kanaler fliken avmarkera alla laserkällor undantag för Mai Tai.
- Placera en kraftmätare i den optiska strålgången.
- Välj CONT-knappen för att aktivera kontinuerlig scanning.
- Justera överföringen% tills strömmen mätaren visar en genomsnittlig lasereffekt av 47 mW.
- Stoppa skanning genom att välja Stopp.
- Enligt Kanaler fliken avmarkerar Mai Tai laserkällan och välj argonjon (488 nm).
- Välj Snabb xy-knappen. Enligt Kanaler fliken justera pinhole, detektor vinst, förstärkare offset och förstärkningen för argonjonlaser för att uppnå bästa bildkvalitet.
- Med hjälp av scenen controller, hitta och fokusera på cellen för att aktivera.
- Klicka på Stopp-knappen.
- Använda zoomverktyget, zooma in den aktiverade cellen tills zoomfaktor under fliken Läge visas 50 till 70.
- Stoppa skanning genom att välja Stopp.
- Enligt Kanaler fliken avmarkerar argonjon lasER (488 nm) och välj Mai Tai lasern.
- Enligt fliken Läge ställa skanningshastighet till 31,46 sek.
- Välj Single knappen för att starta sökningen efter två-photon aktivering av bur fluorescein-dextran för den valda cellen.
- Efter aktivering avmarkerar Mai Tai lasern under fliken Kanaler, och välj återigen den argonjonlaser (488 nm).
- Ställ zoomfaktorn i läge till 1 och klicka på Max knappen under Hastighet rubriken ställa den snabbaste Scan Speed.
- Välj Snabb xy att granska fotoaktiverad regionen. Kontrollera att fotoaktiverad regionen inte laserablation. För mer information om laserablation, se diskussionen avsnittet.
- Upprepa ovanstående steg för andra embryon.
4. Immundetektion av Uncaged fluorescein-dextran (anpassad från ref 16).
- Efter photoativation, placera en genomskinlig gul filter framför det vita ljuskällan och manuellt ta bort varje embryo från LOW smältande agaros med vassa pincett. Placera alla borttagna embryon i en ny petriskål med färska 1 X Danieau medier. Täck petriskål med metallfolie för att förhindra exponering av embryon för ljus.
- Om det behövs, bak embryona till det önskade utvecklingsstadiet. Under tiden förbereder en 4% paraformaldehyd lösning (se Beredning av lösningar). Alikvotera 1,5 ml beredd paraformaldehyd i ett mikrocentrifugrör.
- Efter att embryona har nått utvecklingsstadiet av intresse, pipettera embryona i mikrocentrifugrör (från steg 4,2). Täck röret med metallfolie för att förhindra exponering för ljus.
- Vicka röret över natten vid 4 ° C. För nästa dag förbereder graderade etanol (EtOH) lösningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och DDH 2 O, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: DDH 2 O och 100% EtOH.
- Nästa dag, ta bort embryon från 4 ° C. Avlägsna metallfolien täcker röret och snabbt aspirera av paraformaldehye (lämna efter en liten volym som är tillräckligt för att omfatta embryon). Pipettera 1,5 ml av 30% EtOH: PBS in i röret. Re-täcka röret med metallfolie. Vicka röret vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Upprepa steg 4,5 med användning av 50, 70, och 100% EtOH graderas lösningar. Efter 100% EtOH tvätt, skölj embryona igen i 100% EtOH under 10 minuter.
- Efter tvättningarna, lagra embryona natten vid -20 ° C. För nästa dag förbereder fosfatbuffrad Tween (PBT, se beredning av lösningar), 5 X blockeringsbuffert (se tillverkarens protokoll för beredning), maleinsyra (protokoll för förbehandling finns i blockeringsbuffert protokoll), 10 mg / ml proteinas K, och en 10 X antikroppslösning (anti-fluorescein-AP, se Beredning av lösningar).
- Också förbereda 2% lammserum (LS, se Beredning av lösningar) utspädd i PBT. Förvara antikroppen vid 4 ° C över natten under skakning på en nutator. De 2% LS kan hållas vid 4 ° C
- Nästa dag avlägsna embryonafrån -20 ° C. Avlägsna metallfolien täcker röret och snabbt aspirera bort 100% EtOH. Lägg 1,5 ml av 70% EtOH: DDH 2 O till röret. Re-täcka röret med metallfolie. Vicka röret vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Upprepa steg 4,8 med användning av 50 och 30% klassificeras EtOH lösningar, och 100% PBT. Efter 100% PBT tvätt, skölj embryona 3 gånger i 100% PBT för 10 minuter.
- Om embryona är äldre än 24 timmar, proteinas K behandla dem. Om inte, gå till steg 4,13. För att göra detta, späd den preparerade proteinas K (steg 4,7) 1:1000 i PBT. Inkubera embryona i proteinas K under 10 minuter, eller längre om embryona är äldre. Håll embryon som omfattas av metallfolie för att förhindra exponering för ljus.
- Efter proteinas K behandling, tvätta embryona 5 gånger i PBT under 10 minuter. Efter tvätt fastställa embryon i 4% paraformaldehyd under 30 minuter vid rumstemperatur på en nutator. Efteråt, skölj omedelbart embryona 5 gånger i PBT för 10 minuter. Håll embryonatäckt med metallfolie för att förhindra exponering för ljus.
- Gör blockerande buffert genom att späda 5 X blockeringsbuffert i maleinsyra buffert till 1 X. Ta bort embryon från PBT och placera dem i 1 X blockerande buffert. Täck embryona med metallfolie och vicka dem vid rumstemperatur under 5 till 6 timmar.
- Efter 5 till 6 timmar för blockering, värmechock embryona vid 65 ° C under 15 till 20 min.
- Skaffa antikroppen lösningen och 2% LS beredda föregående dag. Centrifugera antikroppslösningen vid max rpm. Överför den vattenhaltiga fasen till 2% LS rör. Invertera röret för att blanda.
- Överför embryon från blockerande buffert till LS-antikroppar blandning. Håll embryon som omfattas av metallfolie för att förhindra exponering för ljus. Vicka embryona vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag tvätta embryona vid rumstemperatur 6 gånger under 15 minuter i PBT. Bered AP-buffert (se Framställning av lösningar).
- Tvätta embryona i rumstemperatur 2 gånger för 10 minuter i AP buffer. Bered NBT / BCIP framkallningslösning (se Framställning av lösningar).
- Överför embryon till NBT / BCIP. Låt fläcken utvecklas i mörker.
- Stoppa utvecklingen genom att tvätta embryona 3 gånger i PBT under 5 minuter vardera.
- För bildinhämtning montera embryon i 0,6% lågsmältande agaros eller 3% metylcellulosa, och förvärva bilder med en inverterad eller upprätt mikroskop.
- Fotoaktiverade prover kan sparas för framtida analys (färgning fortsatt stabil) genom torkning dem i en graderad EtOH tvätt. Följ steg 4,4 till 4,7 för torkning av proverna.
5. Representativa resultat:
Figur 1. Fotoaktivering av inburat fluorescein-dextran. (A, B) Brightfield och fluorescens bild av en sidovy zebrafisk embryo i 13/14-somite stadiet före fotoaktivering. (C, D) embryot fotoaktiveras ent the13/14-somite steg i en av de somiter (pil) med en våglängd av 740 nm, skanna tid 31 sek, och en genomsnittlig lasereffekt av 47 mW. Efter aktivering, (d) fluorescens från Uncaged fluorescein-dextran observeras. Orientering: Dorsal (höger), Ventrala (vänster). Skalstock 100 um.
Figur 2. Immundetektion av inburat fluorescein-dextran. Figur 2 visar immunfärgning av Uncaged fluorescein-dextran i en 18/19 HPF zebrafisk embryo. Vid 10-somit steget en liten region av embryot aktiverades i den laterala plattan mesoderm med samma laser parametrar som anges i figur 1. Med hjälp av immunodetektering proceduren identifierar pilen den aktiverade regionen med minimal bakgrundsfärgning. Orientering: Dorsal (överst), Ventrala (botten). Skalstock 100 um.
Discussion
Detta dokument beskriver en mångsidig metod för en enda cell öde kartläggning baserad på fotoaktivering av bur fluorescein-dextran. Uncaging av bur fluorescein-dextran i enstaka celler sker med hjälp av två-foton absorption från en Mai Tai femtosecond laser kopplad till Zeiss LSM 510 META konfokalmikroskop. Uncaged fluorescein-dextran i fotoaktiverade celler är snabbt visualiseras med hjälp av en enkel immunhistokemi förfarande.
I detta protokoll de två-foton absorptionsvåglängd för fotoaktivering av bur fluorescein-dextran är 740 nm. Denna våglängd bestämdes experimentellt genom fotoaktiverande bur fluorescein-dextran injicerats vildtyp embryon. Lasern excitationsvåglängd varierades från 600 till 800 nm, och närvaron eller frånvaron av fluorescein fluorescens efter aktivering kvalitativt bestämdes. Vi fann att 740 nm producerade den starkaste fluorescein signalen efter aktivering. Helst bör 740 nm fungera för allamodellsystem, men råda vi testa ett intervall av våglängder för att bestämma den optimala tvåfotonexcitering våglängd för ditt prov.
I bur fluorescein-dextran injicerade vildtyp embryon för varje tvåfotonexcitering våglängd testade vi också varierade den genomsnittliga lasereffekten. För en excitationsvåglängd av 740 nm, en genomsnittlig lasereffekt av 47 mW gav en starkare fluorescein signal vid den aktiverade regionen i jämförelse med lägre genomsnittliga lasereffekter. Högre genomsnittliga lasereffekter producerade inte starkare fluorescein signaler, men inducerade ablation av vävnaden. Eftersom femtosecond laserpulser är effektiva på abiadering biologisk vävnad 15, rekommenderar vi att bestämma tröskeln power genomsnittliga laser för fotoaktivering som undviker vävnad ablation.
Två-foton absorption sker inom en liten interaktion volym. För att säkerställa korrekt aktivering av inburat fluorescein-dextran, måste cellen bringas i rätt fokus. I the ovanstående protokoll var GFP-positiva celler samtidigt avbildas under vitt ljus för att bekräfta cell fokus. Därför, vitt ljus förvärv förutom andra kanaler är tillrådligt. När du har bekräftat cell fokus föreslår vi protokoll förstoringsglas den aktiverade cellen. En zoom faktor på 50 till 70 föreslås emellertid, beror detta värde på storleken av den valda cellen. Ökning av zoomen isolerar den aktiverade cellen från intilliggande celler, och begränsar skanningsområdet för två-foton-aktivering. Helst ska skanningsområdet täcka ett stort område av cellen.
Detektion av enstaka aktiverade celler kräver att bakgrundsfärgning vara minimal. I ovanstående immunodetektion protokollet är det viktigt att provet är blockerad i blockeringsbuffert under 5 till 6 timmar (steg 4,13). När man utvecklar med NBT / BCIP bör Uncaged fluorescein-dextran bli synliga i 10 till 20 minuter. Om bakgrundsfärgning är stark, föreslår vi en längre blockerar tid och ytterligare tvättar för att avlägsna antikropp (steg 4,17).
Figur 1 och 2 ger representativa resultat av fotoaktivering och immunodetektion. I figur 1, tidigt 1 - till 2-cellstadiet vildtyp embryon injicerades med bur fluorescein-dextran. Embryona höjdes till mitten somitogenesis och monterade i lågsmältande agaros i den laterala orienteringen. Figur 1 (a, b) visar ljusfält och fluorescerande bilder av embryot före fotoaktivering. Bevis att embryot förblev Uncaged visas genom frånvaron av fluoresceinfluorescens i figur 1 (b). En liten region inom en somit aktiverades med en våglängd av 740 nm för 31 sekunder med användning av en genomsnittlig lasereffekt av 47 mW, fig. 1 (c, pil). Efter aktivering, två-foton uncaging av fluorescein-dextran inträffat som framgår av fluorescensen från det aktiverade området, Figur 1 (d, pil). Aktivering åtföljdes inte av laserablation, som somitic vävnaden förblev intakt, figur 1 (c). Figur 2 visar immunodetektion av Uncaged fluor escein-dextran. En liten region i den laterala plattan mesoderm av en 10-somit steget embryot fotoaktiveras användning av samma laser parametrar som nämns i figur 1. Embryot höjdes och bearbetas med steg 4,1 till 4,20. Pilen i fig. 2 lokaliserar regionen aktiverad, såsom indikeras genom ackumulering av blå fällning. Endast aktiverade läget är klart upptäcks utan att störa bakgrundsfärgning.
Beredning av lösningar:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 ml 20% Tween
10 X PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCl
6,1 g Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
DDH 2 O till 1 L
pH till 7,3
4% paraformaldehyd (160 ml)
32% Paraformaldehyd (två 10 ml flaskor)
8 ml 20 X PBS
132 ml DDH 2 O
1 ml 5 M NaCl
2,5 ml 1 M MgClj 2
5 ml 1 M Tris pH 9,5
250 pl 20% Tween
41,25 ml DDH 2 O
Antikroppslösning (för 1 prov)
5,5 pl Aceton pulver
40 il PBT
0,8 pl LS
0,1 pl anti-fluorescein-AP-antikropp
2% LS (360 pl för 1 prov)
7,2 pl 100% LS
352,8 il PBT
1 X Danieau medium (1 L) ‡
11,6 ml 5 M NaCl
700 pl 1 M KCl
400 ul 1 M MgSO 4
600 pl 1 M Ca (NO 3) 2
5 ml 1 M HEPES
DDH 2 O till 1 L
pH justeras till 7,6
‡ Danieau är en idealisk saltlösning för uppfödning dechorionated zebrafisk embryon. Andra media kan användas, förutsatt att de är isotona lösningar med proPerly osmolaritet (~ 300 mOsm för zebrafisk)
NBT lager (1 ml)
50 mg nitroblåttetrazolium
0,7 ml dimetylformamid anhydrid
0,3 ml DDH 2 O
BCIP lager (1 ml)
50 mg 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat
1 ml dimetylformamid anhydrid
NBT / BCIP framkallningslösningen
1 ml AP-buffert
4,5 pl NBT lager
3,5 pl BCIP lager
Acetonpulver
- Välj 20 vuxna fiskar och frysa dem i flytande kväve.
- Slipa fryst fisk med en mortel och mortelstöt till ett pulver.
- Överför fisken pulvret till en 50 ml koniskt rör.
- Fyll koniskt rör med 100% aceton. Vortexblanda röret.
- Snurra röret på max rpm under 10 minuter. Kasta bort supernatanten.
- Tvätta pelleten ytterligare 3 gånger i 100% aceton och snurra röret på max rpm under 10 minuter. By den sista tvättningen supernatanten skall vara klar.
- Tillsätt 100% aceton till pelleten igen och låta röret stå vid rumstemperatur. De tätare partiklarna kommer att sedimentera, medan de finare partiklarna förblir i suspension.
- Dekantera de fina partiklarna i ett nytt rör. Alikvotera pulvret lösningen i separata rör och lagra dem vid -20 ° C.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar J. Chen för att tillhandahålla bur fluorescein-dextran syntesprotokollet. Denna forskning stöddes av March of Dimes utmärkelse 5-FY09-78, American Heart Association utmärkelse 09BGIA2090075 och NIH / NHLBI utmärkelse R01 HL107369-01 SS Ett särskilt tack till C. Closson för hans mikroskopi hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , Springer. (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
