Summary
הגישה מינים השוואתי מאפשר מדעני מוח התנהגותיים לחקור הנוירוביולוגי גורמים שונים הקשורים התנהגויות מסוימות כאל מאפיין של הדגם בעל חיים מסוים. ניצול טבעי ההבדלים בהתנהגות בין מינים קרובים, טכניקה זו אינה דורשת טכניקות פולשניות כדי לתפעל את הביטוי של התנהגות.
Abstract
המטרה של מדעי המוח ההתנהגותיים היא לזהות גורמים הנוירוביולוגי הבסיסית המווסתים התנהגויות מסוימות. שימוש במודלים של בעלי חיים כדי להשיג מטרה זו, אסטרטגיות מתודולוגיים רבים דורשים טכניקות פולשניות כדי לתפעל את עוצמת ההתנהגות של עניין (למשל, שיטות הנגע, מניפולציות תרופתי, טכניקות microdialysis, מהונדסים גנטית בבעלי חיים). ניצול הגישה זן השוואתית מאפשר לחוקרים לנצל טבעי ההבדלים באסטרטגיות בתגובה הקיימים מינים קרובים. במעבדה שלנו, אנו משתמשים שני מינים של הסוג Peromyscus שונים בתגובות אבהי. עכבר צבי זכר קליפורניה (Peromyscus californicus) מציג את התגובות של ההורים כמו הנקבה בעוד בן דודו שלו, את העכבר צבי משותף (Peromyscus maniculatus) מוצגים כמעט ללא תגובות וטיפוח / הורים בנוכחות של גורים. עניין ספציפי במאמר זה הוא חקר הגורמים הנוירוביולוגי הקשורים התגובות החברתיות affiliative הוצגו על ידי העכבר קליפורניה אבהי צבי. בגלל הגישה ההתנהגותית המוח הוא רב פנים, מרכיבים את המפתח הבא של המחקר יטופלו בקצרה: זיהוי של זנים המתאימים לסוג זה של מחקר, איסוף נתונים לניתוח התנהגותי; הכנה חתך של המוח; הצעדים הבסיסיים המעורבים immunocytochemistry עבור כימות immunoreactivity-הווסופרסין, שימוש בתוכנות הדמייה לכמת את רקמת המוח, שימוש בניתוח וידאו microsequencing להבקיע התנהגות, ולבסוף, ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כדי לספק את הפירושים הודיע ביותר של ממצאי המחקר.
Protocol
1. זיהוי דגם של בעלי חיים
- עכבר הצבאים קליפורניה (Peromyscus californicus) הוא מודל אידיאלי לחקור התגובות אבהי. כפי שאתם רואים, העכבר הזה החתנים את הגורים בדיוק כמו האמהות לעשות - הם אפילו להתכופף מעליהם, כך זה נראה כמו גורים הם אבות. התנהגותם של עכברים קליפורניה לעומת מינים של הסוג אותו, את העכבר צבי משותף (Peromyscus maniculatus) אשר מציג עניין מועט גורים, לעתים קרובות מנסה לברוח או אפילו לתקוף אותם. (ראה תרשים 1 לתמונות של מינים אלה אינטראקציה עם הגורים.)
- לאחר מודל מינים זוהה לאחר מכן הקבוצות השונות צריכים להיות מבוססים. במחקר זה, אבות ביולוגיים, בתולות ללא ניסיון הורות, ואת בתולות עם חשיפה מוגבלת הגור (הגור חשוף או אבות אומנת) של שני המינים משמשים כך מאפיינים מצד שני נטייה ורכש ניתן להעריך. במחקר זה בפרט אנו נחשפים גם כל הקבוצות עכבר צעצוע הגור כדי להבטיח את האינטראקציות החברתיות היו ספציפיים בתגובה גור ולא נציג לכל דבר להציב בכלוב (ראה תרשים 2).
- לפני חקירת גורמי הנוירוביולוגי, חשוב לוודא מינים שנבחרו להציג הבדלים ברורים בהתנהגות של עניין. במחקר זה, גברים ממוקמות בתוך כלוב עם גור במשך חמש דקות ethogram התנהגות אבהית (ראה לוח 1 למשל של ethogram) משמש ציון התנהגויות כגון חביון הגישה הגור ואת כמות הזמן המושקע במגע עם הגור. אם התגובות אגרסיבי הם נצפו, גור הוא הסיר מיד. מפגשים אלה הם צילמו לעתים קרובות כל כך ניתוח התנהגות זהירה ניתן לבצע לאחר מכן.
2. הכנת רקמת המוח
- בעקבות זלוף סטנדרטי של כל עכבר (פרוטוקול מצורף), המוח מוסרים, כך שהם יכולים להיות מחולק באזור מסוים של ריבית (מוח מראות).
- עכבר סטנדרטי אטלס המוח (הצג אטלס) משמש כדי לאתר את גרעין paraventricular בהיפותלמוס, אזור הידוע להיות עשיר בתאי ייצור neuropeptide עניין במחקר זה - הווסופרסין (AVP).
- המוח הוא חסום אז רכוב על צ'אק הקפאת כך הרקמה יקפא לפני שהוא מחולק עם microtome. המוח מחולק במצב לקצץ עד ציוני ספציפיים מזוהים, אז עובי מוח ספציפיים, 30 מיקרון במקרה הזה, מוגדר בסעיפים המוח המשמשים לניתוח.
- חלקים במוח ממוקמים בזהירות צלחות טוב מלא חיץ מלוחים פוספט (PBS); (פרוטוקול עבור PBS המצורפת; שים לב כי זוהי רק דוגמה אחת של פרוטוקול immunocytochemistry סטנדרטי).
3. Immunocytochemistry
- במהלך השלבים השונים של תהליך זה (ראה פרוטוקול מצורף), חשוב כישורים pipetting מדויק כדי להבטיח מדידות מדויקות של כימיקלים וחומרי גלם אחרים חשובה הטכניקה הזו (סטודנט pipetting להראות).
- הצעד הראשון בתהליך זה הוא שטיפת מוח הכוללת החלפת PBS את צלחות גם שלוש עד חמש פעמים, בין לשטוף את הצלחות כל טוב מונחות על כיסא נדנדה במשך 10 דקות (הצג סטודנט החלפת PBS והצבת לוחות היטב על נדנדה) .
- פרוסות המוח נחשפים אז לפתרון נוגדן ראשוני המאוחסן ב 4 ° C במשך הלילה על הנדנדה (תהליך להראות).
- בעקבות לשטוף אחר, פרוסות המוח נחשפים נוגדנים משני במשך שעה אחת על הנדנדה בטמפרטורת החדר, לשטוף שוב.
- הבא המוח נחשפים פתרון Avitin-ביוטין קומפלקס להתכונן להדמיה של neurochemical חיובי תאים.
- עבור השלב הסופי להדמיה, המוח נחשפים DAB. זהו מוצר מסוכנים תמיד צריך להיות מטופל בזהירות. כפי שראינו כאן, פרוסות המוח מתחילים לקבל כהה מול העיניים (הצג התהליך).
- בעקבות החשיפה DAB, המוח לעבור סדרת האחרון של שוטף והם מכן הניח בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ לספסל ואיפשר לו להתייבש במשך הלילה (להראות את המיקום של פרוסת המוח בשקופית, ראה פרוטוקול מצורף עבור שקופיות לספסל).
- השקופיות נמחקים אז דרך סדרה של מים מזוקקים שוטף ואלכוהול, סוף סוף להיות שקוע Citrosolv בטרם coverslipped ומאוחסנים slidebox למשמרת (הצג את ההיבטים השונים של התהליך הזה, ראו קובץ מצורף על תהליך ניקוי).
4. Neuroquantification
- לאחר השקופיות התייבשו, הם יכולים להעריך עם תוכנת neuroquantification מיוחדים. הנה תוכנה Bioquant משמש לכמת את הווסופרסין חיובי תאים וסיבים בגרעין paraventricular של מוח עכבר (הצג התוכנה על המסך ... ואת המיקרוסקופ).
- אזור מסוים של עניין מזוהה באמצעות אפשרויות המדידההתוכנה להקים את שדה הראייה עבור neuroquantification. חשוב גודל עקבי שדה הראייה היא לכמת עבור כל חיה (תלמיד להראות עושה את זה).
- כאן מוכתם בקדרות הווסופרסין-immunoreactive גופי התא וסיבים ניכרות. מאחר שקשה לספור או לעקוב אחר זו רקמה, תכונה מיוחדת של תוכנה זו משתמשת thresholding אור כדי לקבוע את הסכום הכולל של רקמה צבעונית חיובי בתחום מסוים של ריבית. Thresholding זה אומר לנו כמה האזור שצוין הכלול הווסופרסין חיובי רקמות (להראות את הערך נתונים על מסך המחשב).
5. ניתוח התנהגותי
- אם אחד או יותר של הצופה תהיה מניה קלטות, חשוב להקים בין rater אמינות להבטיח כי המשקיפים הם הבקיע את ההתנהגות באופן עקבי. במשך הפגישה הבקיע בפועל, גיליון הניקוד התנהגות צריכים להיות מוכנים, כדי לאפשר ניקוד קל של התנהגות במהלך הפגישות תצפית (ראה טבלה 2 למשל של מניה בגיליון האלקטרוני).
- עבור התנהגויות שאינן התגובות אפיזודי מהירה, ניתוח microsequencing יכול לחשוף דקויות על התקדמות של תגובות ספציפיות. לדוגמה, טיפוח התנהגות מורכבת שרשרת של תגובות מהר מאוד. למרות אפשרות אחת היא פשוט להקליט את נוכחות ומשך הטיפוח, אחרת היא לתעד את השתלשלות האירועים המלווים את התגובה הזאת. באמצעות תוכנה זו microsequencing, משקיפים ציון נוכחות של התנהגות מסוימת בכל שנייה, כפי שתתבקש על ידי התוכנה (תוכנה להראות ווידאו).
- לאחר איסוף נתונים, פרמטרים של עניין נקבעים ואת עשרות התנהגות המתאימה מנותחים. דוגמאות ניתן משך הזמן המושקע הכולל של במגע עם הגור, או מספר הפרעות ברצף הטיפוח (להראות מחשב עם גיליון התפשטות עם הנתונים שהוזנו עבור כל חיה).
- לאחר התנהגות הבקיע חשוב מאשרים כי שני מינים הציג אסטרטגיות תגובה שונות להתנהגות של עניין במחקר. במקרה זה העכברים צבי קליפורניה צריך להפגין התנהגות אבהית יותר מאשר עכברים צבי משותף. בנוסף, אמצעים התנהגותיים שונים יכולים להיות מתואמים עם אמצעים המוח כדי לקבל תצוגה מושכלות יותר של השפעות הרלוונטיים.
6. נציג תוצאות:
- כדי לאמת את המודל, הנתונים צריכים עולה בבירור כי שני המינים שונה ביצע לגבי התנהגות של עניין. כאן תוכלו לראות כי פ הזכרים californicus בילו זמן רב יותר הטיפוח ואת כורעת על הגורים, שני סימני ההיכר של התגובות אבהי (ראה תרשים 4).
- על מנת לקבוע אם המשתנה neurobiologial עניין חשוב בתגובות אבהי, כמות הווסופרסין (AVP) חיובי רקמות היה לכמת עבור מספר אזורים במוח הרלוונטיים; כפי שניתן לראות, פ אבהי בעלי חיים californicus היה רקמת יותר החיסונית חיובי בכמה אזורים אלה במוח. (ראה איור 5).
- במחקר קשור באמצעות ניתוח microsequencing, זה היה שיערו כי האב עכברים קליפורניה היו מפגינים חרדה פחות מאשר עמיתיהם בתולה שלהם, ולפיכך, כאשר הם נחשפים ריח טורף, האבות הפגינו פחות הפרעות ברצף הטיפוח מאשר החיות בתולה (ראה תרשים 6).
איור 1: (א) זכר עכברים קליפורניה מציג תגובות אבהי כלפי הגור זר conspecific. (ב) עכבר צבי זכר מציג גישה זהירה (מתיחה להשתתף) ותגובת הימנעות בנוכחות זר conspecific הגור. הערה: הערכות אלה אינטראקציה חברתית, אם גבר מפגין תגובות אגרסיביות כלפי הגור, הנסיינים מיד להכות את החלק העליון של הכלוב כדי להסיח את דעתם של גברים. בשלב זה הפגישה מסתיימת ואת הגור מוסר, נבדק עבור כל הפצעים וחזר האם. במעבדה שלנו, זה רק לעתים נדירות הוא ציין עם פ הזכרים californicus אבל מדי פעם הוא ציין עם פ maniculatus; תצפית קרובה התערבות מיידית, עם זאת, למנוע את התרחשות הנזק לבעלי החיים.
איור 2: עכבר קליפורניה אינטראקציה עם עכבר צעצוע, רוב ניסה ללעוס גירויים אלה.
איור 3: עיצוב ניסיוני של המחקר, היו כ 6 חיות בכל קבוצה עבור כל מין.
איור 4: גרפי של תהליך immunocytochemistry.
תאנהיור 5 תגובות אבהי קליפורניה ועכברים צבי;. התגובות אבהי יותר (החתן, לכרוע, גישה מהירה יותר) נצפו עכברים קליפורניה. למתוח עוד משתתפת (תגובת הלחץ) נצפו עכברים צבי.
איור 6. Immunoreactivity וזופרסין באזורי מוח שונים של שני המינים. העכברים קליפורניה היה מכתים יותר בתאי PVN וסיבים.
איור 7: אבי האב עכברים קליפורניה הציג שיבושים פחות רצפים הטיפוח שלהם בנוכחות של ריח טורף מאשר הקבוצות הגור, חשוף בתולה.
Discussion
מאמר זה דן שלושה מרכיבים חיוניים חשב להיות קריטי עבור ביצוע מוצלח של התנהגות חקירות מדעי המוח: (1) מודל החיה נציג תקף; (2) פרוטוקול immunocytochemistry מדויק ורגיש; ו (3) ניתוח ביותר (תצפית סטטיסטית ) של שני הנתונים התנהגות המוח. טעויות בקטגוריה אחת יהיה בהחלט לסכן את התוצאות של המחקר כולו. לפיכך, לאחר בזהירות בבחירת מודל בעל חיים מתאים, מאמץ ניכר צריכה להיות מופנית כלפי הטייס בודק את נהלי התנהגות היסטולוגית כדי להבטיח את התנהגותם יקויימו אמין במחקר, ואחריו עיבוד מוצלח של המוח.
כפי שהוזכר קודם לכן, השימוש מינים השוואתי לזהות מנגנוני הנוירוביולוגי התגובה מסוים הוא גישה מתודולוגית יקר כי טכניקה זו אינה דורשת הנדסה גנטית או מניפולציה כירורגית כואבת. לכן, זו הגישה המתודולוגית מנצל פחות מאוים, בעלי חיים שלמים. השימוש וריאציות הטבעי של החיות, לעומת זאת, מתחזקת על ידי שילוב של סביבות טבעיות, כמו גם אם הם שוכנו חיות במעבדה. יתר על כן, אם במחקרי מעבדה ניתן להרחיב את השדה כדי להמשיך לאמת את האותנטיות של הבדלי המינים בהתנהגות של עניין, הצעד הבא זה מומלץ. למרות גישה השוואתית מציע יתרונות רבים, מגבלה טבעו המתאם של הנתונים, וכתוצאה מכך, טכניקות נוספות כגון מניפולציות תרופתי צריך לשמש נוספת לאמת את התפקיד של מערכות הנוירוביולוגי ממוקד התנהגות של עניין.
לאחר הנסיינים מרגיש בטוח לגבי הנהלים התנהגותיים, היסטולוגית ו סטטיסטית, יש להיזהר כך את תנאי המחיה של בעלי החיים נשארים קבועים לכל הקבוצות למעט, כמובן, עבור מניפולציה הניסוי. שינויים במשתנים כגון לוחות זמנים של אור, רמות רעש, מטפלים, רמות לחות וריחות במעבדה יכולה להיות השפעה משמעותית על התגובות הנוירוביולוגי של החיות.
במאמר זה הנוגדן העיקרי ששימש לצורך זיהוי של הווסופרסין אבל נוגדנים ראשוניים אחרים יכולים לשמש שפע של neurochemicals שונים של עניין. אם הניסוי עובד עם נוגדן חדש, חשוב לבצע מחקרים על מנת לקבוע את טיטרציה דילול אופטימלי של הנוגדן החדש. פעמים רבות נוגדן רב מדי משמש (כפי שהוצע על ידי הספק), וכתוצאה מכך רקמה כהה מדי כדי לבדל את האות; יתרה מזאת, שימוש מופרז הנוגדן הוא יקר מאוד.
לבסוף, אם יותר מאשר ניתוח סטטיסטי יחיד יכול לשמש כדי לספק בתצוגות חלופיות ופירושים של הנתונים, הם צריכים להיות מנוצל. במחקר זה בפרט, הכללית מודלים ליניאריים, מתאמי, ומנתח דרוג ממדי שימשו כדי לספק תצוגות אינפורמטיבי ביותר של הנתונים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענק לא. 0723341 (כדי KGL) מן הקרן הלאומית למדע. גם אנחנו אסירי תודה על התרומות הניתנים על ידי תוכנית מחקר לתואר ראשון שפירו אחוות והמחלקה לפסיכולוגיה באוניברסיטת רנדולף, מייקון קולג'. לבסוף, אנו מעריכים את תרומתו שיתופי קרייג של קינסלי במחקר זה ולעזור אמנדה Rzucidlo בהכנת R-MC מעבדה במאמר זה וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
