Summary
De vergelijkende soort aanpak maakt het mogelijk gedrag neurowetenschappers te verkennen verschillende neurobiologische factoren die samenhangen met specifiek gedrag gezien als kenmerk van een specifiek dier model. Door gebruik te maken van natuurlijk voorkomende verschillen in gedrag tussen nauw verwante soorten, werkt deze techniek niet nodig invasieve technieken om de expressie van het gedrag te manipuleren.
Abstract
Een doel van Behavioral Neuroscience is het identificeren van de onderliggende neurobiologische factoren die specifiek gedrag reguleren. Met behulp van diermodellen om dit doel te bereiken, een groot aantal methodologische strategieën vereisen invasieve technieken om de intensiteit van het gedrag van belang (bijvoorbeeld, laesie methoden, farmacologische manipulaties, microdialyse technieken, genetisch gemanipuleerde diermodellen) te manipuleren. Het gebruik van een vergelijkende soort benadering stelt onderzoekers in staat om te profiteren van nature voorkomende verschillen in respons strategieën bestaan in nauw verwante soorten. In ons lab, gebruiken we twee soorten van het genus Peromyscus die verschillen in vaderlijke reacties. De mannelijke herten California muis (Peromyscus californicus) vertoont dezelfde ouderlijk reacties als de vrouwelijke terwijl zijn neef, de gemeenschappelijke herten muis (Peromyscus maniculatus) vertoont vrijwel geen verzorgende / ouders de reacties in de aanwezigheid van de pups. Van specifiek belang in dit artikel is een verkenning van de neurobiologische factoren die samenhangen met de affiliatief maatschappelijke reacties tentoongesteld door de vaderlijke Californië hert muis. Omdat de Behavioral Neuroscience aanpak is veelzijdig, zal de volgende belangrijke onderdelen van de studie kort worden aangepakt: het identificeren van de juiste soort voor dit type onderzoek, het verzamelen van gegevens voor gedragsanalyse, voorbereiding en snijden van de hersenen; basisstappen die betrokken zijn bij immunocytochemie voor de kwantificering van vasopressine-immunoreactiviteit, het gebruik van neuroimaging software om het hersenweefsel te kwantificeren, het gebruik van een microsequencing video analyse om het gedrag van scoren en, ten slotte, de passende statistische analyses om de meest op de hoogte interpretaties van de onderzoeksresultaten te bieden.
Protocol
1. Identificatie van de Animal Model
- De California Deer Mouse (Peromyscus californicus) is een ideaal model om vaderlijke reacties te verkennen. Zoals u ziet, deze muis grooms de pups net als de moeders doen - zelfs Crouch over hen, zodat het lijkt alsof de pups zijn verpleging. Het gedrag van de California muizen wordt vergeleken met een soort van hetzelfde geslacht, de gemeenschappelijke herten muis (Peromyscus maniculatus), die weinig interesse in de pups vertoont, vaak proberen te ontsnappen of zelfs aan te vallen. (Zie figuur 1 voor foto's van deze soorten interactie met pups.)
- Zodra de soort model is vastgesteld dan de verschillende groepen moeten worden vastgesteld. In deze studie, zijn biologische vader, maagden met geen ouderschap ervaring, en maagden met een beperkte blootstelling aan pup (pup-belichte of te bevorderen vaders) van beide soorten gebruikt, zodat zowel de aanleg en verworven vaderlijke kenmerken kunnen worden beoordeeld. In dit specifieke studie hebben we ook blootgesteld alle groepen een speelgoed muis pup om te verzekeren dat de sociale interacties die specifiek zijn voor een pup en niet een vertegenwoordiger reactie op alles geplaatst in de kooi (zie figuur 2).
- Voor onderzoek naar neurobiologische factoren, is het belangrijk om te bevestigen dat de geselecteerde soorten duidelijke verschillen in het gedrag van belang vertonen. In deze studie, zijn mannen in een kooi met een pup voor vijf minuten en een vaderlijke gedrag ethogram (zie tabel 1 voor voorbeeld van een ethogram) wordt gebruikt om te scoren gedrag, zoals vertraging van de pup en de hoeveelheid tijd doorgebracht in contact met de aanpak van de pup. Als agressieve reacties worden waargenomen, is de pup onmiddellijk verwijderd. Deze sessies zijn vaak gefilmd, zodat een zorgvuldige gedragsanalyse kunnen vervolgens worden uitgevoerd.
2. Voorbereiden van hersenweefsel
- Na een standaard perfusie van elke muis (protocol bijgevoegd), worden de hersenen verwijderd zodat ze kunnen worden coupes in het specifieke gebied van belang (show hersenen).
- Een standaard muis hersenen atlas (show atlas) wordt gebruikt om de paraventriculaire nucleus in de hypothalamus, een gebied dat bekend staat om rijk te worden in de cellen produceren van de neuropeptide van belang in dit onderzoek vinden - vasopressine (AVP).
- De hersenen wordt dan geblokkeerd en gemonteerd op een bevriezing boorkop, zodat het weefsel zal bevriezen voordat ze coupes met de microtoom. Het brein is verdeeld in een TRIM MODE tot er concrete monumenten worden geïdentificeerd, dan is de specifieke hersengebieden dikte van 30 micron in dit geval, is ingesteld voor de hersenen secties gebruikt voor analyse.
- De hersenen secties worden zorgvuldig geplaatst in goed platen gevuld met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), (protocol voor PBS verbonden; Let op: dit is slechts een voorbeeld van een standaard protocol immunocytochemie).
3. Immunocytochemie
- Gedurende de verschillende stappen van dit proces (zie bijgevoegde protocol), is het belangrijk om nauwkeurig pipetteren vaardigheden om nauwkeurige metingen te garanderen van chemicaliën en andere ingrediënten belangrijk voor deze techniek (show student pipetteren).
- De eerste stap in dit proces is het wassen van de hersenen, die behelst de vervanging van de PBS in de goed platen drie tot vijf keer, tussen elke wasbeurt de well platen worden geplaatst op een rocker gedurende 10 minuten (laat student vervangt PBS en het plaatsen van putjes op rockers) .
- De hersenen plakjes worden dan blootgesteld aan het primaire antilichaam oplossing en bewaard bij 4 ° C gedurende de nacht op de rocker (show-proces).
- Naar aanleiding van een ander wassen, zijn de hersenen plakjes blootgesteld aan een tweede antilichaam voor een uur op de wip bij kamertemperatuur, dan weer gewassen.
- Vervolgens worden de hersenen worden blootgesteld aan een Avitin-biotine Complex oplossing voor te bereiden voor de visualisatie van de neurochemische-positieve cellen.
- Voor de laatste visualisatie stap worden de hersenen blootgesteld aan DAB. Dit is een gevaarlijk product en moet altijd worden behandeld met de nodige voorzichtigheid. Zoals hier te zien, de hersenen plakjes beginnen te donkerder te krijgen voor je ogen (show-proces).
- Naar aanleiding van de DAB-belichting, de hersenen gaan door de laatste serie van wast en zijn vervolgens zorgvuldig geplaatst op subbed objectglaasjes en laten drogen 's nachts (laat de plaatsing van een brein slice op een dia, zie bijlage voor subbed dia-protocol).
- De dia's worden dan gewist door een serie van gedestilleerd water en alcohol wast, eindelijk ondergedompeld in Citrosolv alvorens te worden afgedekt en opgeslagen in een slidebox voor het veilig houden van (tonen verschillende aspecten van dit proces; zie bijlage voor het opruimen van proces).
4. Neuroquantification
- Na de dia's zijn opgedroogd, kunnen ze worden beoordeeld met gespecialiseerde neuroquantification software. Hier Bioquant software wordt gebruikt om de vasopressine-positieve cellen en vezels te kwantificeren in de paraventriculaire kern van de muis hersenen (show-software op het scherm ... en microscoop).
- Het specifieke gebied van belang is geïdentificeerd met behulp van de meting optiesvan de software om het visuele veld vast te stellen voor neuroquantification. Het is belangrijk dat een consistente visuele veld grootte is gekwantificeerd voor elk dier (toon student om dit te doen).
- Hier is het donker gekleurde vasopressine-immunoreactieve cellichamen en vezels zijn duidelijk zichtbaar. Omdat het moeilijk is te tellen of sporen van dit weefsel, een speciale eigenschap van deze software gebruik maakt van licht drempeling om de totale hoeveelheid van positief gekleurde weefsel te bepalen binnen het opgegeven interessegebied. Deze drempelwaarden vertelt ons hoeveel van het opgegeven gebied bevatte vasopressine-positieve weefsel (laat de gegevens waarde op het computerscherm).
5. Behavioral Analysis
- Als er meer dan een waarnemer zal het scoren van de videobanden, is het belangrijk om interbeoordelaarsbetrouwbaarheid te stellen om te verzekeren dat de waarnemers zijn het gedrag op een consistente manier scoren. Voor de feitelijke score sessie, moeten een gedrag scoreblad bereid zijn om voor het eenvoudig scoren van gedragingen te kunnen observeren tijdens de sessies (zie tabel 2 voor voorbeeld van het scoren spread sheet).
- Voor gedragingen die niet snel episodisch reacties, kan een microsequencing analyse blijkt subtiliteiten over de progressie van de specifieke antwoorden. Bijvoorbeeld, poetsgedrag bestaat uit een keten van zeer snelle respons. Hoewel het een optie is om gewoon registreren de aanwezigheid en de duur van de verzorging, een ander is het documenteren van de keten van gebeurtenissen bij deze reactie. Met behulp van deze microsequencing software, waarnemers score de aanwezigheid van een bepaald gedrag elke seconde, zoals gevraagd door de software (show-software en video).
- Na het verzamelen van gegevens, zijn de parameters die van belang bepaald en de juiste gedrags-scores worden geanalyseerd. Voorbeelden zijn totale duur van de tijd doorgebracht in contact met de pup, of het aantal storingen in de verzorging volgorde (show computer met spread sheet met gegevens die zijn ingevoerd voor elk dier) zijn.
- Zodra het gedrag wordt gescoord is het belangrijk om te bevestigen dat de twee soorten verschillende responsstrategieën tentoongesteld voor het gedrag van interesse in de studie. In dit geval is het California hert muizen zou moeten vertonen meer vaderlijke gedrag dan de gewone herten muizen. Daarnaast kunnen verschillende gedragsmaatregelen worden gecorreleerd met de hersenen maatregelen om een beter onderbouwd overzicht van de relevante invloeden te krijgen.
6. Representatieve resultaten:
- Om valideren van het model, moeten de gegevens geven duidelijk aan dat de twee soorten verschillend uitgevoerd met betrekking tot het gedrag van belang. Hier zie je dat de P. californicus mannen besteedde meer tijd verzorging en ineengedoken over de pups, twee kenmerken van vaderskant reacties (zie figuur 4).
- Om te bepalen of de neurobiologial variabele rente is belangrijk in vaderlijke reacties, de hoeveelheid vasopressine (AVP)-positieve weefsel werd gekwantificeerd voor de verschillende relevante hersengebieden, zoals te zien is, de vaderlijke P. californicus dieren had meer immuun-positieve weefsel in een aantal van deze hersengebieden. (Zie figuur 5).
- In een gerelateerde studie met behulp van de microsequencing analyse, werd de hypothese dat de vaderlijke Californië muizen zouden minder angst dan hun maagdelijke tegenhangers vertonen, daarom, bij blootstelling aan een roofdier geur, de vaders minder onderbrekingen tentoongesteld in de verzorging volgorde dan de maagd dieren (zie figuur 6).
Figuur 1: (A) Man California muizen vertonen vaderlijke de reacties in de richting van soortgenoten alien pup. (B) Man herten muis vertoont een voorzichtige aanpak (stretch bij te wonen) en het vermijden respons in de aanwezigheid van een vreemde soortgenoten pup. Opmerking: In deze sociale interactie evaluaties, als een mannelijke agressieve reacties vertoont in de richting van de pup, de onderzoekers meteen raakte de bovenkant van de kooi aan de mannelijke af te leiden. Op dit moment is de sessie wordt beëindigd en de pup wordt verwijderd, gecontroleerd op eventuele verwondingen en keerde terug naar de moeder. In ons laboratorium, dit zelden wordt waargenomen met P. californicus mannen, maar wordt af en toe waargenomen met P. maniculatus, nauwkeurige observatie en onmiddellijke interventie echter te voorkomen dat schade zich voordoet voor de dieren.
Figuur 2: Een California muis interactie met een speelgoed muis, de meeste probeerde te kauwen op deze stimuli.
Figuur 3: Experimentele ontwerp van de studie, waren er ongeveer 6 dieren in elke groep voor elke soort.
Figuur 4: Grafische van immunocytochemie proces.
Vijgure vijf vaders reacties in de Californische en herten muizen;. meer vaderlijke reacties (bruidegom, hurken, snellere aanpak) werden waargenomen in de Californische muizen. Meer stretch woont (stress respons) werden waargenomen in de herten muizen.
Figuur 6. Vasopressine immunoreactiviteit in verschillende hersengebieden van beide soorten. De California muizen hadden meer kleuring in de PVN cellen en vezels.
Figuur 7: Paternal Californië muizen minder storingen vertoonden in hun verzorgen sequenties in de aanwezigheid van een roofdier geur dan de pup-blootgestelde en maagd groepen.
Discussion
Dit artikel bespreekt drie essentiële componenten denken kritisch te zijn voor het succesvol uitvoeren van gedrags-neurowetenschappen onderzoeken: (1) een representatief en valide diermodel, (2) een nauwkeurige en gevoelige immunocytochemie protocol, en (3) de meest analyse (observatie en statistische ) van zowel de gedrags-en hersenen data. Fouten in een enkele categorie zal zeker afbreuk doen aan de resultaten van de hele studie. Vandaar dat na zorgvuldig selecteren van de juiste diermodel, moeten grote inspanningen worden gericht op pilot-testen van de gedrags-en histologische procedures om te verzekeren dat het gedrag zal op betrouwbare wijze worden waargenomen in het onderzoek, gevolgd door de succesvolle verwerking van de hersenen.
Zoals eerder vermeld, het gebruik van vergelijkende soorten neurobiologische mechanismen van een bepaalde respons te identificeren is een waardevolle methodologische benadering, omdat deze techniek vereist geen genetische manipulatie of pijnlijke chirurgische manipulaties. Zo, deze methodologische aanpak maakt gebruik van minder bedreigd, intacte dieren. Het gebruik van de natuurlijke variaties van de dieren, maar wordt versterkt door de incorporatie van de natuurlijke-achtige omgevingen, zelfs als de dieren zijn gehuisvest in het laboratorium. Verder, als laboratoriumstudies kan worden uitgebreid tot het veld om verder te valideren de authenticiteit van de soorten verschillen in het gedrag van belang, wordt deze volgende stap te raden. Hoewel de vergelijkende benadering biedt veel voordelen, een beperking is het correlatief aard van de gegevens, dus aanvullende technieken zoals de farmacologische manipulaties moeten gebruikt worden om verder te valideren van de rol van gerichte neurobiologische systemen in het gedrag van belang.
Zodra de onderzoekers vertrouwen over de gedrags-, histologische en statistische procedures, moet erop worden genomen die de levensomstandigheden van de dieren constant blijven voor alle groepen, behalve, natuurlijk, voor de experimentele manipulatie. Veranderingen in de variabelen, zoals het licht schema's, geluidsniveau, verzorgers, vochtigheidsgraad en geuren in het laboratorium zou kunnen hebben aanzienlijke gevolgen voor de dieren neurobiologische reacties.
In dit artikel wordt het primaire antilichaam werd gebruikt voor de detectie van vasopressine, maar andere primaire antilichamen kunnen worden gebruikt voor een overvloed van verschillende neurochemicaliën van belang. Als de onderzoeker is het werken met een nieuw antilichaam, is het belangrijk om titratie studies uit te voeren om de optimale verdunning van het nieuwe antilichaam te bepalen. Vele malen te veel antilichaam wordt gebruikt (zoals voorgesteld door de verkoper), wat resulteert in weefsel dat is te donker om het signaal te differentiëren, verdere, overmatig gebruik van het antilichaam is erg duur.
Tot slot, als er meer dan een statistische analyse kan worden gebruikt om alternatieve opvattingen en interpretaties van de gegevens te verstrekken, moeten ze worden gebruikt. In dit specifieke onderzoek werden algemene lineaire modellen, correlationeel, en multidimensionaal scaling analyses gebruikt om de meest informatieve weergave van de gegevens te verstrekken.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidie niet. 0723341 (naar KGL) van de National Science Foundation. We zijn ook dankbaar voor de bijdragen die door de Schapiro Undergraduate Research Fellowship-programma en de afdeling psychologie aan Randolph-Macon College. Tot slot, wij waarderen gezamenlijke bijdragen van Craig Kinsley's in dit onderzoek en Amanda Rzucidlo de hulp bij de voorbereiding van de R-MC laboratorium voor deze video artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
