Summary
L'approche comparative permet espèces neuroscientifiques comportementaux d'explorer différents facteurs neurobiologiques associés à des comportements spécifiques considérés comme caractéristiques d'un modèle animal spécifique. Profitant de naturellement des différences de comportement entre espèces étroitement apparentées, cette technique ne nécessite pas de techniques invasives pour manipuler l'expression du comportement.
Abstract
Un but de neuroscience comportementale est d'identifier les facteurs sous-jacents qui régulent neurobiologiques des comportements spécifiques. En utilisant des modèles animaux pour atteindre cet objectif, plusieurs stratégies méthodologiques nécessitent des techniques invasives pour manipuler l'intensité du comportement d'intérêt (par exemple, les méthodes lésion, manipulations pharmacologiques, les techniques de microdialyse, des modèles animaux génétiquement modifiés). L'utilisation d'une approche comparative des espèces permet aux chercheurs de tirer profit des différences naturelles dans les stratégies de réponse existantes dans les espèces étroitement apparentées. Dans notre laboratoire, nous utilisons deux espèces du genre Peromyscus qui diffèrent dans les réponses paternelle. La souris sylvestre hommes Californie (Peromyscus californicus) présente les mêmes réponses des parents comme de la femelle tandis que sa cousine, la souris sylvestre commune (Peromyscus maniculatus) présente pratiquement pas de réponses nourrir / parents dans la présence de ratons. D'un intérêt particulier dans cet article est une exploration des facteurs neurobiologiques liés à l'affiliation des réponses sociales exposées par la souris en Californie cerfs paternelle. Parce que l'approche des neurosciences comportementales est multiforme, les éléments clés suivants de l'étude seront brièvement abordés: l'identification des espèces appropriées pour ce type de recherche, la collecte de données pour l'analyse comportementale, la préparation et le sectionnement des cerveaux; étapes de base de l'immunocytochimie pour la la quantification de la vasopressine-immunoréactivité, l'utilisation de logiciels de neuro-imagerie afin de quantifier le tissu cérébral, l'utilisation d'une analyse vidéo microséquençage au score de comportement et, enfin, les analyses statistiques appropriées pour fournir des interprétations les plus informés des résultats de recherche.
Protocol
1. Identification du modèle animal
- La souris sylvestre Californie (Peromyscus californicus) est un modèle idéal pour explorer les réponses paternelle. Comme vous le voyez, cette souris palefreniers les chiots comme les mamans font - ils ont même s'accroupir sur eux de sorte qu'il ressemble à des chiots sont des soins infirmiers. Le comportement de la souris par rapport à la Californie est une espèce du même genre, la souris sylvestre commune (Peromyscus maniculatus) qui présente peu d'intérêt pour les chiots, souvent essayant de s'échapper, ou même les attaquer. (Voir Figure 1 pour des photos de ces espèces en interaction avec les chiots.)
- Une fois le modèle des espèces a été identifié, puis les différents groupes doivent être établis. Dans cette étude, les pères biologiques, les vierges qui n'ont aucune expérience parentale, et vierges avec l'exposition des petits limitée (pup-exposées ou les pères d'accueil) des deux espèces sont utilisées afin que les deux prédisposés et a acquis des caractéristiques paternelles peuvent être évalués. Dans cette étude particulière nous avons aussi tous les groupes exposés à une souris jouet chiot pour s'assurer que les interactions sociales étaient spécifiques à un chiot et non une réponse à tout représentant placé dans la cage (voir Figure 2).
- Avant d'enquêter sur des facteurs neurobiologiques, il est important de confirmer que les espèces sélectionnées présentent de nettes différences dans le comportement de l'intérêt. Dans cette étude, les mâles sont placés dans une cage avec un chiot pendant cinq minutes et un éthogramme comportement paternel (voir le tableau 1, par exemple des éthogramme) est utilisé pour marquer les comportements tels que la latence d'approche du chiot et la quantité de temps passé en contact avec le chiot. Si des réactions agressives sont observées, le chiot est immédiatement supprimé. Ces sessions sont souvent filmées afin d'une analyse minutieuse du comportement peut ensuite être réalisée.
2. Préparation des tissus du cerveau
- Après une perfusion standards de chaque souris (protocole ci-joint), les cerveaux sont prélevés afin qu'ils puissent être sectionné dans le domaine d'intérêt spécifique (cerveau spectacle).
- Une norme de cerveau de souris atlas (montrer atlas) est utilisé pour localiser le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus, une région connue pour être riche en cellules produisant le neuropeptide d'intérêt dans cette étude - vasopressine (AVP).
- Le cerveau est alors bloqué et monté sur un mandrin de congélation de sorte que le tissu se fige avant d'être sectionné avec le microtome. Le cerveau est sectionnée dans un mode de garniture jusqu'au repère spécifiques sont identifiés, puis l'épaisseur spécifique du cerveau, de 30 microns dans ce cas, est prévue pour les sections du cerveau utilisées pour l'analyse.
- Les sections du cerveau sont soigneusement placés dans des assiettes bien remplies avec un tampon phosphate salin (PBS); (protocole d'attachés PBS, s'il vous plaît noter que ce n'est qu'un exemple d'un protocole immunocytochimie standard).
3. Immunocytochimie
- Tout au long des différentes étapes de ce processus (voir le protocole ci-joint), il est important d'avoir des compétences précises de pipetage pour assurer des mesures précises de produits chimiques et d'autres ingrédients importants pour cette technique (pipetage étudiants spectacle).
- La première étape de ce processus est de se laver les cerveaux, qui consiste à remplacer le CPE dans les assiettes ainsi trois à cinq fois; entre chaque lavage des plaques ainsi sont placées sur une bascule de 10 minutes (montrer aux étudiants remplaçant PBS et en plaçant les plaques bien sur rockers) .
- Les tranches de cerveau sont ensuite exposés à la solution d'anticorps primaire et conservés à 4 ° C pendant la nuit sur la bascule (processus de spectacle).
- Après un autre lavage, les tranches de cerveau sont exposées à un anticorps secondaire pendant une heure sur la bascule à la température ambiante, puis lavés à nouveau.
- Suivant les cerveaux sont exposés à une solution Avitin-biotine pour se préparer à la visualisation des cellules neurochimique-positif.
- Pour l'étape de visualisation finale, les cerveaux sont exposés à la DAB. Ceci est un produit dangereux et devraient toujours être manipulés avec prudence. Comme on le voit ici, les tranches du cerveau commencent à s'assombrir devant vos yeux (montrer des processus).
- Suite à l'exposition DAB, le cerveau passent par la dernière série de lavages et sont ensuite soigneusement placés sur des lames de microscope subbed et laisser sécher durant la nuit (montrer le placement d'une tranche de cerveau sur une lame; voir la pièce jointe pour le protocole de diapositives subbed).
- Les lames sont ensuite compensées par une série de lavages à l'eau et de l'alcool distillé, d'être finalement submergés dans Citrosolv avant d'être lamelle et stockées dans un Slidebox pour garder sûr (montrer les différents aspects de ce processus, voir l'attachement des processus de compensation).
4. Neuroquantification
- Après les diapositives ont séché, elles peuvent être évaluées avec le logiciel neuroquantification spécialisés. Voici un logiciel Bioquant est utilisé pour quantifier les cellules vasopressine-positifs et des fibres dans le noyau paraventriculaire du cerveau de souris (montrer le logiciel à l'écran ... et le microscope).
- Le domaine d'intérêt spécifique est identifié en utilisant les options de mesuredu logiciel pour établir le champ visuel pour neuroquantification. Il est important que la taille du champ visuel cohérent est quantifié pour chaque animal (étudiant montrent ce faire).
- Voici les corps colorés en foncé cellules vasopressine-immunoréactive et les fibres sont apparentes. Parce qu'il est difficile de compter ou de trace de ce tissu, une caractéristique particulière de ce logiciel utilise la lumière pour seuillage déterminer le montant total du tissu colorées positivement dans la zone d'intérêt spécifié. Ce seuillage nous indique de combien de la zone spécifiée contenait vasopressine-positif tissus (montrer la valeur des données sur l'écran d'ordinateur).
5. Analyse comportementale
- Si plus d'un observateur sera notation des bandes vidéo, il est important d'établir fiabilité inter-évaluateurs pour assurer que les observateurs sont marquant le comportement d'une manière cohérente. Pour la session notation réelle, une feuille de pointage de comportement doit être préparé pour permettre notation facile du comportement pendant les séances d'observation (voir le tableau 2 pour exemple de notation tableur).
- Pour les comportements qui ne sont pas rapides réponses épisodique, une analyse peut révéler microséquençage subtilités sur la progression des réponses spécifiques. Par exemple, le comportement de toilettage consiste en une chaîne de réactions très rapides. Bien que d'une option est de simplement enregistrer la présence et la durée de toilettage, une autre est de documenter la chaîne des événements qui accompagne cette réponse. En utilisant ce logiciel microséquençage, les observateurs score de la présence d'un comportement particulier à chaque seconde, comme demandé par le logiciel (software spectacle et vidéo).
- Après la collecte des données, les paramètres d'intérêt sont déterminés et les scores comportementaux appropriés sont analysés. Des exemples peuvent être la durée totale du temps passé en contact avec le chiot, ou le nombre d'interruptions dans la séquence de toilettage (montrer ordinateur avec tableur avec les données saisies pour chaque animal).
- Une fois que le comportement est marqué il est important de confirmer que les deux espèces présentaient des stratégies d'intervention différentes pour le comportement de l'intérêt dans l'étude. Dans ce cas, la souris sylvestre Californie devrait présenter un comportement plus paternel que les souris cerfs communs. De plus, diverses mesures comportementales peuvent être corrélées avec les mesures du cerveau pour obtenir une vision plus éclairée des influences pertinentes.
6. Les résultats représentatifs:
- Pour valider le modèle, les données devraient indiquer clairement que les deux espèces effectué différemment à l'égard du comportement de l'intérêt. Ici vous pouvez voir que le P. mâles californicus passé plus de temps de toilettage et accroupi sur les chiots, deux caractéristiques des réponses paternelle (voir Figure 4).
- Afin de déterminer si la variable d'intérêt est neurobiologial important dans les réactions paternelle, le montant de la vasopressine (AVP)-positifs tissus a été quantifiée pour plusieurs zones du cerveau concernées; comme on peut le voir, le père P. animaux californicus avait plus de tissu immunitaire positive dans plusieurs de ces zones du cerveau. (Voir Figure 5).
- Dans une étude connexe en utilisant l'analyse microséquençage, il a été émis l'hypothèse que la Californie paternelle souris présentent moins d'anxiété que leurs homologues vierge; en conséquence, lorsqu'ils sont exposés à une odeur de prédateurs, les pères exposés moins d'interruptions dans la séquence de toilettage que les animaux vierges (voir Figure 6).
Figure 1: (A) Des souris mâles présentant des réponses en Californie paternelle envers conspécifiques chiot extraterrestre. (B) la souris sylvestre Homme présentant une approche prudente (étirement participer) et la réaction d'évitement, en présence d'un étranger conspécifiques chiot. Remarque: Dans ces évaluations interaction sociale, si un homme présente des réactions agressives envers le chiot, les expérimentateurs immédiatement frappé le haut de la cage pour distraire le mâle. A ce moment la session est terminée et que le chiot est retiré, inspecté pour déceler toute blessure et est retourné à la mère. Dans notre laboratoire, ce qui est rarement observé avec P. mâles californicus mais il est parfois observé avec P. maniculatus; observation attentive et une intervention immédiate, cependant, prévenir les dommages de se produire pour les animaux.
Figure 2: Une souris en Californie en interaction avec une souris jouet; les plus essayé de mâcher sur ces stimuli.
Figure 3: Dispositif expérimental de l'étude, il y avait environ 6 animaux de chaque groupe pour chaque espèce.
Figure 4: graphique des processus d'immunocytochimie.
FigLa figure 5 réponses paternel dans la Californie et la souris sylvestre;. réponses plus paternel (marié, s'accroupir, approche plus rapide) ont été observées chez les souris en Californie. Plus étirer assiste (réponse au stress) ont été observées dans les souris sylvestres.
Figure 6. Immunoréactivité vasopressine dans différentes zones du cerveau des deux espèces. Les souris Californie avait plus de coloration dans les cellules et les fibres PVN.
Figure 7: paternel souris exposées en Californie moins d'interruptions dans leurs séquences de toilettage, en présence d'une odeur de prédateurs que les groupes exposés chiot et vierge.
Discussion
Cet article traite de trois composantes essentielles pensé pour être critique pour l'exécution réussie des enquêtes comportementales neurosciences: (1) un modèle animal représentatif et valable; (2) un protocole d'immunocytochimie précise et sensible, et (3) la plupart des analyses (observation et statistiques ) à la fois des données comportementales et cérébrales. Erreurs dans une seule catégorie sera très certainement compromettre les résultats de l'étude. Ainsi, après avoir soigneusement le choix du modèle animal approprié, un effort considérable doit être orientée vers des essais pilotes les procédures comportementales et histologiques de s'assurer que le comportement sera fiable observée dans l'étude, suivi par le traitement réussi du cerveau.
Comme mentionné précédemment, l'utilisation d'espèces comparative pour identifier les mécanismes neurobiologiques d'une réponse particulière est une approche méthodologique précieux parce que cette technique ne nécessite pas de génie génétique ou douloureuses manipulations chirurgicales. Ainsi, cette approche méthodologique utilise moins menacés, les animaux intacts. L'utilisation de variations naturelles des animaux, cependant, est renforcée par l'incorporation des ressources naturelles-comme les environnements, même si les animaux sont logés dans le laboratoire. En outre, si les études en laboratoire peut être étendu au domaine de continuer à valider l'authenticité de différences dans le comportement des espèces d'intérêt, cette prochaine étape est recommandée. Bien que l'approche comparative offre de nombreux avantages, une limitation est la nature des données corrélatives, par conséquent, des techniques complémentaires telles que les manipulations pharmacologiques doivent être utilisés pour valider davantage le rôle de cible systèmes neurobiologiques dans le comportement de l'intérêt.
Une fois les expérimentateurs se sentir confiants au sujet des procédures comportementales, histologiques et statistiques, des précautions doivent être prises afin que les conditions de vie des animaux restent constantes pour tous les groupes, sauf, bien sûr, pour la manipulation expérimentale. Les changements dans les variables telles que les horaires de lumière, le bruit, les concierges, les niveaux d'humidité et les odeurs dans le laboratoire pourrait avoir des effets significatifs sur les réponses des animaux neurobiologiques.
Dans cet article, l'anticorps primaire a été utilisé pour la détection de la vasopressine, mais d'autres anticorps primaires peuvent être utilisées pour une multitude de neurotransmetteurs différents centres d'intérêt. Si l'expérimentateur est de travailler avec un nouvel anticorps, il est important de mener des études de titration pour déterminer la dilution optimale de l'anticorps nouveaux. Plusieurs fois, trop d'anticorps est utilisé (comme suggéré par le vendeur), résultant en tissu qui est trop sombre pour distinguer le signal; encore, l'utilisation excessive de l'anticorps est très coûteux.
Enfin, si plus d'une seule analyse statistique peut être utilisée pour fournir d'autres vues et les interprétations des données, ils doivent être utilisés. Dans cette étude particulière, des modèles linéaires généraux, corrélationnelles et analyse le positionnement multidimensionnel ont été utilisées pour fournir des vues les plus informative des données.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des subventions non. 0723341 (à KGL) de la National Science Foundation. Nous sommes également reconnaissants pour les contributions fournies par le Programme de bourses de recherche Schapiro premier cycle et au département de psychologie au Randolph-Macon College. Enfin, nous apprécions les contributions de collaboration Craig Kinsley dans cette recherche et d'aider Amanda Rzucidlo dans la préparation du laboratoire de R-MC pour cet article la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
