Summary
L'approccio specie comparata permette neuroscienziati comportamentali di esplorare diversi fattori neurobiologici associati a specifici comportamenti visti come caratteristiche di un modello animale specifico. Approfittando del naturale differenze di comportamento tra specie strettamente correlate, questa tecnica non richiede tecniche invasive per manipolare l'espressione del comportamento.
Abstract
Un obiettivo di neuroscienze comportamentali di fondo è quello di identificare i fattori neurobiologici che regolano comportamenti specifici. Utilizzando modelli animali per raggiungere questo obiettivo, molte strategie metodologiche richiedono tecniche invasive per manipolare l'intensità del comportamento di interesse (ad esempio, i metodi di lesione, manipolazioni farmacologiche, tecniche di microdialisi, geneticamente modelli animali). L'utilizzo di un approccio comparativo specie permette ai ricercatori di sfruttare naturalmente differenze nelle strategie di risposta esistenti in specie strettamente correlate. Nel nostro laboratorio, usiamo due specie del genere Peromyscus che si differenziano nelle risposte paterna. Il maschio del mouse cervo California (Peromyscus californicus) presenta le stesse risposte dei genitori come la femmina, mentre suo cugino, il topo cervo (Peromyscus maniculatus) presenta praticamente alcuna risposta nutrimento / parentali in presenza di cuccioli. Di interesse specifico in questo articolo è un'esplorazione dei fattori neurobiologici associati con le risposte affiliativo sociale esibita dal paterno del mouse cervi California. Perché l'approccio comportamentale neuroscienze è multiforme, i seguenti componenti chiave dello studio saranno brevemente affrontati: l'identificazione di specie appropriate per questo tipo di ricerca, raccolta dati per l'analisi comportamentale; preparazione e sezionamento del cervello; passaggi fondamentali necessari per immunocitochimica per la quantificazione della vasopressina-immunoreattività, l'uso di neuroimaging software per quantificare il tessuto cerebrale, l'uso di un analisi video microsequenziamento per segnare il comportamento e, infine, le analisi statistiche appropriate per fornire le interpretazioni più informato dei risultati della ricerca.
Protocol
1. Identificazione di modello animale
- Il mouse Deer California (Peromyscus californicus) è un modello ideale per esplorare le risposte paterna. Come vedete, questo mouse sposi cuccioli proprio come fanno le mamme - che anche Crouch su di loro in modo che sembra che i cuccioli sono infermieristico. Il comportamento dei topi California è paragonato a una specie dello stesso genere, il mouse cervo (Peromyscus maniculatus) che espone poco interesse per i cani, spesso cercando di fuggire o addirittura attaccarli. (Vedi Figura 1 per le immagini di queste specie che interagiscono con i cuccioli.)
- Una volta che il modello di specie è stata identificata poi i vari gruppi devono essere stabilite. In questo studio, i padri biologici, vergini senza esperienza genitoriale, e le vergini con limitate all'esposizione dei piccoli (cuccioli esposti o padri in affidamento) di entrambe le specie vengono utilizzate in modo che le caratteristiche paterno sia predisposto e acquisiti possono essere valutati. In questo studio particolare abbiamo esposto anche tutti i gruppi per un topo giocattolo cucciolo per garantire che le interazioni sociali sono specifici di un cucciolo e non una risposta rappresentante per nulla messo in gabbia (vedi figura 2).
- Prima di analizzare i fattori neurobiologici, è importante per confermare che la specie selezionate mostrano evidenti differenze nel comportamento di interesse. In questo studio, i maschi sono posti in una gabbia con un cucciolo per cinque minuti e un etogramma comportamento paterno (vedi Tabella 1, ad esempio di etogramma) viene utilizzato per comportamenti punteggio come latenza di avvicinare il cucciolo e la quantità di tempo trascorso in contatto con il cucciolo. Se le risposte aggressive sono osservati, il cucciolo viene rimosso immediatamente. Queste sessioni sono spesso videoregistrate in modo da un'attenta analisi del comportamento può essere successivamente condotto.
2. Preparazione di tessuto cerebrale
- A seguito di una perfusione standard di ogni mouse (protocollo allegato), i cervelli sono stati rimossi in modo che possano essere sezionati nel settore specifico di interesse (cervello show).
- Un mouse standard cervello atlante (mostra atlante) è utilizzato per individuare il nucleo paraventricolare dell'ipotalamo, una zona nota per essere ricca di cellule che producono il neuropeptide di interesse in questo studio - vasopressina (AVP).
- Il cervello è poi bloccato e montato su un mandrino congelamento in modo che il tessuto si blocca prima di essere sezionati con il microtomo. Il cervello è sezionato in una modalità di assetto fino a punti di riferimento specifici sono stati identificati, poi lo spessore specifiche del cervello, 30 micron, in questo caso, è fissato per le sezioni di cervello utilizzata per l'analisi.
- Le sezioni di cervello sono accuratamente messi in piatti ben riempito con tampone fosfato salino (PBS), (allegato protocollo per la PBS, si prega di notare che questa è solo un esempio di un protocollo di immunocitochimica standard).
3. Immunocitochimica
- In tutto le varie fasi di questo processo (vedi protocollo allegato), è importante avere precise competenze pipettaggio per garantire misure accurate di prodotti chimici e di altri ingredienti importanti per questa tecnica (studente di pipettamento show).
- Il primo passo in questo processo è il lavaggio del cervello che comporta la sostituzione del PBS nei piatti ben tre a cinque volte, tra ogni lavare i piatti e sono posti su una sedia a dondolo per 10 minuti (mostra studente sostituzione PBS e l'immissione piastre su rockers) .
- Le sezioni di cervello sono quindi esposti alla soluzione di anticorpo primario e conservato a 4 ° C per una notte sulla sedia a dondolo (processo show).
- Dopo un altro lavaggio, le fette di cervello è esposto a un anticorpo secondario per un'ora sulla sedia a dondolo a temperatura ambiente, poi lavati di nuovo.
- Avanti i cervelli sono esposti ad un Avitin-Biotina soluzione Complesso di prepararsi per la visualizzazione del neurochimici cellule positive.
- Per la fase di visualizzazione finale, il cervello è esposto a DAB. Si tratta di un prodotto pericoloso e deve sempre essere maneggiati con cautela. Come si vede qui, le fette di cervello cominciano a scurirsi davanti ai vostri occhi (mostra di processo).
- Dopo l'esposizione DAB, il cervello passano attraverso l'ultima serie di lavaggi e poi accuratamente immessi sul vetrini subbed e lasciato asciugare durante la notte (mostra il posizionamento di una fetta del cervello su un vetrino, si veda l'allegato per subbed protocollo di diapositive).
- I vetrini vengono poi cancellati attraverso una serie di lavaggi con acqua distillata e alcol, infine, di essere immersi in Citrosolv prima di essere coprioggetto e conservati in un Contenitore per mantenere sicuro (mostra vari aspetti di questo processo, si veda l'allegato per il processo di compensazione).
4. Neuroquantification
- Dopo le diapositive sono asciugati, possono essere valutati con il software neuroquantification specializzati. Ecco il software Bioquant viene utilizzato per quantificare il vasopressina cellule positive e fibre nel nucleo paraventricolare del cervello del mouse (mostra il software sullo schermo ... e microscopio).
- L'area di interesse viene identificato utilizzando le opzioni di misurazionedel software per stabilire il campo visivo per neuroquantification. E 'importante che una dimensione coerente campo visivo è quantificato per ogni animale (studente mostrare fare questo).
- Qui la colorazione scura vasopressina-immunoreattive corpi cellulari e le fibre sono evidenti. Perché è difficile contare o tracciare questo tessuto, una caratteristica speciale di questo software utilizza la soglia di luce per determinare la quantità totale di tessuto colorato positivamente entro l'area specifica di interesse. Questa soglia ci dice come gran parte della zona specificata contenuta vasopressina-positivi tessuto (mostra il valore dei dati sullo schermo del computer).
5. Analisi comportamentale
- Se più di un osservatore sarà segnato il videocassette, è importante stabilire inter-rater per garantire che gli osservatori abbiano una performance il comportamento in modo coerente. Per la sessione di punteggio e un foglio di punteggio comportamento dovrebbero essere preparati per consentire un facile gol di comportamento durante le sessioni di osservazione (vedi Tabella 2 per esempio di segnare foglio elettronico).
- Per i comportamenti che non sono veloci risposte episodiche, un'analisi microsequenziamento può rivelare sottigliezze circa la progressione delle risposte specifiche. Per esempio, governare il comportamento è costituito da una catena di reazioni molto veloci. Anche se una possibilità è quella di registrare semplicemente la presenza e la durata della cura, un altro è quello di documentare la catena di eventi che accompagnano questa risposta. Utilizzando questo software microsequenziamento, gli osservatori punteggio la presenza di un comportamento particolare ogni secondo, come richiesto dal software (software di spettacolo e video).
- Dopo la raccolta dei dati, i parametri di interesse sono determinati i punteggi e appropriato comportamentali vengono analizzati. Esempi possono essere durata totale del tempo trascorso a contatto con il cucciolo, o il numero di interruzioni nella sequenza grooming (mostra computer con foglio elettronico con i dati inseriti per ogni animale).
- Una volta che il comportamento è segnato, è importante per confermare che le due specie esposte le strategie di risposta diversi per il comportamento di interesse per lo studio. In questo caso il topo cervo California dovrebbe mostrare un comportamento più paterno rispetto ai topi cervo comune. Inoltre, varie misure comportamentali possono essere correlati con le misure di cervello per ottenere una visione più consapevole delle influenze rilevanti.
6. Rappresentante dei risultati:
- Per validare il modello, i dati dovrebbero indicare chiaramente che le due specie eseguita in modo diverso in relazione al comportamento di interesse. Qui si vede che il P. maschi californicus speso più tempo e cura accovacciato sui cuccioli, due caratteristiche di risposte paterno (vedi Figura 4).
- Al fine di determinare se la variabile neurobiologial di interesse è importante nelle risposte paterna, la quantità di vasopressina (AVP)-positivo tessuto è stato quantificato per diverse aree del cervello importanti, come si può vedere, il paterno P. animali californicus aveva più tessuto immuno-positivo in molte di queste aree cerebrali. (Vedi Figura 5).
- In uno studio collegato usando l'analisi microsequencing, è stato ipotizzato che i topi paterno California mostrerebbe meno ansia rispetto ai loro omologhi vergine, di conseguenza, se esposti ad un odore predatore, i padri esposti meno interruzioni nella sequenza di governare gli animali vergine (vedi Figura 6).
Figura 1: (A) Maschio topi California espositrici risposte paterno nei confronti conspecifici cucciolo alieno. (B) topo cervo maschio che presentano un approccio prudente (tratto partecipare) e la risposta evitare in presenza di un alieno conspecifici cucciolo. Nota: In queste valutazioni interazione sociale, se un maschio esibisce risposte aggressivo nei confronti del cucciolo, gli sperimentatori immediatamente colpito la parte superiore della gabbia per distrarre il maschio. In questo momento la sessione è terminata e il cucciolo viene rimosso, controllato per eventuali ferite e restituito alla madre. Nel nostro laboratorio, questo raramente si osserva con P. maschi californicus ma è occasionalmente osservata con P. maniculatus; stretta osservazione e di intervento immediato, tuttavia, impedire il verificarsi di danni agli animali.
Figura 2: Un mouse California, interagendo con il mouse giocattolo, la maggior parte ha cercato di masticare questi stimoli.
Figura 3: progettazione sperimentale di studio, c'erano circa 6 animali in ciascun gruppo per ogni specie.
Figura 4: Grafico del processo di immunocitochimica.
Ficoure 5 risposte paterna nella California e topi cervi;. risposte più paterno (sposo, accovacciarsi, più veloce di avvicinamento) sono stati osservati nei topi California. Altro tratto frequenta (risposta allo stress) sono stati osservati nei topi cervo.
Figura 6. Immunoreattività vasopressina in varie aree cerebrali di entrambe le specie. I topi della California ha avuto più colorazione nelle cellule PVN e fibre.
Figura 7: paterno California topi esposti meno interruzioni nelle loro sequenze di governare in presenza di un odore predatore rispetto ai gruppi cuccioli esposti e vergine.
Discussion
Questo articolo vengono illustrati tre componenti essenziali ritenuti critici per la riuscita di indagini neuroscienze comportamentali: (1) un modello animale di rappresentanza e di validità; (2) un protocollo di immunocitochimica accurato e sensibile, e (3) la maggior parte delle analisi (osservazionale e statistiche ) di entrambi i dati comportamentali e il cervello. Errori in una singola categoria sarà sicuramente compromesso i risultati dello studio intero. Quindi, dopo un'attenta selezione del modello animale appropriato, notevoli sforzi devono essere diretti verso pilota di test delle procedure comportamentali e istologici per assicurare che il comportamento sarà affidabile osservate nello studio, seguito dal successo di elaborazione del cervello.
Come accennato in precedenza, l'uso di specie comparativa per identificare i meccanismi neurobiologici di una risposta particolare è un valido approccio metodologico, perché questa tecnica non richiede manipolazione genetica o dolorose manipolazioni chirurgiche. Così, questo approccio metodologico utilizza meno minacciato, gli animali intatti. L'uso delle variazioni naturali degli animali, tuttavia, è rafforzata dalla incorporazione di ambienti di tipo naturale, anche se gli animali siano accolti in laboratorio. Inoltre, se gli studi di laboratorio può essere esteso al campo per convalidare ulteriormente l'autenticità delle differenze di specie nel comportamento di interesse, questo passo successivo è raccomandato. Anche se l'approccio comparativo offre molti vantaggi, una limitazione è la natura correlativa dei dati, di conseguenza, le tecniche aggiuntive, come le manipolazioni farmacologiche deve essere utilizzato per convalidare ulteriormente il ruolo dei sistemi mirati di neurobiologici nel comportamento di interesse.
Una volta che gli sperimentatori fiduciosi sulle procedure comportamentali, istologici e statistica, si deve prestare attenzione in modo che le condizioni di vita degli animali rimangono costanti per tutti i gruppi tranne, naturalmente, per la manipolazione sperimentale. Cambiamenti nelle variabili quali orari la luce, i livelli di rumore, bidelli, i livelli di umidità e odori in laboratorio potrebbe avere effetti significativi sulle risposte neurobiologiche degli animali '.
In questo articolo l'anticorpo primario è stato utilizzato per la rilevazione della vasopressina, ma altri anticorpi primari possono essere utilizzati per una pletora di sostanze neurochimiche differenti di interesse. Se lo sperimentatore sta lavorando con un nuovo anticorpo, è importante condurre studi di titolazione per determinare la diluizione ottimale del nuovo anticorpo. Molte volte degli anticorpi viene usato troppo (come suggerito dal fornitore), con conseguente tessuto che è troppo scura per differenziare il segnale, ulteriormente, l'uso eccessivo di anticorpi è molto costoso.
Infine, se più di una singola analisi statistica può essere utilizzato per fornire visualizzazioni alternative e le interpretazioni dei dati, dovrebbero essere utilizzati. In questo studio particolare, i modelli lineari generali, di correlazione e analisi di scaling multidimensionale sono stati utilizzati per fornire il punto di vista più informativo dei dati.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dalla borsa no. 0723341 (per KGL) dalla National Science Foundation. Siamo anche grati per il contributo fornito dal programma triennale Research Fellowship Schapiro e il Dipartimento di Psicologia presso la Randolph-Macon College. Infine, apprezziamo Craig Kinsley contributi collaborativi in questa ricerca e aiutare Amanda Rzucidlo nella preparazione della R-MC laboratorio per questo articolo video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
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