Summary
הדמיה של פליטת אור ועין מתנהלת פעילות היפוקסיה, גורם 1α מוחל לפקח היפוקסיה תוך גולגולתי התפתחות גידולים של סרטן השד מודל גרורות במוח העכבר.
Abstract
היא מוכרת היטב כי היפוקסיה הגידול ממלא תפקיד חשוב בקידום התקדמות ממאיר ולהשפיע לרעה על תגובה טיפולית. יש ידע מועט על באתרו, ב היפוקסיה, הגידול vivo במהלך הפיתוח תוך גולגולתי של גידולים ממאירים במוח בגלל חוסר אמצעי יעיל לפקח על זה אלה עמוקים גידולים orthotopic. הדמיה פליטת אור (BLI), המבוססת על זיהוי של האור הנפלט ע"י תאים חיים להביע גן בלוציפראז, אומצה במהירות למחקר סרטן, בפרט, על מנת להעריך את צמיחת הגידול או שינוי גודל הגידול בתגובה הטיפול במחקרים בבעלי חיים פרה. יתר על כן, על ידי הבעת גן כתב תחת שליטתה של רצף היזם, בביטוי גנים מסוימים יכול להיות פיקוח הלא פולשני ידי BLI. תחת הלחץ hypoxic, תגובות איתות מתווכות בעיקר באמצעות ועין מתנהלת היפוקסיה, גורם 1α (HIF-1α) לנהוג שעתוק של גנים שונים. לכן, יש לנו השתמשו לבנות HIF-1α הכתב, 5HRE-ODD לוק, transfected ביציבות לתוך סרטן השד אנושי מד"א-MB231 תאים (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). Assay ב-HIF 1α פליטת אור חוץ גופית מבוצעת על ידי דוגרים התאים transfected בתא hypoxic (0.1% O 2) עבור 24 שעות לפני BLI, בעוד התאים normoxia (21% O 2) לשמש כביקורת. השטף הפוטון גבוה משמעותית נצפתה עבור התאים תחת היפוקסיה מציע מחייב גדל HIF-1α אל האמרגן שלה (אלמנטים HRE), בהשוואה לאלה normoxia. התאים מוזרקים ישירות לתוך המוח העכבר להקים סרטן השד גרורות במוח מודל. פליטת אור בתחום ההדמיה vivo של הדינמיקה היפוקסיה הגידול הוא יזם 2 wks לאחר ההשתלה וחזר פעם בשבוע. BLI מגלה הגדלת אותות אור מהמוח עם התקדמות הגידול, המעיד על גידול תוך גולגולתי מוגבר היפוקסיה. מחקרים היסטולוגית ו immunohistochemical משמשים כדי לאשר את בתוצאות vivo הדמיה. כאן, אנו מציגים גישות של assay ב-HIF 1α פליטת אור חוץ גופית, הקמת כירורגית של גרורות סרטן המוח השד עכבר יישום בעירום של פליטת אור בתחום ההדמיה vivo לפקח היפוקסיה גידול תוך גולגולתי.
Protocol
הנהלים כל חיה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת טקסס Southwestern Medical Center.
1. Assay HIF-1α פליטת אור חוץ גופית
- חומרים ושיטות:
- סרטן שד גרורתי האדם התא קו מד"א-MB231 transfected עם גן HIF-1-תלוי כתב רומן, 5HRE-ODD לוק נוצר על ידי ד"ר Harada.
- במצב hypoxic, הביטוי מוגברת של חמצן תחום תלויי השפלה (ODD)-בלוציפראז חלבון היתוך הוא מונע על ידי 5 עותקים של אלמנט היפוקסיה תגובה (5HRE). הנוכחות של ODD גורם הפירוק של החלבון ODD לוק וכתוצאה מכך מאוד פעילות בלוציפראז נמוך רקע בתנאים normoxic. לכן, מערכת הרומן הזה יכול לשמש כדי לזהות אזורים hypoxic בגידול ידי הדמיה בזמן אמת. בניית וקטור 5HRE-ODD לוק בביטוי זה דווחה על ידי 1,2 Harada et al.
- התרבות תאים תחת normoxia או היפוקסיה:
- שמירה על רקומביננטי מד"א-MB231 התאים בנסיוב 10% שור העובר (FBS)-DMEM בינוני המכיל 1% גלוטמין, אנטיביוטיקה של 400 מיקרוגרם / מ"ל של G418 ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- עבור assay ב-HIF 1α פליטת אור מבחנה, צלחת 3 x 10 5 מד"א-MB231 תאים להביע 5HRE-ODD לוק וקטור היטב כל מנה שש שתיים היטב.
- אפשר תאים לצרף את קיר צלחת לאחר דגירה לילה ולאחר מכן להעביר צלחת אחת לחדר היפוקסיה (Billups-רוטנברג, Inc Del Mar, CA) ללימודי היפוקסיה, בעוד לשמור את המנה אחרים בתנאי normoxic (21% O 2).
- מחדש את קאמרית הגזים עם 0.1% O 2 על ידי חיבור צינור יציאת מפרצון עם בלון גז.
הערה: גם כניסת ויציאת מלחציים מוצא חייב להיות פתוח במהלך הליך זה. - נתק את מקור הגז לאחר קאמרית כבר מטוהר קאמרית חותם על ידי סגירת מהדק פלסטיק.
- מניחים את קאמרית 37 ° C חממה עם 5% CO 2.
הערה: החדר חייב להיות humidified כדי למנוע אידוי יתר של תרבויות. ניתן להשיג זאת על ידי הצבת 10-20 מ"ל מים סטריליים בחדר.
- פליטת אור assay:
- לאחר דגירה 24 שעות, להסיר את בינוני לשטוף את התאים במהירות עם קרח קר PBS (2X).
- הוסף 1 מ"ל של PBS קר עם 100 μl של Luciferin (ביוטכנולוגיה זהב, סנט לואיס, מיזורי).
- רוכשת BL הדמיה (מערכת IVIS ספקטרום, Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA) עם זמני החשיפה השונים (1, 30, 60, 180 S).
- מדידת עוצמת האור בכל אחד גם בעזרת תמונה Living תוכנה (Caliper מדעי החיים).
2. הקמת מודל סרטן השד גרורות במוח
- הכנת התאים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
- אחזר והתרבות התאים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc במדיום מדם המכיל 10% FBS, גלוטמין 1% ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- החלף בינוני כל 2-3 ימים. Tripsinize לשטוף את התאים כאשר הם מגיעים למפגש 80%.
- ספירת מספר מתאים של תאים resuspend אותם בינוני סרום מדם Matrigel חינם עם 25% (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) עם ריכוז סופי של 10 5 תאים בנפח 4 μl.
- המקום התאים על הקרח לפני הזרקה תוך גולגולתי.
- ניתוח ההשתלה
- עכברים בעירום נקבה (BALB / c נו / נו, המכון הלאומי לסרטן, Bethesda, MD) בשעה 4-6 שבועות המשמשים במחקר זה.
- הרדימי (3% isoflurane / O2 בתא אינדוקציה; isoflurane מ בקסטר אינטרנשיונל בע"מ, Deerfield, אילינוי, ארה"ב) ולשמור על חיות עם isoflurane (1%) חמצן (1 DM 3 / min) במהלך ההליך הכירורגי 3.
- העור הקודקודית הימנית צריכה להיות prepped בבטאדין ואז אלכוהול 70% לפני החתך.
- בעזרת מקדח במהירות גבוהה, בר חור 1 מ"מ באונה הימנית של הגולגולת, 1mm הקדמי אל תפר העטרה ו 2 מ"מ לרוחב תפר saggital.
- צייר 4 תערובת תא μl (10 5 תאים) באמצעות מזרק 10 μl המילטון (Hamilton החברה, רינו, NV). להזריק את התאים ישירות ימין הזנב diencephalon, 1.5 מ"מ מתחת מאטר הדורה באמצעות מחט מחוייט 32G המילטון. שמור את המחט מקום של בערך 30 לפני הנסיגה. שימוש של מחט 32G בסדר ממזער נזק לרקמות.
- ממלאים את החור בר בשעווה עצם לסגור את הקרקפת עם תפרים נספגים.
- הכינו את אזור החתך עם אלכוהול 70%.
- החל עצירות כאבים כל 12 שעות למשך יומיים.
3. הדמיה פליטת אור vivo של הדינמיקה היפוקסיה הגידול גרורות סרטן שד במוח
- ליזום הדמיה פליטת אור האורך (מערכת IVIS ספקטרום) שבועיים לאחר ההשתלה לחזור תוך גולגולתי וכן פעם בשבוע במשך 8-10 שבועות.
- הרדימי שלושה עכברים בכל פעם (3% isoflurane / O 2 בתא אינדוקציה)
- ניהול פתרון של D-luciferin (120 מ"ג / ק"ג ב PBS בהיקף כולל של 80 μl; ביוטכנולוגיה זהב) תת עורית באזור הצוואר של העכבר כל כמתואר בהרחבה בעבר 4.
D-luciferin הוא רעיל הוכח להיות מסוגל לחדור מחסום שלם הדם למוח (BBB) ואת קרום התא 3,5.
- מניחים את 3 עכברים בחדר הדמיה ומתוחזק עם isoflurane (1%) חמצן (1 DM 3 / min) במהלך ההדמיה.
- חמש דקות לאחר ההזרקה luciferin, לרכוש BL הדמיה עם מערך של זמן החשיפה השונים (1, 30, 60, 180 S).
התצפיות שלנו מראות כי זמן שיא פליטת האור הוא כ 5 דקות לאחר מתן luciferin תת עורית באזור הצוואר 3,4.
- ניתוח נתונים עם תוכנת Living דימות (Caliper מדעי החיים) באמצעות ספירת פוטון מוחלט (פוטונים / s) באזור של עניין (ROI), נמשך באופן ידני המתאר את האות BLI של המוח.
- זמן מגרש כמובן עקומה של ספירת פוטון להצביע הדינמיקה היפוקסיה הגידול.
- מיד לאחר BLI האחרון, לנהל pimonidazole, סמן היפוקסיה ו 1 שעות מאוחר יותר, להקריב את העכברים לנתח את המוח. שבץ מוח שלם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) בינוני הקפאת -80 ° C במקפיא. הכתמה לאחר היסטולוגית סגול Cresyl והכתים immunohistochemical נגד בלוציפראז, סמן pimonidazole היפוקסיה, ו-HIF 1α שבוצעו כדי לאמת תצפיות הדמיה.
4. נציג התוצאות:
כפי שמוצג תמונה 1, גבוה באופן משמעותי האות BLI נצפתה לאחר התאים transfected מודגרות בחדר היפוקסי (1% O 2) במשך 24 שעות. פליטת האור חלש נצפתה מתאי השליטה תחת normoxia. הדבר עלול לגרום מהאוכלוסייה תא צפוף אחרי 24 שעות של תרבות 3 x 10 5 תאים, אשר גרמו אות כדי להדגיש את התאים overexpress HIF-1α. עם זאת, התוצאות היו vivo BLI תוקף על ידי immunohistochemical מכתים מראה colocalization בין היפוקסיה הגידול הביטוי בלוציפראז.
מערך אוטומטי של פעמים מאפשרת חשיפה רכישות מתמשך בסדרה של תמונות, המאפשרת לכידה של אות חלש עם זמן חשיפה ארוך יותר, אותות חזקים באמצעות זמן קצר מבלי להרוות-CCD.
איור 1 ב assay HIF-1α פליטת אור במבחנה שורה עליונה:. 3 x 10 5 תאים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc מודגרות היטב כל מנה 6-היטב בתא היפוקסיה (0.1% O 2) עבור 24 שעות לפני בינוני הוסר, שטף והוחלפו 1 מ"ל PBS. מיד לאחר 100 luciferin μl נוספה לתוך הבאר כל BLI נרכשה עם מערך של פעמים חשיפה (1, 30, 60, 180 S). הארה חזקה נצפתה מבארות נציג שורה תחתונה:. כביקורת, 3 x 10 5 תאים מודגרות תחת normoxia (21% O 2) נפלט אור חלש.
איור 2 ב הדמיה פליטת אור vivo של הדינמיקה היפוקסיה הגידול.) אות אור חלש מהצד הימני של המוח העכבר היה הראשון דמיינו 5 שבועות לאחר ההשתלה תוך גולגולתי של תאים סרטניים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc השד. אותות אופטיים מוגברת נצפתה על 6 שבועות נוספים, המצביעים על גידול היפוקסיה מוגברת. B) העלילה הראתה את מהלך הזמן של עקומת ספירת פוטון כמותית של אות אור.
איור 3 Colocaliztion של בלוציפראז ו היפוקסיה זוהה על ידי מכתים immunohisto כימי. במוח העכבר קפוא ועליו גרורות של סרטן השד MDA-MB231/5HRE-ODD-luc מוטבע אוקטובר נותח. סעיף 10 מיקרומטר immunostained עם סמן hypoxic, pimonidazole, חשף intratumoral ההטרוגניות של היפוקסיה, שנמצא כדי לתאם מרחבית עם הביטוי בלוציפראז זוהה על ידי אנטי מכתים בלוציפראז. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סרטן השד גרורות במוח מתרחשת 30% מחולות סרטן השד בשלב הרביעי. היא מזוהה עם תחלואה ותמותה גבוהים ויש לו ההישרדות החציונית של 13 חודשים 6. יש צורך להיות במודלים של בעלי חיים מתאימים לחקות זו מחלה הרסנית קלינית כדי להקל על ההבנה שלנו של חניכה תוך גולגולתי שלה התקדמות, כמו גם פרופילים pathophysiological. הנה, פיתחנו השד orthotopic מודל גרורות סרטן המוח על ידי הזרקת תאים אנושיים סרטן השד, ישירות לתוך המוח העכבר. ההתנסויות הקודמות שלנו הראו כי דמיינו radiologically (ע"י MRI) תוך גולגולתי הנגע מופיע כ -2 שבועות לאחר ההשתלה. אלטרנטיבי מודל זה הזרקה ישירה, יישמנו לאחרונה תא intracardiac הזרקת הגישה ליצור עוד השד orthotopic מודל גרורות סרטן המוח על ידי הזרקת תאים סרטניים לתוך החדר השמאלי של עכברים. עם זאת, לפני בחירה של גרורות במוח נוטה בתאי סרטן השד הוא הכרחי כדי להשיג רב מוקדי הנגעים במוח במודל זה 7. יש לנו לאחרונה הציג אותו HRE לוק לבנות לתוך השד העכבר תאים סרטניים 4T1 כי הם מסוגלים לשלוח גרורות אל המוח העכבר באמצעות הזרקה intracardiac.
הדמיה פליטת אור רגיש מאוד יעיל, אשר, בניגוד דימות פלואורסצנטי, לא צריך עירור אור. זה מאפשר הדמיה של העמוקה גידולים במודלים של מכרסמים, למשל, גידולים במוח תוך גולגולתי של עכבר במחקר זה. שלוש או אפילו חמש עכברים ניתן הדמיה באותו זמן. עם זאת, כדי להגביר את הרגישות במיוחד כאשר האות חלש היה לראות בתמונה את כל הגוף, קביעת עמדה חיה קרוב למצלמה יהיה צורך. במקרה זה, רק אחד או שניים בעלי חיים ניתן הדמיה בכל פעם. מגבלה אחת של BLI היא ברזולוציה מרחבית נמוכה של האנטומיה אם כי יש שיטות כדי להפיק תמונות טומוגרפית. שיתוף אחת עם מיקרו-CT או תמונות MR תסייע שצריך לזהות את האנטומיה.
מאמצים נרחבים כבר ביקשו לפתח פולשני גישות לפקח היפוקסיה הגידול in vivo 8,9. על ידי החדרת גן הכתב היפוקסיה לתוך הגנום של תאים סרטניים, ניטור האורך של התפתחות היפוקסיה הגידול ניתן לנטר באמצעות דימות אופטי 10,11. באופן דומה, היפוקסיה הדינמיקה הגידול לאחר הטיפול ניתן לנטר באמצעות גישה זו.
בנוסף בלוציפראז ואת המצע שלה, luciferin, חמצן ו-ATP הם מרכיבים חיוניים בתגובה luciferin-בלוציפראז כדי לייצר אור. בסביבה hypoxic, זמינות של חמצן ייצור ATP עשויה להיות מוגבלת באופן משמעותי, אשר עלולה לגרום פליטת האור מופחת. עם זאת, שלנו assay BLI במבחנה הראו כי תאים MDA-231/HRE-luc מודגרות בתנאי חוסר חמצן (<0.1% O 2) הנפלטים באופן משמעותי יותר קל, לעומת אלה במצב normoxic. יתר על כן, הנתונים immunohistochemical של רקמות הגידול מתגלה קורלציה מרחבית טובה בין הביטוי בלוציפראז ו pimonidazole. תצפיות אלו בהסכם טוב עם מחקרים קודמים על ידי אחרים, טוען כי ריכוז החמצן ATP הדרושים לייצור אור יעיל היטב מתחת לרמה שלהם נמצא חיים בתאי יונקים. יש לנו גם בשילוב גישות MRI פונקציונלי, BOLD (רמת חמצן בדם תלוי) ואמר (רמת החמצן ברקמות תלויה) בדיקת MRI כדי להעריך היפוקסיה הגידול במודל זה. נתונים להשוואה התקבלו מחברת הגישות הדמיה multimodal (נתונים שלא פורסמו). יתר על כן, מכתים immunohistochemical אישר colocaliztion של תאים סרטניים ותאים hypoxic להביע בלוציפראז. הערכה מדויקת של היפוקסיה הבסיס הגידול לשינויים הדינאמיים במצב התגובה לטיפול צריכה לאפשר שילוב רציונלי 12 טיפולית.
לסיכום, BLI זול, מהיר ורגיש מאוד יכול להיות כלי שימושי הלא פולשני להעריך את הדינמיקה היפוקסיה הגידול in vivo. בעוד המודל orthotopic גידול במוח נעשה שימוש במחקר זה, המתודולוגיה בהחלט יכול להיות מיושם על סוגים אחרים של גידולים עמוקים orthotopic במכרסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי פרס DOD סרטן השד IDEA W81XWH-08-1-0583 ו-NIH / NCI CA141348-01A1 (DZ) ו FAMRI הפרס קליניים מדען (DS). תשתית הדמיה מסופק על ידי Southwestern הדמיה קטנים תוכנית המחקר בבעלי חיים נתמך בחלקו על ידי U24 CA126608 ו סימונס Cancer Center (P30 CA142543) ו-NIH 1S10RR024757-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | L-123 | 120 mg/kg in PBS in a total volume of 80 μl for in vivo study |
| Isoflurane | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 1701 | |
| 32G Hamilton needle | Hamilton Co | 7803-04 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | MIC-101 | |
| Bioluminescence imaging system | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum system | |
| G418 | Fisher Scientific | SV3006901 |
References
- Harada, H. The combination of hypoxia-response enhancers and an oxygen-dependent proteolytic motif enables real-time imaging of absolute HIF-1 activity in tumor xenografts. Biochem Biophys Res Commun. 360, 791-796 (2007).
- Ou, G. Usefulness of HIF-1 imaging for determining optimal timing of combining bevacizumab and radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75, 463-467 (2009).
- Zhou, H. Dynamic near-infrared optical imaging of 2-deoxyglucose uptake by intracranial glioma of athymic mice. PLoS One. 4, e8051-e8051 (2009).
- Contero, A., Richer, E., Gondim, A., Mason, R. P. High-throughput quantitative bioluminescence imaging for assessing tumor burden. Methods Mol Biol. 574, 37-45 (2009).
- Zhao, D., Richer, E., Antich, P. P., Mason, R. P. Antivascular effects of combretastatin A4 phosphate in breast cancer xenograft assessed using dynamic bioluminescence imaging and confirmed by MRI. FASEB J. 22, 2245-2451 (2008).
- Chang, E. L., Lo, S. Diagnosis and management of central nervous system metastases from breast cancer. Oncologist. 8, 398-410 (2003).
- Palmieri, D. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clin Cancer Res. 15, 6148-6157 (2009).
- Mason, R. P. Multimodality imaging of hypoxia in preclinical settings. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54, 259-280 (2010).
- Tatum, J. L. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).
- Moeller, B. J. Pleiotropic effects of HIF-1 blockade on tumor radiosensitivity. Cancer Cell. 8, 99-110 (2005).
- Lu, X. In vivo dynamics and distinct functions of hypoxia in primary tumor growth and organotropic metastasis of breast cancer. Cancer Res. 70, 3905-3914 (2010).
- Zhao, D., Chang, C. H., Kim, J. G., Liu, H., Mason, R. P. In vivo Near-Infrared Spectroscopy and Magnetic Resonance Imaging Monitoring of Tumor Response to Combretastatin A-4-Phosphate Correlated With Therapeutic Outcome. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 80, 574-581 (2011).
