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Medicine

畸胎瘤代睾丸胶囊

Published: November 7, 2011 doi: 10.3791/3177

Summary

人类多能干细胞(hPSCs)有无数不同的疾病的潜在治疗。这些细胞的效用在于事实,即他们可以分化成人体任何细胞类型。在这里,我们描述畸胎瘤实验,这用于演示的hPSCs pluripotence的。

Abstract

多能干细胞(PSCS)有独特的特点,他们可以分化成所有三个胚层的细胞。这使得他们为许多不同疾病的治疗具有潜在价值的工具。 (胚胎干细胞)与诱导多能干细胞(iPS细胞),并继续与人类胚胎干细胞研究的到来需要有一个实验可以证明,一个特定的细胞是多能干。生殖传输已经证明小鼠胚胎干细胞(MESC)线1,2,3 pluripotence的黄金标准。使用这个实验中,研究人员可以表明,卓制线可以使所有类型的细胞在胚胎生殖细胞4。随着一代人类ESC线5,6,相应的检测来证明这些细胞的pluripotence不清楚,因为人类胚胎干细胞不能为生殖传输测试。作为替代,畸胎瘤法是目前用来展示pluripotency人类多能干细胞(hPSCs)7,8,9。虽然此法最近受到审查,并正在积极探索新技术,畸胎瘤法是目前的黄金标准7。在这个实验中,细胞免疫受损小鼠注入。如果是多能干细胞,最终将发展畸胎瘤和肿瘤的部分,将显示所有3个胚层组织。在畸胎瘤检测,hPSCs可以被注入老鼠的不同领域。最常见的注射部位,包括睾丸胶囊,补肾胶囊,肝,或到腿部皮下或肌肉注射11。在这里,我们描述了一个强大的协议畸胎瘤的肿瘤生长的部位使用睾丸胶囊hPSCs代。

Protocol

注:所有动物的程序必须由IACUC或相当于批准。

所有手术设备,手术前必须经过消毒。必须使用无菌手套,窗帘和纱布。

1。手术前准备

  1. 获得6周大的小家鼠CbySmn.CB17-Prkdc SCID鼠/ J的雄性小鼠或其他免疫功能低下小鼠品系。
  2. 消毒所有的手术器械,手套和纱布。
  3. 游离hPSCs被与accutase注射。
  4. 计数细胞和悬浮1,000,000每20-30μL细胞基底膜稀释DMEM/F-12 1:1。细胞置于冰上,直到完成。
  5. 请注意,往往通过注射台盼蓝实验运行是有益的事情。这将有助于识别任何潜在的问题,在任何细胞都浪费掉了。
  6. 在饲养箱,麻醉你的鼠标,根据你的机构接受的程序。在我们的实验中,我们使用了麻醉ESIA机与异氟醚。小鼠最初被放置在一个感应室1L/min氧和3-4%的异氟醚。一旦麻醉,鼻锥与1L/min的氧气和2-3%的异氟醚。
  7. 剃光与快船队的腹部,并清理鼠标腹部前壁,从腹部的中心开始向外顺时针方向和工作。首次使用聚维酮碘溶液,然后用70%乙醇。重复3次,每次改变拭子。动物转移到一个加热垫,保持温暖的动物组织培养或解剖罩内。
  8. 使1厘米的纵向切口,通过皮肤与腹膜无菌手术剪刀,略低于髋关节水平。
  9. 腹膜,用镊子走向右臀达到另一个无菌forcept和白色脂肪组织连同附睾丸拉出。
  10. 睾丸放在无菌纱布。
  11. 补充结核菌素或哈密尔顿(1CC)注射器无线TH的hPSCs被注入。请注意,这是一个好主意,包括一个控制的HPSC行,你知道是WA09(也称为H9亚型),如多能干。这样,你有一个积极的控制,你可以用它来确定是否是有缺陷的注​​射或手术。
  12. 慢慢的hPSCs(20-30μL)注入睾丸胶囊中心远离任何大血管,停止,如果睾丸胶囊开始膨胀。
  13. 慢慢取下针,以避免回流的细胞。
  14. 使用镊子,转移到其原来的位置在腹部的睾丸和脂肪组织回。
  15. 关闭了2个或3个re​​absorbable缝合腹膜和皮肤与autoclips关闭。
  16. 鼠标应保持温暖,直到它恢复和手术后的一些镇痛药的形式(见什么是你的饲养箱中接受)一天两次1-2天。
    请注意,既不是麻醉剂,也不镇痛干扰与肿瘤的发展。
  17. 监测日é动物为6-12周的肿瘤生长。很少,肿瘤可能增长至6个星期前,注射后5毫米大小,因此它是重要的监测动物。如果发生这种情况,动物应安乐死和肿瘤处理和分析,像往常一样。
  18. 一旦肿瘤扪及达到约5毫米大小,麻醉鼠标,根据公认的动物协议的程序和牺牲。
  19. 取出肿瘤和文件 - 照片,测量尺寸,重量。
  20. 切成小块的肿瘤,并固定在4%多聚甲醛溶液。商店在4%多聚甲醛,直到样品被送到病理学家切片,染色和分析。

2。代表性成果:

当此协议的描述和注射的细胞是多能干,一个明显的,直观明显,肿瘤形成大多数在12个星期内。对于像WA09建立HPSC线,我们通常看到的6个星期内肿瘤。 IPSC的线,它是不寻常地看到8-10个星期内肿瘤。这是非常重要的,给老鼠注入了线,被称为是能干,作为阳性对照,以确保该程序是正确执行。肿瘤通常看起来非常庞杂,有许多附加囊肿(图1)。由病理学家的肿瘤样本分析显示分化组织所有三个胚层(图2)。

图1
图1。典型HPSC派生畸胎瘤在睾丸胶囊。

所描述的协议之后,一百万WA09细胞注入免疫受损小鼠的睾丸胶囊。六个星期后畸胎瘤进行了观察。一)的畸胎瘤拉鼠标。 b)关闭了畸胎瘤的图片。注意结构的异质性和囊肿。

图2 图2。苏木精和曙红染色切片从畸胎瘤显示每个胚层组织。
固定之后,畸胎瘤切片和苏木精伊红染色。由病理学家的分析显示,从每3个胚层细胞的存在。

Discussion

这里介绍的方法,提供一个高度可靠的,从在睾丸胶囊hPSCs产生畸胎瘤直截了当的方法。这项技术有几个关键参数。特别是,它是重要的注入HPSC细胞线,被称为是多能干细胞作为对照。其他重要参数包括注射液和肿瘤的观察之间的时间间隔。对于像WA09细胞株,畸胎瘤应观察6-8周。为IPSC的新线,我们发现,往往需要10个星期。另一个值得关注的是注入细胞的数量。我们注入一百万个细胞,但可以很容易地用较少的细胞进行检测。此外,注入介质是非常重要的。我们发现,我们得到最好的结果,当细胞被注入在基底膜和DMEM/F-12的1:1混合,PBS或DMEM/F-12反对。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是由摆围赠款#TR-1250,电阻RT1-01108,CL1-00502。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase Invitrogen A1110501
DMEM/F-12 Invitrogen 113300-032
Matrigel BD Biosciences 354277

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References

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Tags

医药,57期,干细胞,多能干细胞,hPSCs,畸胎瘤试验,动物模型,小鼠睾丸胶囊
畸胎瘤代睾丸胶囊
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Cite this Article

Peterson, S. E., Tran, H. T.,More

Peterson, S. E., Tran, H. T., Garitaonandia, I., Han, S., Nickey, K. S., Leonardo, T., Laurent, L. C., Loring, J. F. Teratoma Generation in the Testis Capsule. J. Vis. Exp. (57), e3177, doi:10.3791/3177 (2011).

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