Summary
Метод оценки сродства константа агонистом активном состоянии (
Abstract
Когда агонист активизирует население G-белком рецепторы (GPCR), он вызывает сигнального пути, который завершается в ответе клеток или тканей. Этот процесс может быть проанализирован на уровне одного рецептора, население рецепторов, или вниз по течению реакции. Здесь мы опишем, как анализировать ответ на выходе получить оценку агонист константа сродства для активного состояния одного рецепторов.
Рецепторы вести себя как квантовые коммутаторы, которые чередуются между активным и неактивным состояниями (рис. 1). Активном состоянии взаимодействует со специфическими белками G или другой сигнализации партнеров. В отсутствие лигандов, неактивном состоянии преобладает. Связывание агонистов увеличивает вероятность того, что рецептор переходит в активное состояние, потому что его константа сродства для активного состояния (К б) гораздо больше, чем для неактивном состоянии (К). Суммированиеслучайного выхода из всех рецепторов в популяции дает постоянный уровень активации рецептора во времени. Обратная концентрации агониста вызывая полумаксимальной активации рецептора эквивалентно наблюдается постоянная близость (K набл), а доля агонист-рецепторных комплексов в активное состояние определяется как эффективность (ε) (рис. 2).
Методы анализа вниз по течению ответы GPCRs были развиты, что позволяют оценка K набл и относительной эффективности агониста 1,2. В этом докладе показано, как изменить этот анализ для оценки агонистов К б значение относительно, что другого агониста. Для тестов, которые показывают учредительных деятельности, мы покажем, как оценить К б в абсолютных единицах М -1.
Наш метод анализа агонист реакции на концентрацию кривые 3,4 состоитглобальной нелинейной регрессии с использованием операционной модели 5. Мы описываем процедуру, используя программное приложение, Prism (GraphPad Software, Inc, Сан-Диего, Калифорния). Анализ дает оценку произведению K набл и параметр, пропорциональный эффективности (τ). Оценку тк набл одного агониста, деленная на территорию другого, является относительной мерой К Ь (РА я) 6. Для любого рецептора выставке учредительных деятельности, то можно оценить параметр, пропорциональный эффективности свободный комплекс рецепторов (τ системы). В этом случае значение К Ъ агонист эквивалентно тк затемнения / τ системы 3.
Наш метод используется для определения избирательности агонистом рецепторов подтипа и для количественного агонист-рецептор передачи сигналов через различные белки G.
Protocol
1. Измерение концентрации агониста-ответ кривые: нет учредительных деятельности
- Для оценки относительного агонистов К значения б (RA я), серии по крайней мере два агониста реакции на концентрацию кривых не требуется. Любой в пробирке тест для функциональной реакции GPCR могут быть измерены при условии, что концентрация агониста можно управлять и один тип рецепторов опосредует ответ. Подходит клеточной анализы включают измерение цАМФ 4,7 и 8,9 inositolphosphate накопления в клеточной линии выражения рекомбинантных рецепторов. Примеры целом анализы тканей включают измерение сокращение гладкой мускулатуры 10 или M 2 мускариновых рецепторов и β 1-адренорецепторов-опосредованной изменения в сокращении поля-стимулированных крыс левого предсердия 11.
- Выберите серию агонистов для анализа, включая высокую эффективность агониста(Например, эндогенный лиганд). В данном эксперименте, измерять полное реакции на концентрацию кривые для каждого агониста. Если количество агонистов является слишком большим для завершения анализа в одном эксперименте, разделить агонистов на подгруппы, каждая из которых состоит из управляемого количества агонистов для одного эксперимента. Для каждой подгруппы, измерять концентрации кривую реакции высокую эффективность агониста вместе с теми, от других агонистов в подгруппе (см. Рисунок 3). Повторите эксперимент для каждой подгруппы 3 - 6 раз, примерно, в зависимости от изменчивости данных.
- Для каждой реакции на концентрацию кривой, измерять отклик в отсутствие агониста (базальной ответ), и в присутствии увеличивающихся концентраций агониста. Космические агонист концентрации равномерно по логарифмической шкале примерно раз в 0,3 - 0,7 журнала 10 единиц, охватывающих диапазон ответов и определяя максимальную реакцию (E макс) (см. Рисунок 3). Для experimродителей на клеточных линиях, каждое измерение делается в трех экземплярах.
- Вычтите базальной ответ, что измеряется в присутствии друг концентрации агониста. Ответы приведены на рисунке 3 были рассчитаны таким образом.
2. Предварительный анализ агонисты реакции на концентрацию кривые: нет учредительных деятельности
- Введите данные из реакции на концентрацию экспериментов (например, на рисунке 5) в таблице данных в Prism. Все концентрации агониста журнал заносятся в столбце X. ответ измерений для агонистов, что, кажется, наибольшее значение Е макс вводятся в колонку, и те, для других агонистов вводятся в смежный буквами столбцов. Репликация измерения реакции на концентрацию кривые вступил в подграфах данного буквами столбцов.
- Выберите график лист, на котором нанесены данные и анализировать данные нелинейного регрессионного анализа использованияУравнение право, журнал (агонист) по сравнению с ответом - Переменный наклон (четыре параметра). Ограничение "Bottom" параметра к нулю, а также выполнять регрессионного анализа. Скопируйте "Top" (E макс) и войдите в ЕС 50 параметров в таблицу Excel для использования в расчете начальной оценки параметров. Агонист с крупнейшими оценку макс E обозначается как "стандартные агонист", тогда как другие агонисты обозначены как "тест агонистов".
- Рассчитать первоначальную оценку журнала тк набл (LOGR1), а отрицательный журнал EC 50 Значение стандартного агонистов (-журнале ЕС 50 ').
Рассчитать первоначальную оценку журнала РА я значение каждого теста агонист (LOGRA), а журнал {(Top * EC 50 ') / (Top' * EC 50)}, в котором параметры стандартных агонистов обозначены апостроф .
Рассчитать журнал близость конконстант из теста агонистов (LOGK2 - LOGK5), а отрицательный журнал своих ЭК 50 значений.
3. Оценка агонист значения RAI использованием нелинейного регрессионного анализа: нет учредительных деятельности
- Введите данные в таблицу данных в Призма, как описано выше в разделе 2.1. Убедитесь, что данные для стандартных агонистов вводятся в столбце A.
- Введите определяемые пользователем уравнения ", журнал Рай», в Призма по нескольким линиям, как показано в случае с участием в общей сложности пять агонисты:
- <A> P = LOGK1
- <A> Q = LOGR
- <~> Q = LOGR + LOGRA
- <B> P = LOGK2
- <C> P = LOGK3
- <D> P = LOGK4
- <E> P = LOGK5
- Y = MSYS / (1 + {[(1 +10 * (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
- Введите начальные оценки параметров следующим образом:
Введите сколь угодно низких значение 0 для постоянной журнал сродством (LOGK1) стандартного агониста.
Введите первоначальной оценкиLOGR и близость констант (LOGK2 - LOGK5) и войдите в Рай значения (LOGRA) испытательного агонистов.
Назначение первоначальной оценки фактора датчик наклона (M) значение 1,0.
Назначение первоначальную оценку для максимального отклика системы (MSYS) значение эквивалентной макс Е стандартных агонистов (Top). - Применяют следующие ограничения параметров: LOGK1 вынужден постоянно, 0; LOGR1, MSYS и M, общая стоимость для всех наборов данных; LOGK2 - LOGK5 и LOGRA, никаких ограничений.
- Инициировать нелинейного регрессионного анализа. Результаты выхода журнала K набл и войти РА я значения тест агонистов. Если стандартная агонисты полный агонист, то оба журнала K набл и журнала РА я значения являются точными. Если наиболее эффективным агонистом (стандартный агонист) на самом деле частичный агонист, то K набл значений более эффективным AGonists может быть переоценена. Тем не менее, оценки журналов РА я еще точно в этой ситуации.
- Если регрессия не сходится, экспериментатор, возможно, пожелают построить теоретическую кривую, определяемую начальной оценки параметров. Если Есть большие расхождения между данными точками и теоретическими кривыми, проверить расчет начальной оценки параметров. Если один или несколько агонисты Е максимальные значения эквивалентной стандартной агонист, это может быть необходимо ограничить их журнал К набл значения 0 для регрессии для сходятся на решение.
4. Измерение концентрации агониста-ответ кривых в клеточных анализов выставке учредительных активности рецепторов
- Для оценки агонистов К значения б в абсолютных единицах М -1, клеточной в пробирке тесты используются, которые проявляют учредительных активности рецепторов. КонстиTIVE активности рецепторов определяется как увеличение ответа выше базального уровня вызвано экспрессии рецептора интересов.
- Выберите агонистов и дизайн эксперимента, как описано выше в разделе 1.2.
- Для каждой реакции на концентрацию кривой, измерять отклик в отсутствие агониста, не связанных с трансфекции клетки (базальные ответ) и в клетках, трансфицированных рецепторов интереса (базальной ответа + учредительных ответ). Меры реагирования в присутствии различных концентраций различных агонистов, как описано выше в разделе 1.3.
- Рассчитать учредительных активности рецепторов и ответ на каждый концентрации агониста как взвешенный ответ минус базальной ответ в клетки не трансфицированных рецепторов. На рисунке 6 показан реакции на различные агонисты рассчитывается таким образом для сигнального пути выставке очень низкой, конститутивной деятельности.
5. Предварительныеalysis агониста реакции на концентрацию кривые экспонирования учредительных деятельности
- Введите данные (например, на рисунке 6) в таблице данных в Призма, как описано в разделе 3.1, а также ввести ответ вызванные учредительных активности рецепторов в соответствующих буквами столбцов, соответствующих концентрации журнал агонист -20. Большой отрицательный логарифм вводится приблизить агонист концентрации, равной нулю.
- Анализ данных, как описано выше в разделе 2.2, но с "Bottom" Параметр ограничения так, чтобы это "общий для всех наборов данных." Скопируйте "Top" (E макс), общий "Bottom" и журнала EC50 параметры в таблицу Excel для использования в расчете начальной оценки параметров.
- Рассчитать начальные оценки параметров следующим образом:
Журнал константа сродства стандартных агонистов (LOGK1) или любой другой, тест агонистов должны быть определены в отдельных экспериментах, как описано выше 3
Рассчитать первоначальную оценку журнала K набл значение каждого частичного агониста теста (т. е. только LOGK2 в данном случае), как журнал {(Top'-Top) / (ЭК 50 (Top'-Bottom))}, в котором "Bottom »означает реакция вызвана учредительных активации рецептора.
Рассчитать первоначальную оценку § К Ь (LOGKb) для каждого агониста как журнал Top {/ (ЭК 50 внизу)}.
Рассчитать первоначальную оценку журнала τ системы (LOGTsys), а журнал {Низ / (Топ '- Нижний)}.
6. Оценка значения агонист Kb для ответов выставке учредительных активности рецепторов использованием нелинейного регрессионного анализа
- Введите данные в таблицу данных в Призма, как описано выше, в 3,1
- Введите определяемые пользователем уравнения, "Вход Кб", в Призма по нескольким линиям, как показано на состояние двух агонистов:
- <A> LOGKOBS = LOGK1
- <B> LOGKOBS = LOGK2
- = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
- B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
- С = (10 ^ (LOGTSYS))
- Y = MSYS / {1 + [(/ (В + С)) ^ М]}
- Введите начальные оценки параметров следующим образом:
Введите близости констант каждого агониста (LOGK1 - введите значение определяется по шагу 5.3).
Введите K набл оценки каждого теста агониста.
Введите Kb оценки агонистов.
Введите журнал τ систем (LOGTsys) оценка.
Назначение фактор датчик наклона (М) и максимального отклика системы (MSYS) значения 1,0 и Top '(E макс стандартных агонистов), соответственно. - Применяют следующие ограничения параметров: LOGTsys, MSYS и М, общую ценность для всех наборов данных; LOGK2 и LOGKb, никаких ограничений.
- Инициировать нелинейного регрессионного анализа. Результаты дают журнал К б стандартных агонистов, журнал К набл К б значения частичные агонисты, а максимальный отклик системы (MSYS), значение τ система для свободного комплекса рецептор (LOGTsys), а фактор датчик наклона в операционной модели (М).
- Если регрессия не сходится, выполните действия, описанные выше в пункте 3.6.
7. Представитель Результаты
На рисунке 5 показаны некоторые из наших ранее опубликованных данных по мускариновые агонисты вызванных фосфоинозитидного гидролиза в яичника китайского хомячка клетки стабильно выражения M 3 мускариновые рецепторы 12. Реакции на концентрацию кривые выбранных мускариновые агонисты были измерены в этом анализе. Данные были проанализированы, как описано выше в разделе 3 для оценки значения К б каждого состязания, выраженное по сравнению с показателями oxotremorine-М. Эти журнал РА я оценкам, карбахола, -0,56 ± 0,063; Ареколинии, -0,60 ± 0,074; пилокарпин, -1,20 ± 0,15, а MCN-A-343, -1,92 ± 0,31. Теоретические кривые представляют наименьших квадратов уравнения регрессии для данных (раздел 3.2). Соответствующие оценки максимального отклика системы (М система) и фактор датчик наклона (М) были 53,9 ± 1,3 и 1,15 ± 0,09, соответственно. Журнал K набл значения агонисты, кроме того, что из oxotremorine-М были, карбахола, 5,19 ± 0,14; ареколина, 5,49 ± 0,12; пилокарпина, 5,58 ± 0,16 и MCN-A-343, 5,27 ± 0,33.
На рисунке 6 показан результаты экспериментов по мускариновые агонисты-стимулированных фосфоинозитидного гидролиза в НЕК 293 клетках стабильно выражения G α15 3. Переходные выражение M 3 мускариновые рецепторы вызвало увеличение базальной гидролиза фосфоинозитидного, которое было связано с учредительными рецептор активностиИти. Данные были проанализированы с целью оценки журнал К б значения oxotremorine-М и MCN--343, как описано в разделе 6. Этот анализ дал журнал К б значения 8,30 ± 0,59 и 6,59 ± 0,77 для oxotremorine-М и MCN-A-343, соответственно. Теоретические кривые представляют наименьших квадратов уравнения регрессии для данных (см. раздел 6.2). Оценкам журнала τ системы, системы M и М -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 и 0,72 ± 0,08, соответственно. Оценка K набл значение MCN--343 была 5,35 ± 0,46.
Рисунок 1. Связь между одним активности рецепторов и средний уровень активации рецепторов населения. Одноместный активности рецепторов, теоретическое поведение одного рецептора претерпевает transitioнс между активной (On) и неактивных (Off) состояний в присутствии агонистов показано. Сродством константы агонистом для активного и неактивного состояния обозначаются К В и К, соответственно. Население поведения, теоретическое поведение некоторых рецепторов происходят случайные переходы между активными и неактивными государства в присутствии агонистов показано. Население средний, средний уровень активации рецептора в популяции рецепторов в присутствии определенной концентрации агониста показано. Активация уровня рецепторов населения известен как стимул.
Рисунок 2. Взаимосвязь между функцией активации рецепторов и эффективности (ε) и наблюдается постоянная близость (K набл) из агониста. Население среднего, средний уровеньактивации рецепторов вызван увеличением концентрации агониста показано. активации рецептора, средний уровень активации рецептора построена агонист журнал концентрации агониста. Концентрация отрицательных журнал агонист, необходимых для полумаксимальной активации рецептора эквивалентно журнал наблюдается близость константы агонист (журнал К набл). Максимум функции активации рецепторов обозначается как эффективность (ε).
Рисунок 3. Примеры реакции на концентрацию кривые для стимуляции [3 H] inositolphosphate накопления различных мускариновые агонисты в яичника китайского хомячка клеток, экспрессирующих человеческий M 3 мускариновые рецепторы. В общей сложности девять агонист реакции на концентрацию кривые были измерены. Эксперимент может быть разделена на две части. Для каждой части, стандартные агонист (oxotremorinем) всегда испытание вместе с дополнительными агонистов. Таким образом, два эксперимента типа, показанного в и б необходимы для измерения реакции на концентрацию кривые девяти агонистов, если только пять агонисты могут быть проанализированы сразу. Данные взяты из Элерт и соавт. 12.
Рисунок 4. Примеры реакции на концентрацию кривые для стимуляции [3 H] накопления inositolphosphate различными мускариновые агонисты в HEK 293 клеток, экспрессирующих человеческий M 2 мускариновых рецепторов и G α15. Выражение М 2-рецепторов, вызванных 30 - 35% [3 H] inositolphosphate ответ, который приписывается учредительных активности рецепторов. Данные взяты из Элерт и соавт. 12.
Рисунок 5. 3 мускариновые рецепторы. Реакции на концентрацию кривые выбранных мускариновые агонисты для стимулирования фосфоинозитидного гидролиза показано на рисунке. Средние значения из трех экспериментов ± SEM показаны. Данные взяты из Элерт и соавт. 12.
Рисунок 6. Oxotremorine-М-и-MCN-343-опосредованной фосфоинозитидного гидролиза в HEK 293 клеток, экспрессирующих G α15 и M 3 мускариновые рецепторы. Фосфоинозитидного гидролиза выражается по отношению к E максимум oxotremorine-М. В отсутствие агониста, фосфоинозитидного гидролиза приписывается выражение М 3 рецепторов приходится около 2% от ответа. Помощи трех экспериментов ± SEM показаны. Гата взяты из Элерт и соавт. 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Потому что наш метод оценки РА я (относительно К б значению) только требует измерения концентрации агониста-ответ кривые, наш анализ можно сделать в любое время эти кривые измерены.
Если изо дня в день изменения в ответе экспериментальной подготовки (например, клеток или тканей) велика, ответ измерения каждой реакции на концентрацию кривой можно нормировать относительно "Топ" оценка стандартного агонистом для каждого дня эксперимента. Оценка сверху и журнал EC 50 рассчитан на каждой параллельной реакции на концентрацию кривой стандартных агонистов методами регрессионного анализа, как описано в разделах 2 и 5. Ответ значений всех агонистов реакции на концентрацию кривых на данный день нормированы по отношению к Top оценка стандартного агонистов в этот день. Эти нормализованные данные затем анализируются, как описано выше beginnING в разделе 3.
Точность оценки К б зависит от точной оценки учредительных активности рецепторов. В нашем случае трансфекции М 3 рецепторов в клетках НЕК 293 вызвало увеличение фосфоинозитидного гидролиза, которая колебалась от 500 - 1000 копий в минуту [3 H] inositolphosphates измеряется в присутствии лития в клетки предварительно помечены [3Н] инозитол . Максимальный ответ на карбахола было примерно 50000 - 60000 копий в минуту. Если бы ответ был учредительных крупные и менее изменчивы, наша оценка значения К Ъ oxotremorine-М и MCN--343 была бы более точной. Оценка К б также зависит от наличия точной оценки факторов датчик наклона (М) в операционной модели. Следовательно, более точно можно было бы достичь, если концентрации агониста были более близко расположенными, как рекомендуется в разделе 1.3. Runniнг дополнительные агонисты в эксперименте, также значительно повышает точность оценки М, а следовательно, и К б.
Если Есть различные активные состояния рецепторов, что сигнал через различные белки связи (например, G белков), то наш метод анализа дает точной оценки агонистов К б и Р. я значения для каждого эффекторные пути 3,6. Если более одного активного состояния вносит свой вклад в единый взвешенный ответ, то наш метод оценки РА я и К б представляет собой средневзвешенную различных активных состояний в зависимости от их относительной численности и активности 3.
Учредительный активности рецепторов могут быть вызваны более выразив ХВГФ и дополняющих ее белка G 13. Это может измениться, наблюдается близость и эффективность агонист-рецепторного комплекса и может привести к не рhysiological сигнализации. Но изменения в характере реагирования и наблюдается близость и эффективность рецепторов населения не означают изменения в фундаментальные квантовые состояния рецептора, только изменения в их число и вероятность изомеризации. Таким образом, G белки не столько определитель эффекты препарата так много, как окно в различных эффекторных-селективные состояния рецепторов. Если наш метод анализа применительно к конкретным ХВГФ сигнализации тесты с участием одного эффектов (например, G белок) должна быть возможность для измерения агонистов К б значения для эффекторных-селективные состояния рецепторов - конечная мера агонист предвзятости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья Грант GM 69829.
References
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T. Current Protocols in Pharmacology. Enna, S. J. , John Wiley & Sons. (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
