Summary
Aktif devlet için bir agonist afinite sabiti tahmin etmek için bir yöntem (
Abstract
Agonist G-protein bağlı reseptörler (GPCRs) bir nüfusu harekete geçirir, hücre veya doku tepki doruğa sinyal yolağı ortaya çıkarır. Bu süreç, tek bir reseptör, bir nüfus reseptörlerinin veya bir alt-yanıt düzeyinde analiz edilebilir. Burada, tek reseptörler aktif devlet için sabit agonist yakınlığına bir tahmin elde etmek için mansap yanıt nasıl analiz açıklar.
Reseptörler quantal anahtarlar gibi davranan, aktif ve inaktif durumlar (Şekil 1) arasında alternatif. Etkin devlet, özel G proteinleri veya diğer sinyalizasyon ortakları ile etkileşime girer. Ligand yokluğunda, inaktif duruma hakimdir. Agonist bağlanma aktif devlet (K b) sabit, yakınlık inaktif duruma (K) için çok daha büyük, çünkü reseptör aktif devlet geçer olasılığını artırır. Toplamıtüm nüfus reseptörlerinin rastgele çıkışlar, zaman içinde reseptör aktivasyonu sabit bir seviyede verir. Yarım maksimum reseptör aktivasyonu eliciting agonist konsantrasyonu karşılıklı gözlenen afinite sabiti (K atıl) eşdeğer olup, aktif devlet agonist-reseptör komplekslerinin fraksiyonu etkinliği (ε) (Şekil 2) olarak tanımlanır.
K atıl ve bir agonist 1,2 göreceli etkinliği tahmin etkinleştirmeniz GPCRs downstream yanıtları analiz etmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu raporda, biz başka bir agonist agonist K b değeri tahmin etmek için bu analizi nasıl değiştirileceğini gösterir . Kurucu faaliyet gösteren testlerde, K b M -1 mutlak birimleri nasıl tahmin göstermektedir.
Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri 3,4 analiz yöntemi oluşuroperasyonel modeli 5 kullanarak global doğrusal olmayan regresyon. Biz yazılım uygulaması, Prizma (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA) kullanılarak bir prosedür tanımlamaktır. K ürün atıl ve etkinliği (τ) ile orantılı bir parametre analizi bir tahmin verir. Başka tarafından bölünmüş bir agonist τK atıl, tahmin K b göreceli bir ölçü (RA i) 6. Kurucu aktivite sergileyen bir reseptör için, ücretsiz reseptör kompleksinin etkinliği (τ sys) ile orantılı bir parametre tahmin etmek mümkündür. Bu durumda, bir agonist K b değeri τK atıl / τ sys 3 eşdeğerdir.
Yöntemi reseptör alt tiplerinin bir agonist seçicilik belirlenmesi için ve farklı G proteinleri aracılığıyla agonist-reseptör sinyal ölçülmesi için yararlıdır.
Protocol
1. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçümü: kurucu aktivite
- Göreceli agonist K b değerleri tahmini (RA i) için, en az iki agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri bir dizi gereklidir. Herhangi bir GPCR fonksiyonel yanıtı in vitro tayininde agonist konsantrasyonu kontrollü ve tek tip reseptör aracılık yanıt olabilir ölçülebilir. Uygun hücre tabanlı testlerin cAMP 4,7 ölçüm ve rekombinant bir reseptör ifade inositolphosphate birikimi 8,9 hücre hattı içerir. Bütün doku testlerin örnekleri, düz kas 10 veya M 2 muskarinik reseptör ve sol atrium 11 alan uyarılmış sıçan daralma β 1-reseptör-aracılı değişiklikler kasılması ölçümü içerir .
- Agonistlerin analizi için çok etkili bir agonist dahil olmak üzere bir dizi seçin(Örneğin, endojen ligand). Verilen bir deneyde, her agonist için tam konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçer. Agonistlerin tek bir deneyde tahlil tamamlamak için çok büyükse, alt gruplar, her biri tek bir deney için yönetilebilir bir sayıda agonistlerin oluşan agonistleri bölün. Her alt grup için (bkz. Şekil 3) ile birlikte bu alt grup diğer agonistlerin çok etkili agonist konsantrasyon-yanıt eğrisi ölçmek. 6 kez, yaklaşık verilerin değişkenliği bağlı olarak her 3 alt grup için deneyi tekrarlayın.
- Her konsantrasyon-yanıt eğrisi için, agonist (bazal yanıt) yokluğunda tepki ölçmek ve artan agonist konsantrasyonları varlığı. Space düzgün bir günlük ölçekli yaklaşık her 0.3 üzerinde agonist konsantrasyonları - 0.7 günlük 10 adet, yanıtların yelpazesini kapsayan ve maksimal yanıt (E max) (bkz. Şekil 3) tanımlama. Experim içinhücre dizileri üzerine veliler, her ölçüm üç nüsha halinde yapılır.
- Her agonist konsantrasyonu ölçülen bazal yanıt çıkarın. Şekil 3'te çizilen tepkiler bu şekilde hesaplandı.
2. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ön analizi: kurucu aktivite
- Prizma Veri Tablosu konsantrasyon-yanıt deneyler (örneğin, Şekil 5) veri girin. Tüm günlük agonist konsantrasyonları en büyük D max değeri görünür agonist yanıtı ölçümleri sütun A girilir ve diğer agonist bitişik harfli sütun girilen X etiketli sütununun altında girilir. Konsantrasyon-yanıt eğrileri çoğalt ölçümler belirli bir harfli sütunun alt sütunlar halinde girilir.
- Çizilen verileri hangi grafik sayfasını seçin ve doğrusal olmayan regresyon analizi ile kullanarak verileri analizdenklemi başlıklı, log (agonist) karşı tepki - Değişken eğim (dört parametre). "Alt" parametresi sıfıra Koru'yu ve regresyon analizi gerçekleştirmek. "Top" (E max) kopyalayın ve ilk parametre tahminlerinin hesaplanmasında kullanılmak üzere bir Excel'e EC 50 parametreleri giriş yapın. Diğer agonistlerin "test agonistleri" olarak belirlenmiş ise, en büyük D max tahmin agonisti, "standart agonist" olarak belirlenmiş .
- Standart agonist (-log EC 50 ') negatif günlük EC 50 değeri olarak atıl günlük τK ilk tahmini (LOGR1) hesaplayın.
Günlük RA her test agonist i değeri (LOGRA) ilk tahmini günlük olarak hesaplayın {(En * EC 50 ') / (Top' * EC 50)} parametreleri standart agonist bir kesme işareti ile belirtilir, .
Günlük afinite con hesaplayınilgili EC 50 değerleri negatif günlük olarak test agonistlerin kopolimerlesme sabitleri (LOGK5 LOGK2).
3. Doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak agonist Rai değerleri tahmini: yok kurucu aktivite
- 2.1 'de yukarıda açıklandığı gibi Prism bir veri Tablo içine veri girin. A sütunundaki standart agonist için veri girildiğinden emin olun.
- Toplam beş agonistlerin ilgili davanın görüldüğü gibi, kullanıcı tanımlı bir denklem girin birkaç satırlık Prizma, "RAI log"
- <A> P = LOGK1
- <A> Q = LOGR
- <~ A> Q = LOGR + LOGRA
- <B> P = LOGK2
- <C> P = LOGK3
- <D> P = LOGK4
- <E> P = LOGK5
- Y = MSYS / (1 + {[(1 +10 ^ (X + P)) / (10 ^ (X + S))] ^ M})
- Ilk parametre tahminleri aşağıdaki gibi girin:
Standart agonist günlük afinite sabiti (LOGK1) için 0, keyfi olarak düşük bir değer girin.
Ilk tahmin girinLOGR ve afinite sabitleri (LOGK2 - LOGK5) test agonistleri ve günlük Rai değerleri (LOGRA).
Ilk tahmin transdüser eğim faktörü (M) 1.0 bir değer atayın.
Ilk tahmin sistemi maksimal yanıt (MSYS) standart agonist (En) E max eşdeğer bir değer atayın. - LOGR1, MSYS ve M, tüm veri kümeleri için paylaşılan değer; LOGK5 ve LOGRA, hiçbir sınırlama LOGK2 LOGK1 sürekli, 0 kısıtlı: aşağıdaki parametre kısıtlamaları uygulayın.
- Doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. Sonuçları atıl günlük K verim ve test agonistlerin günlük RA i değerleri. Standart tam agonist agonist ise, günlük K hem atıl ve günlük RA i değerleri doğru. Sonra en etkili agonist (standart agonist), K aslında bir kısmi agonist ise atıl daha etkili ag değerlerionists abartmış olabilir. Bununla birlikte, günlük RA tahminleri i hala bu durumda doğru olan.
- Regresyon yakınsama değilse, deneyci ilk parametre tahminleri tarafından tanımlanan teorik egri isteyebilirsiniz. Veri noktaları ve teorik eğriler arasında büyük sapmalar varsa, ilk parametre tahminlerinin hesaplanmasına kontrol edin. Bir veya daha fazla agonistler D max standart agonist eşdeğer değerleri varsa, atıl regresyon için 0 değerleri bir çözüm üzerinde birleşmemiz log K sınırlamak için gerekli olabilir.
4. Agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçümü, hücre tabanlı testlerin kurucu reseptör aktivitesi gösteren
- M -1, in vitro tayinlerde, hücre tabanlı sergi kurucu reseptör aktivitesinin kullanılır mutlak birimleri agonist K b değerleri tahmini için. Anayasaltive reseptör aktivitesinin ilgi reseptör ifade kaynaklanan bazal seviyesinden tepki artış olarak tanımlanır.
- Agonistleri seçin ve bölüm 1.2 'de yukarıda açıklandığı gibi deney tasarımı.
- Her konsantrasyon-yanıt eğrisi için, agonist olmayan transfekte hücrelerin yokluğunda (bazal yanıt) ve reseptör ilgi (bazal yanıt + kurucu yanıt) ile transfekte hücreleri tepki ölçer. Bölüm 1.3 'de yukarıda açıklandığı gibi farklı agonistlerin farklı konsantrasyonlarda huzurunda yanıt ölçün.
- Kurucu reseptör aktivitesini ve ölçülen tepki eksi reseptör ile transfekte hücrelerinde bazal yanıt olarak her agonist konsantrasyonu yanıt hesaplayın. Şekil 6 çok düşük kurucu aktivite sergileyen bir sinyal yolağı için bu şekilde hesaplanan çeşitli agonistlere tepkiler gösterir.
5. Ön birkurucu faaliyet gösteren agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri alysis
- Bölüm 3.1 'de açıklandığı gibi, aynı zamanda -20 günlük agonist konsantrasyonuna tekabül eden uygun harfli sütun kurucu reseptör aktivitesinin neden tepki girerken Prizma bir veri Tablo verileri (örneğin, Şekil 6) girin. Büyük bir negatif logaritması yaklaşık bir agonist konsantrasyonu sıfır girilir.
- Bölüm 2.2 'de yukarıda açıklanan, ancak "Alt" parametresi o kadar kısıtlı olarak veri analiz "tüm veri kümeleri için paylaşılan" "Top" (E maks), paylaşılan "Alt" Kopyala ve Excel'e ilk parametre tahminlerinin hesaplanmasında kullanılmak için bir log EC50 parametreleri.
- Ilk parametre tahminleri aşağıdaki gibi hesaplayın:
Daha önce 3 açıklandığı gibi standart agonist (LOGK1) veya herhangi bir tam testi agonist sürekli günlük yakınlığı ayrı deneylerde tespit edilmelidir
Günlük ilk tahmini hesaplayın K atıl günlük {(Top' Top) / (EC 50 (Top' Alt))} olarak, her bir kısmi test agonist değeri (yani, bu durumda sadece LOGK2), " Alt "kurucu reseptör aktivasyonu ile neden tepki göstermektedir.
Log K b (LOGKb) günlük olarak her agonist için ilk tahmin hesaplayın {Top / (EC 50 Alt)}.
Günlük olarak hesaplayın ilk tahmini günlük τ sys (LOGTsys) {/ Alt (Top '- Alt)}.
6. Doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak kurucu reseptör aktivitesinin sergileyen yanıtlar için agonist Kb değerleri tahmini
- 3.1 altında yukarıda açıklandığı gibi Prism bir Veri Tablosu verileri girin
- Durum için iki agonistlerin gösterildiği gibi kullanıcı tanımlı bir denklem girin, birkaç satırlık Prizma, "Kb Log"
- <A> LOGKOBS = LOGK1
- <B> LOGKOBS = LOGK2
- A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) +1
- B = 10 ^ (X + LOGTSYS + LOGKB)
- C = (10 ^ (LOGTSYS))
- Y = MSYS / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
- Ilk parametre tahminleri aşağıdaki gibi girin:
Her agonist afinite sabitleri (adım 5.3 kapsamında belirlenen değer girin LOGK1) girin.
Atıl Her test agonist tahminler K girin.
Agonistlerin Kb tahminleri girin.
Τ sys (LOGTsys) tahmini giriş girin.
Sırasıyla, transdüser eğimi faktörü (M) ve sistemin maksimum yanıt (MSYS) 1.0 ve Top '(standart agonist E max) değerleri atayın. - LOGK2 ve LOGKb, hiçbir sınırlama LOGTsys, MSYS ve M, tüm veri kümeleri için paylaşılan değer: Aşağıdaki parametresi kısıtlamaları uygulayın.
- Doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. Sonuçlar, standart agonist günlük K b, günlük K atıl verim K b değerleri kısmi agonistler ve maksimal yanıt sistemi (MSYS), serbest reseptör kompleksi (LOGTsys) τ sys değeri, ve işletme modeli (M) transdüser eğim faktörü.
- Regresyon yakınsama değilse, Madde 3.6 altında yukarıda açıklanan adımları izleyin.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 5 stably M 3 muskarinik reseptör 12 ifade Çin hamsteri over hücrelerinde muskarinik agonist ile indüklenen inozitol hidroliz daha önce yayımlanmış verilere bazı gösterir . Bu testte seçilmiş muskarinik agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçüldü. Oxotremorine-M göre, Bölüm 3 kapsamında her agonist K b değeri tahmin Yukarıda ifade anlatıldığı gibi veriler incelendi. Areco Bu günlük RA i tahminleri, karbakol, -0.56 ± 0.063çizgi, -0,60 ± 0,074; pilokarpin, -1.20 ± 0.15 ve McN-A-343, -1,92 ± 0,31. Teorik eğrileri veri (Bölüm 3.2) regresyon denklemi en küçük kareler uyum temsil eder. Sistemin maksimum yanıt (M sys) ve transdüser eğim faktörü (M) ilgili tahminler, 53.9 ± 1.3 ve 1.15 ± 0.09, sırasıyla idi . Günlük K atıl oxotremorine-M dışında agonistlerin değerleri, karbakol, 5.19 ± 0.14; arecoline, 5.49 ± 0.12; pilokarpin, 5.58 ± 0.16 ve McN-A-343, 5.27 ± 0.33.
Şekil 6 stably G α15 3 ifade HEK 293 hücrelerinde muskarinik agonist-uyarılmış inozitol hidroliz deneylerin sonuçlarını gösterir. M 3 muskarinik reseptör Geçici ifade bazal inozitol hidroliz, kurucu reseptör activ atfedilen bir artışa neden olmuşturrınız. Bölüm 6 altında açıklandığı gibi oxotremorine-M ve McN A-343 günlük K b değerleri tahmin etmek için veriler analiz edildi. Bu analiz, sırasıyla oxotremorine-M ve McN A-343 için 8.30, log K b değerleri ± 0.59 ve 6.59 ± 0.77 verdi. Teorik eğriler verilere regresyon denklemi en küçük kareler uyum (bkz. Bölüm 6.2) temsil eder. Günlük τ sys, K sys ve M tahminleri -2,29 ± 0.59, 95.8 ± 2.8 ve 0.72 ± 0.08, sırasıyla. K tahmin atıl McN-A-343 değeri 5.35 ± 0.46 idi.
Şekil 1. tek bir reseptör aktivitesi ve reseptör nüfusun aktivasyonu ortalama seviyesi arasındaki ilişki Tek reseptör aktivitesi, teorik davranış transitio geçiren tek bir reseptöragonist varlığı arasında ns (Açık) aktif ve inaktif (Kapalı) devletler gösterilmiştir. Aktif ve etkin olmayan devletler için agonist afinite sabitleri sırasıyla, K b) ve (K a belirtilir. Nüfus davranış, bir agonist varlığı etkin ve etkin olmayan devletler arasında rasgele geçişler geçiren birkaç reseptörlerinin teorik davranış. Nüfus gösterilir ortalama, reseptörlerin agonist konsantrasyonu belirli bir varlığı bir popülasyonda ortalama seviyede reseptör aktivasyonu gösterilmiştir. Reseptör nüfusun aktivasyon düzeyini uyarıcı olarak bilinir.
Şekil 2 reseptör aktivasyon fonksiyonu ve etkinliği (ε) ve agonist Nüfus ortalama gözlenen yakınlık sabiti (K atıl) arasındaki ilişki, ortalama düzeydereseptör aktivasyonu agonist konsantrasyonları artan gösterilir tarafından ortaya Reseptör aktivasyonu, reseptör aktivasyonu ortalama düzeyde agonist agonist günlük konsantrasyonu çizilir. Yarım maksimum reseptör aktivasyonu için gerekli agonist negatif günlük konsantrasyon agonist (log K atıl) sürekli günlük gözlenen yakınlık eşdeğerdir. Reseptör aktivasyon fonksiyonu maksimum etkinliği (ε) olarak belirtilir.
Şekil 3, uyarılması için çeşitli insan M 3 muskarinik reseptör ifade Çin hamsteri over hücrelerinde muskarinik agonistlerin [3 H] inositolphosphate birikimi konsantrasyon-yanıt eğrileri örnekleri . Toplam dokuz agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçüldü. Deney iki bölüme ayrılabilir. Her bölümü için, standart agonist (oxotremorineM) her zaman ek agonistleri ile birlikte test edilir. Böylece, iki gösterilen tip deneyler a ve b, bir kerede sadece beş agonistleri test olabilir dokuz agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçmek için gereklidir . Veri Ehlert ve ark. [12 ].
Şekil 4 HEK 293 hücreler insan M 2 muskarinik reseptör ve G α15 ifade [3 H] inositolphosphate birikimi çeşitli muskarinik agonistler tarafından uyarılması için konsantrasyon-yanıt eğrileri örnekleri. M 2 reseptör ekspresyonu 30 neden - kurucu reseptör aktivitesinin atfedilen% 35 [3 H] inositolphosphate yanıt. Veri Ehlert ve ark. [12 ].
Şekil 5. 3 muskarinik reseptör dile getirdi. Uyarıcı inozitol hidroliz için seçilen muskarinik agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrileri gösterilmiştir. Üç deneylerden elde edilen ortalama değerler ± SEM gösterilmiştir. Veri Ehlert ve ark. [12 ].
Şekil 6. Oxotremorine-M ve G α15 ve M 3 muskarinik reseptör ifade HEK 293 hücrelerinde McN-A-343-aracılı inozitol hidroliz. Inozitol hidroliz oxotremorine-M E max göre ifade edilir. Agonist yokluğunda, inozitol hidroliz M 3 reseptör yanıtı yaklaşık% 2 oluşturdu ifade bağladı. Üç deneyler ± SEM yolu gösterilmektedir. Data Ehlert ve ark.. 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RA i (göreceli K b değeri) tahmin etmek için yöntem yalnızca agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri ölçümü gerektirdiğinden bu eğrileri ölçülen zaman, bizim analiz yapılabilir.
Deneysel hazırlanması (örneğin, hücreler veya doku) yanıt gün-için-gün varyasyon büyükse, her konsantrasyon-cevap eğrisi yanıt ölçümleri için standart agonist "En" tahmin göre normalize olması. Her günün deneme. Top bir tahmin ve günlük EC 50 Bölüm 2 ve 5 olarak açıklanan regresyon analizi ile standart agonist her çoğaltmak konsantrasyon-yanıt eğrisi tahmin edilmektedir. Belirli bir günde agonist konsantrasyon-yanıt eğrileri tüm yanıt değerleri, o gün için standart agonist en iyi tahmin göre normalize edilir . Beginn yukarıda açıklandığı gibi bu normalize edilmiş veriler daha sonra analiz edilirBölüm 3 de ing.
K b tahmin doğruluğu kurucu reseptör aktivitesinin doğru bir tahmin bağlıdır. Bizim durumumuzda, HEK 293 hücreler M 3 reseptör transfeksiyon yaklaşık 500 arasında değişmektedir inozitol hidroliz artışa neden lityum hücreler huzurunda ölçülen [3 H] inositolphosphates 1.000 kopyaya ön etiketli [3H] inositol . Karbakolün maksimum yanıt yaklaşık 50.000 - 60.000 kopyaya. Kurucu yanıt, oxotremorine-M ve McN A-343 K b değerlerinin tahmini daha büyük ve daha az değişken olsaydı daha doğru olurdu. K b tahmin aynı zamanda operasyonel model transdüser eğim faktörü (M) bir doğru tahmin bağlıdır . Sonuç olarak, bölüm 1.3 altında önerildiği gibi agonist konsantrasyonları daha yakından aralıklı olsaydı daha doğru elde edilmiş olabilir. Running ek agonistleri deneyde de büyük ölçüde K b, dolayısıyla M tahmin doğruluğu artar, ve.
Reseptör farklı farklı kaplin proteinler (örneğin, G proteinleri) aracılığıyla sinyal, daha sonra analiz yöntemi agonist K b) ve (RA doğru bir tahmin sağlar aktif devletler varsa ben her efektör yolak 3,6 değerleri. Birden fazla aktif durumda ölçülen tek bir yanıta katkıda bulunur, daha sonra RA i ve K b tahmin yöntemi, onların göreceli bolluk ve etkinlik 3 bağlı olarak farklı aktif devletlerin bir ağırlıklı ortalama temsil eder.
Bünye reseptör aktivitesinin GPCR ve tamamlayıcı G proteini 13 ifade ile indüklenen olabilir. Bu gözlenen afinite ve agonist-reseptör kompleksi etkinliğini değiştirebilir ve non-p neden olabilir.hysiological sinyalizasyon. Ama yanıt doğa değişiklikler ve reseptör nüfusun gözlenen yakınlık ve etkinliği, reseptör temel quantal devletler değişiklikler, sadece kendi sayısındaki değişim ve izomerizasyon olasılığı anlamına gelmez. Böylece, G proteinleri çok farklı reseptör efektör seçici devletler üzerine bir pencere olarak çok ilaç etkisi belirleyici değildir. Agonist önyargı nihai ölçüsü analiz yöntemi reseptör efektör seçici devletler için agonist K b değerleri ölçmek mümkün olmalıdır (örneğin, G-protein) tek bir efektör içeren özel GPCR sinyalizasyon testleri uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe GM 69.829 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.
References
- Stephenson, R. P. A modification of receptor theory. British Journal of Pharmacology. 11, 379-393 (1956).
- Furchgott, R. F. The use of b-haloalkylamines in the differentiation of receptors and in the determination of dissociation constants of receptor-agonist complexes. Advances in Drug Research. 3, 21-55 (1966).
- Ehlert, F. J., Suga, H., Griffin, M. T. Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: Estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. J. Pharmacol. Exp. Ther. 33, 671-686 (2011).
- Griffin, M. T., Figueroa, K. W., Liller, S., Ehlert, F. J. Estimation of Agonist Activity at G Protein-Coupled Receptors: Analysis of M2 Muscarinic Receptor Signaling through Gi/o,Gs, and G15. J. Pharmacol. Exp. Ther. 321, 1193-1207 (2007).
- Black, J. W., Leff, P. Operational models of pharmacological agonism. Proceedings of the Royal Society of LondonSeries B: Biological Sciences. 220, 141-162 (1983).
- Tran, J. A., Chang, A., Matsui, M., Ehlert, F. J. Estimation of relative microscopic affinity constants of agonists for the active state of the receptor in functional studies on M2 and M3 muscarinic receptors. Mol. Pharmacol. 75, 381-396 (2009).
- Schultz, J., Hamprecht, B., Daly, J. W. Accumulation of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in clonal glial cells: labeling of intracellular adenine nucleotides with radioactive adenine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 1266-1270 (1972).
- Berridge, M. J., Downes, C. P., Hanley, M. R. Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochemical Journal. 206, 587-595 (1982).
- Kendall, D. A., Hill, S. J. Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis. , Raven Press. Yamamura, H.I. 68-87 (1990).
- Pulido-Rios, M. Vitro Isolated Tissue Functional Muscarinic Receptor Assays. Current Protocols in Pharmacology. 48, 4-15 (2010).
- Kenakin, T. Current Protocols in Pharmacology. Enna, S. J. , John Wiley & Sons. (2001).
- Ehlert, F. J., Griffin, M. T., Sawyer, G. W., Bailon, R. A. simple method for estimation of agonist activity at receptor subtypes: comparison of native and cloned M3 muscarinic receptors in guinea pig ileum and transfected cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 289, 981-992 (1999).
- Burstein, E. S., Spalding, T. A., Brann, M. R. Pharmacology of muscarinic receptor subtypes constitutively activated by G proteins. Mol. Pharmacol. 51, 312-319 (1997).
