量化在G蛋白偶联受体激动剂活性

Summary

一个活跃状态激动剂的亲和力常数估算方法（

Abstract

当激动剂激活G蛋白偶联受体（GPCRs）的人口，就会引发一个信号通路在细胞或组织的反应达到高潮。这个过程可以在一个单一的受体，受体的人口，或下游的反应程度进行分析。在这里，我们描述如何分析下游的反应，以获得激动剂亲和力常数为单一受体的活跃状态的估计。

受体表现为量子开关，有效和无效状态（图1）之间的交替。激活状态的交互与特定的G蛋白或其他信号伙伴。在配位体的情况下，非国家占主导地位。激动剂约束力增加的可能性，受体将进入活跃状态的开关，因为其亲和常数为活跃状态_（K B）比为无效状态_（K一）要大得多。求和随机输出的人口中的所有受体产生一个恒定的水平在时间上的受体激活。引出半最大受体激活受体激动剂浓度的倒数相当于观测到的亲和常数_（K OBS），并处于活动状态的激动剂-受体复合物的一小部分是定义为疗效（ε） （图2）。

已经开发了分析，对GPCRs下游反应的方法， 使估算_的K OB和相对^有效性激动剂1,2。在这份报告中，我们将展示如何修改此分析来估计激动剂_K B值相对另一激动剂。我们的分析，展示构活动，显示如何_估计 K B的^M -1的绝对单位。

我们分析激动剂浓度反应曲线^3,4的方法包括全球非线性回归使用的运作模式^5。我们描述一个程序使用的应用软件，棱镜（GraphPad软件公司，加利福尼亚州圣迭戈）。分析得出K产品_的OB和疗效（τ）成正比的参数估计。 _τKOBS之一激动剂除以另一个，估计是一个相对尺度_K B（RA _^I）6。任何参展构活动的受体，它是可能的估计参数免费受体复合物的疗效_（τSYS）成正比。在这种情况下_，K B激动剂的价值相当于_{τKOBS /τ} ^系统 3 。

我们的方法是有用的，确定为受体亚型激动剂的选择性和量化通过不同的G蛋白受体激动剂信令。

Protocol

1。测量激动剂浓度反应曲线：没有构活动

1. 相对激动剂_K B值（RA _I）估计，至少有两个激动剂浓度反应曲线是必需的。任何的G蛋白偶联受体的功能反应在体外检测可测激动剂浓度可以控制和单一类型的受体介导的响应。合适的细胞检测包括测量^营地 4,7 ^和 8,9 inositolphosphate积累在细胞株表达了重组受体。整个组织检测的例子^包括 10平滑肌_或 M 2受体和_β-肾上腺素受体 ​​介导的左^心房 11日的现场刺激的大鼠收缩的变化收缩的测量。
2. 选择一系列激动剂进行分析，包括一个高度有效的激动剂（例如，内源性配体）。在一个给定的实验，测量完成每个激动剂浓度反应曲线。如果激动剂数量太大，在一次实验中完成检测，分为亚组，每个组成一个单一的实验管理的激动剂激动剂。对于每一个分组，测量与在该小组的其他激动剂的高度有效的激动剂浓度响应曲线（见图3）。重复每个小组的实验3 - 6次，约，取决于数据的可变性。
3. 对于每个浓度响应曲线，衡量在没有激动剂（基底回应）的响应，并在激动剂浓度的增加存在。空间激动剂浓度均匀日志规模大约每0.3 - 0.7日志_10个单位，覆盖的响应范围和定义的最大响应（五_最大 ）（见图3）。对于experim细胞株的经济需求，每个测量是一式三份。
4. 减去在每个浓度的激动剂存在测量基础响应。以这种方式绘制在图3中的反应进行了计算。

2。初步分析激动剂浓度反应曲线：没有构活动

1. 数据输入到数据表中的棱镜浓度反应实验（例如，图5）。所有的日志激动剂浓度下标有X的列输入激动剂，似乎最大的_电子最大值响应测量输入到A列，并为其他激动剂进入到相邻的字母列。进入一个给定的字母列分列复制一个浓度反应曲线的测量。
2. 选择图形表上的数据绘制和分析数据，非线性回归分析使用方程题为日志（激动剂）与响应 - 可变斜率（四个参数）。零约束“ 自下而上 ”的参数，并进行回归分析。复制“ 顶”（五_最大值 ），并登录到Excel电子表格用于计算初始参数估计_{欧共体50个}参数。 最大的电子_最大估计激动剂被指定为“标准的激动剂”，而其他激动剂指定为“试验激动剂”。
3. 计算的日志τK初步估计价值标准激动剂（日志EC _50'）的负对数EC _{50 OBS（LOGR1）。}
   
   计算初步估算为日志日志RA _我的每个测试激动剂值（LOGRA）{（前* ₅₀教统会“）/（顶'* EC _50）}，其中标准激动剂的参数是一个撇号表示。
   
   计算日志亲和力CON（LOGK2 - LOGK5）作为各自的_{EC 50}值的负对数常数测试激动剂。

3。激动剂RAI值使用非线性回归分析的估计：无构活动

1. 在棱镜输入到数据表的数据，描述在2.1以上。确保标准激动剂的数据在A列输入
2. 输入用户定义的公式，“日志RAI”，几行到棱镜案件共涉及五个激动剂所示：
   • <A> P = LOGK1
   • <A> Q = LOGR
   • <〜一个> Q = LOGR + LOGRA
   • <B> P = LOGK2
   • <C> P = LOGK3
   • <D> P = LOGK4
   • <E> P = LOGK5
   • 为Y = MSYS /（1 + {[（1 +10 ^（X + P））/（10 ^（X + Q））] ^ M}）
3. 输入初始参数估计如下：
   输入一个任意低的价值标准激动剂（LOGK1）的日志亲和常数为0。
   
   输入的初步估计LOGR和亲和常数（LOGK2 - LOGK5）和日志RAI值（LOGRA）测试激动剂。
   
   分配传感器的斜坡因子（M）值为1.0的初步估计。
   
   该系统的最大响应（MSYS）值相当于标准激动剂（前） _发送最大分配的初步估计。
4. 应用以下参数约束：LOGK1约束的常数，0; LOGR1，MSYS，共享所有数据集的价值M，LOGK2 - LOGK5和LOGRA，没有任何限制。
5. 启动非线性回归分析。结果产量日志K _OBS和日志天雨_我的测试激动剂值。如果标准激动剂是一个完整的激动剂的，那么日志_{K OB}和日志_{RA I}值是准确的。如果实际上是最有效的激动剂（标准激动剂）的部分激动剂，然后在 K _OBS值更有效的AGonists可能被高估。尽管如此， _我的日志RA的估计仍然在这种情况下，准确。
6. 如果不衔接的回归，实验者不妨阴谋的理论曲线的初始参数估计定义。如果有数据点和理论曲线之间的偏差较大，检查计算初始参数估计。如果有一个或多个激动剂发送_最大值相当于标准激动剂，它可能是必要的，以限制他们的_日志 K OBS为0值回归衔接的解决方案。

4。参展激动剂浓度反应曲线测量构受体细胞检测活动

1. 激动剂_K B值估计的M ^{- 1，}细胞在体外实验中使用的展览构受体活性的绝对单位。三方tive受体活性被定义为在应对上述利益受体的表达引起的基础水平的增加。
2. 选择激动剂和设计上面1.2节中所描述的那样的实验。
3. 对于每一个浓度反应曲线，测量激动剂在非转染细胞的情况下（基底回应），并与利益受体（基底响应+构响应）转染细胞的反应。测量中存在不同浓度的上述1.3节中所述的不同激动剂的响应。
4. 计算构受体活性和每个激动剂浓度测量响应减去在未转染细胞与受体的基底响应的反应。图6显示了以这种方式计算，一个信号通路表现出非常低的构活动的各种激动剂的反应。

5。初步的一个参展alysis激动剂浓度反应曲线构活动

1. 输入到一个数据表中的棱镜的数据（例如，图6）在3.1节所述，但还需要输入相应的字母列相应的日志激动剂浓度为-20构受体活性引起的反应。进入一个大的负对数近似零的激动剂浓度。
2. 分析如上所述，在2.2节，但按照“自下而上”参数的限制，以便它是“为所有的数据集共享的数据。”复制的“ 顶”（五_最大 ），共享“底部”，登录到一个Excel电子表格用于计算初始参数估计的EC50参数。
3. 计算初始参数估计如下：
   
   日志标准激动剂（LOGK1）或任何整，测试激动剂的亲和力常数必须确定在不同的实验， ^描述以前3
   计算日志的初步估计_K OBS价值的每个部分的测试激动剂日志{（Top' _TOP）/ 50（Top'底）（欧共体）}（即，只有在这种情况下LOGK2）， “底“表示构受体激活引起的反应。
   
   计算的初步估计为每个激动剂作为日志的日志_K B（LOGKb）{顶/（EC ₅₀底）}。
   
   计算初步估计作为日志的日志_{τSYS（LOGTsys）{/}底部（顶部的“ -底）}。

6。参展构受体的活性，使用非线性回归分析反应激动剂KB值的估计

1. 在棱镜输入到数据表的数据，描述在3.1以上
2. 输入用户定义的方程，“登录KB”，几行到棱镜两个激动剂条件所示：
   • <A> LOGKOBS = LOGK1
   • <B> LOGKOBS = LOGK2
   • =（10 ^（X + LOGKOBS））1
   • B = 10 ^（X + LOGTSYS + LOGKB）
   • C =（10 ^（LOGTSYS））
   • 为Y = MSYS / {1 + [（A /（B + C））^ M]}
3. 输入初始参数估计如下：
   
   输入每个激动剂的亲和常数（LOGK1 - 进入下步骤5.3中确定的值）。
   
   输入的 K _OBS估计每个测试激动剂。
   
   输入激动剂KB估计。
   
   输入日志_{τSYS（LOGTsys）}估计。
   
   分配的传感器斜率因子（M）和系统的最大响应（MSYS）值1.0和顶部的“（五标准激动剂_最大 ），分别。
4. 应用以下参数限制：LOGTsys，MSYS，共享所有数据集的价值M，LOGK2和LOGKb，没有任何限制。
5. 启动非线性回归分析。结果产量_K B的标准激动剂的日志，该日志_K OBS _K B部分激动剂，价值观和响应系统（MSYS），τ _系统自由受体复合物的价值（LOGTsys），和传感器斜率因子的运作模式（M）最大。
6. 如果不衔接的回归，按照上述点3.6下的步骤。

7。代表性的成果

图5显示了一些我们以前发布的数据毒蕈碱激动剂诱导中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达的M ₃受体¹²的磷酸水解。在这个实验中选定的毒蕈碱激动剂的浓度反应曲线测定。如上所述根据第3条估计每个激动剂_K B值，表示相对oxotremorine - M的数据进行分析。这些日志RA _我估计，卡巴，-0.56 ± 0.063; areco线，-0.60 ± 0.074;毛果芸香碱，-1.20 ± 0.15; MCN - A - 343，-1.92 ± 0.31。理论曲线代表最小二乘回归方程的数据（3.2节）。该系统的最大响应_（M系统）和传感器的斜率因子（M）的相应概算分别为53.9 ± 1.3和1.15 ± 0.09，分别。日志K _OBS激动剂值oxotremorine - M的除外，卡巴，5.19 ± 0.14;槟榔碱，5.49 ± 0.12;毛果芸香碱，5.58 ± 0.16和MCN - A - 343，5.27 ± 0.33 。

图6显示了毒蕈碱激动剂刺激的HEK 293细胞稳定表达摹^_α153磷酸肌醇水解实验的结果。瞬时表达的M ₃受体引起基础肌醇水解，这是由于构受体活性增加性。估计日志_K B oxotremorine - M和MCN - A - 343的值，根据第6条所述的数据进行了分析。分析产生oxotremorine - M和MCN - A - 343的日志_{K b}值8.30 ± 0.59和6.59 ± 0.77，分别。理论曲线代表数据的回归方程最小二乘（见6.2节）。日志τ _系统 ，男_SYS和 M估计分别为-2.29 ± 0.59，95.8 ± 2.8和0.72 ± 0.08，分别。估计的 K _OBS MCN - A - 343的价值为5.35 ± 0.46 。

图1单一受体的活性和激活受体人口的平均水平之间的关系。单一受体的活动，一个单一的受体发生transitio的理论行为。NS之间有效（ON）和无效（关）激动剂存在的状态显示。激动剂为有效和无效状态的亲和常数_K B和K _一表示， 人口的行为 ，理论的几个受体激动剂存在有效和无效状态之间发生随机转换行为是显示人口显示， 平均人口在一个特定的激动剂浓度存在的受体激活受体的平均水平。激活受体的人口水平，被称为刺激。

图2受体激活功能和疗效（ε）和观察到的亲和常数_（K OBS） 激动剂。人口平均之间的关系，平均水平。增加激动剂浓度显示。受体激活引起受体激活受体激活的平均水平是绘制激动剂的激动剂日志浓度。激动剂半最大受体激活所需的负对数浓度相当于日志观察激动剂（ 日志_{K OBS）}的亲和常数。最大的受体激活功能疗效（ε）表示。

图^3。[3]在中国仓鼠卵巢细胞表达人类_的 M 3受体的各种毒蕈碱激动剂inositolphosphate积累的刺激浓度反应曲线的例子。共有九个激动剂浓度反应曲线进行了测量。实验可以分为两部分。对于每一个部分，标准激动剂（oxotremorinEM）总是额外激动剂一起测试。因此，两种类型的实验显示在 A 和 B都需要测量9激动剂浓度反应曲线，如果只有五激动剂可一次检测。数据Ehlert 等^12。

图4。各种毒蕈碱激动剂刺激^[3] inositolphosphate积累的HEK 293细胞中表达人类的M ₂受体和_Gα15浓度反应曲线的例子。对M ₂受体表达造成了30 - ^35％[3] inositolphosphate响应，这是由于构受体活性。数据Ehlert 等^12。

图5。 人类的M 3受体。显示选定的毒蕈碱激动剂刺激磷酸肌醇水解的浓度反应曲线。从三个实验的平均值±扫描电镜显示。数据Ehlert 等^12。

图6。Oxotremorine - M和MCN - A - 343 -介导的_表达摹α15 _的 M 3受体的HEK 293细胞磷酸肌醇水解。磷酸肌醇水解表示相对于发送 oxotremorine - M _的最大。激动剂的情况下，肌醇水解占约2％的响应的M ₃受体的表达。三个实验± SEM手段。在DATA Ehlert 等^3。

Discussion

由于我们估计RA _​​I（相对_K B值）的方法只需要激动剂浓度反应曲线的测量，我们的分析可以做到随时测量这些曲线。

如果一天的到，每天的实验准备工作（例如，细胞或组织）的反应中的变化是大的，每个浓度-反应曲线的响应测量可以被归的“热门”的标准激动剂估计为每一天的实验。 顶部和日志欧共体₅₀的估计，预计在第2和第第5条所述的回归分析的标准激动剂为每个复制的浓度反应曲线。激动剂浓度-反应曲线在某一天的所有响应值进行归一相对的标准激动剂当天估计。如以上beginn所述，这些规范化的数据，然后分析ING在第3节。

估计_K B的准确性取决于构受体活性的准确估计。在我们的例子中，转染HEK 293细胞中的M ₃受体引起肌醇水解的增加，从约500不等- 1000 ^[3]在锂在细胞中存在测量inositolphosphates CPM预先标记[3H]肌醇。最大响应卡巴约50000 - 60000 CPM。如果本构响应大少的变量，我们oxotremorine - M和MCN - A - ₃₄₃ K B值估计会更准确。 _K B的估计还取决于传感器的斜率因子（M）在运作模式有一个准确的估计。因此，更准确，已达到激动剂浓度更密切的间隔根据1.3节的建议。 Runni吴额外激动剂，在实验中，也大大增加的M估计的准确性_，因此 ， K B。

如果有不同的受体，通过不同的耦合蛋白（例如，G蛋白）的信号，那么我们的分析方法提供了一个准确的_估计激动剂K B _和 ^RA，我值3,6每个效应的途径。如果超过一个活跃的状态，有助于单一测量响应，那么我们估计_{RA ​​我和} K B的方法代表了不同的活动状态，取决于它们的相对^丰度和活动3的加权平均。

构受体的活性，可诱导表达GPCR和其互补G ^蛋白 13以上。这可能会改变所观察到的亲和力和激动剂受体复合物的疗效，并可能导致非physiological信号。但响应的性质的变化和所观察到的的亲和力和受体人口的疗效并不意味着在受体的基本量子状态的变化，只有改变他们的人数和异构的概率。因此，G蛋白，与其说是作为一个窗口效应选择性受体到不同的国家药物效果的决定因素。如果我们的分析方法是适用于特定的G蛋白偶联受体信号检测，涉及一个单一的效应（例如，G蛋白），它应该是可以_{测量激动剂} K b值效应的受体选择性国-激动剂偏见的最终衡量标准。