Quantifier l'activité agoniste à G récepteurs couplés aux protéines

Summary

Une méthode d'estimation de la constante d'affinité d'un agoniste de l'état actif (

Abstract

Quand un agoniste active une population de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), il provoque une voie de signalisation qui aboutit à la réponse de la cellule ou de tissu. Ce processus peut être analysé au niveau d'un récepteur unique, une population de récepteurs, ou une réponse en aval. Nous décrivons ici comment analyser la réponse en aval pour obtenir une estimation de l'affinité agoniste constante de l'état actif des récepteurs simples.

Récepteurs comportent comme des interrupteurs quantiques qui alternent entre les états actifs et inactifs (figure 1). L'état actif interagit avec les protéines G spécifiques ou d'autres partenaires de signalisation. En l'absence de ligands, l'état inactif prédomine. La liaison de l'agoniste augmente la probabilité que le récepteur va passer en l'état actif car sa constante d'affinité pour l'état actif (K _b) est beaucoup plus grande que pour l'état inactif _(K). La sommation dessorties aléatoires de l'ensemble des récepteurs de la population donne un niveau constant de l'activation du récepteur dans le temps. L'inverse de la concentration d'agoniste provoquant l'activation du récepteur demi-maximale est équivalente à la constante d'affinité observée _(Kobs), et la fraction d'un agoniste des récepteurs complexes à l'état actif est défini comme l'efficacité (ε) (figure 2).

Méthodes pour l'analyse des réponses en aval de RCPG ont été développés qui permettent l'estimation de la _Kobs et l'efficacité relative d'un agoniste ^1,2. Dans ce rapport, nous montrons comment modifier cette analyse pour estimer l'agoniste K _b valeur par rapport à celle d'un autre agoniste. Pour les essais qui présentent une activité constitutive, nous montrons comment estimer K _b en unités absolues de M ^-1.

Notre méthode d'analyse agoniste courbes concentration-réponse consiste ^3,4de régression non linéaire globale en utilisant le modèle opérationnel ^5. Nous décrivons une procédure utilisant le logiciel d'application, Prism (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). L'analyse donne une estimation du produit de _Kobs et un paramètre proportionnel à l'efficacité (τ). L'estimation de τK _obs d'un agoniste, divisé par celui d'une autre, est une mesure relative de K _b (AR _I) ^6. Pour tout récepteur présentant une activité constitutive, il est possible d'estimer un paramètre proportionnel à l'efficacité du complexe récepteur libre (τ _sys). Dans ce cas, la valeur de K _b d'un agoniste est équivalent à τK _obs / τ _système ^3.

Notre méthode est utile pour déterminer la sélectivité d'un agoniste des récepteurs de sous-types et pour quantifier agoniste des récepteurs de signalisation par les protéines G différentes.

Protocol

1. Mesure de l'agoniste de courbes concentration-réponse: aucune activité constitutive

1. Pour l'estimation des valeurs relatives agoniste _b K (AR _I), une série d'au moins deux agonistes courbes concentration-réponse est nécessaire. Tout test in vitro pour la réponse fonctionnelle d'un RCPG peut être mesuré à condition que la concentration d'agoniste peut être contrôlé et un seul type de récepteur médie la réponse. Convient dosages cellulaires comprennent la mesure de l'AMPc ^4,7 et ^8,9 accumulation inositolphosphate dans une lignée cellulaire exprimant un récepteur recombinant. Exemples de dosages tissu entier comprennent la mesure de la contraction des muscles lisses de ¹⁰ ou récepteur M ₂ muscariniques et β _{1-adrénergiques} médiée par des changements dans la contraction du rat des champs stimulée par l'oreillette gauche ^11.
2. Choisissez une série d'agonistes des fins d'analyse, y compris un agoniste hautement efficace(Par exemple, ligand endogène). Dans une expérience donnée, mesure complète courbes concentration-réponse pour chaque agoniste. Si le nombre d'agonistes est trop grand pour compléter le test en une seule expérience, diviser les agonistes en sous-groupes, chacun composé d'un nombre gérable d'agonistes pour une expérience unique. Pour chaque sous-groupe, de mesurer la courbe de concentration-réponse de l'agoniste hautement efficace avec ceux des agonistes autre dans le sous-groupe (voir Figure 3). Répétez l'expérience pour chaque sous-groupe 3 - 6 fois, environ, en fonction de la variabilité des données.
3. Pour chaque courbe concentration-réponse, de mesurer la réponse en l'absence d'agoniste (réponse basale), et en présence de concentrations croissantes d'agoniste. Espace des concentrations agoniste uniformément sur ​​une échelle logarithmique environ tous les 0,3 à 0,7 log ₁₀ unités, couvrant l'éventail des réponses et la définition de la réponse maximale (E _max) (voir figure 3). Pour expériments sur des lignées cellulaires, chaque mesure est réalisée en trois exemplaires.
4. Soustraire la réponse basale de celle mesurée en présence de chaque concentration d'agoniste. Les réponses tracées à la figure 3 ont été calculées de cette manière.

2. L'analyse préliminaire d'un agoniste de courbes concentration-réponse: aucune activité constitutive

1. Entrez les données des expériences de concentration-réponse (par exemple, la Figure 5) dans un tableau de données dans le prisme. Toutes les concentrations agoniste journaux sont entrés dans la colonne intitulée X. Les mesures de réponse pour l'agoniste qui semble avoir la plus grande valeur E _max sont entrés dans la colonne A, et ceux pour l'agoniste d'autres sont entrés dans les colonnes adjacentes lettré. Des mesures répétées d'une courbe dose-réponse sont entrés en sous-colonnes d'une colonne donnée lettré.
2. Sélectionnez la feuille de graphique sur lequel les données sont tracées, et analyser les données par analyse de régression non linéaire à l'aidel'équation de droit, log (agoniste) vs réponse - pente variable (quatre paramètres). Contraindre le "fond" paramètre à zéro, et d'effectuer l'analyse de régression. Copiez le «Top» (E _max) et le journal CE ₅₀ paramètres dans un tableur Excel pour une utilisation dans le calcul des estimations des paramètres initiaux. L'agoniste avec l'estimation de _max le plus grand E est désigné comme le «agoniste standard», alors que les autres agonistes sont désignés comme «agonistes de test".
3. Calculer l'estimation initiale de log τK _obs (LOGR1) que la CE ₅₀ log négatif de valeur de l'agoniste de la norme (-log EC ₅₀ ').
   
   Calculer l'estimation initiale de l'AR log _i valeur de chaque agoniste d'essai (LOGRA) tel que log {(* Haut CE ₅₀ ') / (Top' * CE _50)}, dans lequel les paramètres de l'agoniste de la norme sont notés avec une apostrophe .
   
   Calculer le journal affinité conStants des agonistes de test (LOGK2 - LOGK5) comme le logarithme négatif de leurs valeurs de CE _50.

3. Estimation des valeurs RAi agoniste en utilisant une analyse de régression non linéaire: aucune activité constitutive

1. Entrez les données dans une table de données dans Prism comme décrit ci-dessus sous 2.1. Assurez-vous que les données de l'agoniste standard sont entrés dans la colonne A.
2. Entrez un définis par l'utilisateur équation ", journal de RAI", dans Prisme sur plusieurs lignes, comme indiqué pour les cas impliquant un total de cinq agonistes:
   • <A> P = LOGK1
   • <A> Q = logR
   • <~ A> Q = logR + LOGRA
   • <B> P = LOGK2
   • <C> P = LOGK3
   • <D> P = LOGK4
   • <E> P = LOGK5
   • Y = Msys / (1 + {[(1 ^ 10 (X + P)) / (10 ^ (X + Q))] ^ M})
3. Entrez les estimations initiales des paramètres comme suit:
   Entrez une valeur arbitrairement faible de 0 pour la constante d'affinité log (LOGK1) de l'agoniste de la norme.
   
   Entrez l'estimation initiale deLogR et les constantes d'affinité (LOGK2 - LOGK5) et des valeurs de log (RAI LOGRA) des agonistes de test.
   
   Attribuer à l'estimation initiale du facteur de pente transducteur (M) d'une valeur de 1,0.
   
   Attribuer à l'estimation initiale de la réponse maximale du système (Msys) d'une valeur équivalente à l'E _max de l'agoniste standard (Haut).
4. Appliquer les contraintes de paramètres suivants: LOGK1 contraint à la constante, 0; LOGR1, Msys et M, une valeur partagée pour tous les ensembles de données; LOGK2 - LOGK5 et LOGRA, sans contraintes.
5. Initier une analyse de régression non linéaire. Les résultats de rendement du log K _obs et log ra _i les valeurs des agonistes de test. Si l'agoniste standard est un agoniste complet, puis les deux log K _obs et le journal RA valeurs _i sont exacts. Si l'agoniste le plus efficace (agoniste standard) est en réalité un agoniste partiel, alors le _Kobs valeurs de la plus efficace agnistes peuvent être surestimés. Néanmoins, les estimations du journal de la Région _I sont toujours exacts dans cette situation.
6. Si la régression ne converge pas, l'expérimentateur peut souhaiter tracer la courbe théorique défini par les estimations initiales des paramètres. S'il ya des écarts importants entre les points de données et les courbes théoriques, vérifier le calcul des estimations des paramètres initiaux. Si un ou plusieurs agonistes E _max des valeurs équivalentes à celle de l'agoniste de la norme, il peut être nécessaire de limiter leur log K _obs valeurs à 0 pour la régression à converger vers une solution.

4. Mesure de l'agoniste de courbes concentration-réponse dans les dosages cellulaires présentant une activité constitutive du récepteur

1. Pour l'estimation des valeurs agoniste _b K en unités absolues de M ^-1, basé sur des cellules in vitro sont utilisées que l'activité des récepteurs présentent constitutive. Constitutionl'activité des récepteurs tive est défini comme l'augmentation de la réponse au-dessus du niveau basal causés par l'expression du récepteur de l'intérêt.
2. Choisissez agonistes et la conception de l'expérience telle que décrite précédemment dans la section 1.2.
3. Pour chaque courbe concentration-réponse, de mesurer la réponse en l'absence d'agoniste de cellules non transfectées (réponse basale) et dans les cellules transfectées avec le récepteur d'intérêt (réponse basale + réponse constitutive). Mesure de la réponse à la présence de différentes concentrations des agonistes différents comme décrit plus haut dans la section 1.3.
4. Calculer l'activité du récepteur constitutif et la réponse à chaque concentration d'agoniste de la réponse mesurée moins la réponse basale dans les cellules non transfectées avec le récepteur. La figure 6 montre les réponses aux divers agonistes calculé de cette manière pour une voie de signalisation montrant très faible activité constitutive.

5. Préliminaires unealysis d'agoniste courbes concentration-réponse présentant une activité constitutive

1. Entrez les données (par exemple, la Figure 6) dans un tableau de données dans le prisme comme décrit dans la section 3.1, mais aussi saisir la réponse provoquée par l'activité des récepteurs constitutive dans les colonnes appropriées lettres correspondant à une concentration agoniste journal de -20. Une grande logarithme négatif est entré à rapprocher une concentration d'agoniste de zéro.
2. Analyser les données comme décrit ci-dessus à la section 2.2, mais avec le "fond" de paramètres limités de sorte qu'il est «commun à tous les ensembles de données." Copiez le «Top» (E _max), partagé "Bas" et le journal CE50 paramètres dans un tableur Excel pour une utilisation dans le calcul des estimations des paramètres initiaux.
3. Calculer les estimations des paramètres initiaux comme suit:
   
   L'affinité log constante de l'agoniste standard (LOGK1) ou tout autre agoniste de test complet, doit être déterminée dans des expériences séparées, comme décrit précédemment ³
   Calculer l'estimation initiale du journal _Kobs valeur de chaque agoniste partielle de test (c'est à dire, seulement LOGK2 dans ce cas) que log {(Top'-Haut) / (CE ₅₀ (Top'-Bas))}, dans lequel «Bottom »désigne la réponse provoquée par l'activation du récepteur constitutive.
   
   Calculer l'estimation initiale de log K _b (LOGKb) pour chaque agoniste tel que log {Haut / (CE ₅₀ Bas)}.
   
   Calculer l'estimation initiale de log τ _sys (LOGTsys) tel que log {Bas / ('Haut - Bas)}.

6. Estimation des valeurs Kb agoniste des réponses présentant une activité constitutive du récepteur en utilisant une analyse de régression non linéaire

1. Entrez les données dans une table de données dans Prism comme décrit ci-dessus sous 3.1
2. Entrez un définis par l'utilisateur équation, "Log Ko", en Prism sur plusieurs lignes, comme indiqué à la condition de deux agonistes:
   • <A> LOGKOBS = LOGK1
   • <B> LOGKOBS = LOGK2
   • A = (10 ^ (X + LOGKOBS)) 1
   • B = 10 ^ (X + + LOGTSYS LOGKB)
   • C = (10 ^ (LOGTSYS))
   • Y = Msys / {1 + [(A / (B + C)) ^ M]}
3. Entrez les estimations initiales des paramètres comme suit:
   
   Entrez les constantes d'affinité de chaque agoniste (LOGK1 - saisissez une valeur déterminée à l'étape 5.3).
   
   Entrez le _Kobs estimations de chaque agoniste de test.
   
   Entrez les estimations Kb des agonistes.
   
   Entrez log τ _sys (LOGTsys) estimer.
   
   Attribuer le facteur de pente transducteur (M) et la réponse maximale du système (Msys) des valeurs de 1,0 et 'Top (E _max de l'agoniste de la norme), respectivement.
4. Appliquer les contraintes de paramètres suivants: LOGTsys, Msys et M, une valeur partagée pour tous les ensembles de données; LOGK2 et LOGKb, sans contraintes.
5. Initier une analyse de régression non linéaire. Les résultats de rendement du log K _b de l'agoniste de la norme, le log K _obs K _b d'agonistes partiels, et la réponse maximale du système (Msys), la valeur τ _sys pour le complexe récepteur libre (LOGTsys), et le facteur de pente du transducteur dans le modèle opérationnel (M).
6. Si la régression ne converge pas, suivez les étapes décrites ci-dessus au point 3.6.

7. Les résultats représentatifs

La figure 5 montre certaines de nos données déjà publiées sur l'hydrolyse des phosphoinositides induite par les agonistes muscariniques dans les cellules ovariennes de hamster chinois exprimant de façon stable le récepteur muscarinique M ₃ ^12. Les courbes concentration-réponse de certains agonistes muscariniques ont été mesurés dans cet essai. Les données ont été analysées comme décrit ci-dessus sous la section 3 pour estimer la valeur de K _b de chaque agoniste, exprimée par rapport à celle de oxotrémorine-M. Ces estimations log PR _i sont, carbachol, -0,56 ± 0,063; Arecoligne, -0,60 ± 0,074; pilocarpine, -1,20 ± 0,15, et McN-A-343, -1,92 ± 0,31. Les courbes théoriques représentent l'ajustement des moindres carrés de l'équation de régression pour les données (section 3.2). Les estimations correspondantes de la réponse maximale du système (M _sys) et le facteur de pente transducteur (M) ont été 53,9 ± 1,3 et 1,15 ± 0,09, respectivement. Le journal des valeurs de _l'obs agonistes, sauf que d'oxotrémorine-M ont été K, carbachol, 5,19 ± 0,14; arécoline, 5,49 ± 0,12; pilocarpine, 5,58 ± 0,16 et McN-A-343, 5,27 ± 0,33.

La figure 6 montre les résultats d'expériences sur l'hydrolyse phosphoinositide muscariniques agonistes-stimulés dans des cellules HEK 293 exprimant de façon stable G _α15 ^3. L'expression transitoire de la M ₃ récepteurs muscariniques provoqué une augmentation de l'hydrolyse du phosphoinositide basale, qui a été attribué à un récepteur constitutive activIty. Les données ont été analysées pour estimer la valeur de log K _b de oxotrémorine-M et McN-A-343 tel que décrit dans la section 6. Cette analyse a permis de log K valeurs _b de 8,30 ± 0,59 et 6,59 ± 0,77 pour oxotrémorine-M et McN-A-343, respectivement. Les courbes théoriques représentent l'ajustement des moindres carrés de l'équation de régression pour les données (voir section 6.2). Les estimations de log τ _sys, M et M ont été _sys -2,29 ± 0,59, 95,8 ± 2,8 et 0,72 ± 0,08, respectivement. L'estimation de la valeur de _Kobs McN-A-343 était 5,35 ± 0,46.

Figure 1. Relation entre l'activité l'activité des récepteurs simples et le niveau moyen de l'activation des récepteurs de la population. Récepteur unique, le comportement théorique d'un seul récepteur subissant Transitions entre active (ON) et inactives (off) les Etats de la présence d'un agoniste est montré. Les constantes d'affinité de l'agoniste pour les états actifs et inactifs sont désignés par K _b et K _un, respectivement. Comportements de la population, le comportement théorique de plusieurs récepteurs subissant des transitions aléatoires entre les états actifs et inactifs dans la présence d'un agoniste est montré. Population moyenne, le niveau moyen de l'activation du récepteur dans une population de récepteurs dans la présence d'une concentration spécifique d'agoniste est montré. Le niveau d'activation du récepteur de la population est connu comme le stimulus.

Figure 2. Relation entre la fonction d'activation du récepteur et de l'efficacité (ε) et constante d'affinité observée _(Kobs) de la moyenne agoniste. Population, le niveau moyen del'activation du récepteur induite par l'augmentation des concentrations d'agoniste est montré. L'activation du récepteur, le niveau moyen de l'activation du récepteur est tracée agoniste de la concentration de l'agoniste de log. La concentration de l'agoniste de log négatif requis pour l'activation du récepteur demi-maximale est équivalente à l'affinité log observées constante de l'agoniste (log K _obs). Le maximum de la fonction d'activation du récepteur est noté que l'efficacité (ε).

Figure 3. Exemples de courbes concentration-réponse à la stimulation de ^[3 H] l'accumulation inositolphosphate par divers agonistes muscariniques dans ovariennes de hamster chinois exprimant l'humain M ₃ récepteurs muscariniques. Un total de neuf agoniste courbes concentration-réponse ont été mesurés. L'expérience peut être divisé en deux parties. Pour chaque partie, l'agoniste standard (oxotremorinEM) est toujours testée en collaboration avec des agonistes supplémentaires. Ainsi, deux expériences du type représenté en A et B sont nécessaires pour mesurer les courbes de concentration-réponse de neuf agonistes si seulement cinq agonistes peuvent être dosés à la fois. Les données sont tirées Ehlert et al. ^12.

Figure 4. Exemples de courbes concentration-réponse pour la stimulation de ^[3 H] l'accumulation inositolphosphate par divers agonistes muscariniques dans les cellules HEK 293 exprimant le récepteur humain muscariniques M ₂ et G _α15. Expression de le récepteur M ₂ a provoqué une 30 - 35% ^[3 H] La réponse inositolphosphate, qui a été attribuée à l'activité du récepteur constitutive. Les données sont tirées Ehlert et al. ^12.

Figure 5. 3 récepteurs muscariniques. Les courbes concentration-réponse de certains agonistes muscariniques pour l'hydrolyse de phosphoinositide stimulantes sont affichés. Les valeurs moyennes de trois expériences ± SEM sont indiquées. Les données sont tirées Ehlert et al. ^12.

Figure 6. Oxotrémorine-M-et de l'hydrolyse du phosphoinositide McN-A-343-médiatisée dans des cellules HEK 293 exprimant G _α15 et le récepteur muscarinique M _3. Hydrolyse phosphoinositide est exprimée par rapport au _maximum E de oxotrémorine-M. En l'absence d'agoniste, l'hydrolyse phosphoinositide attribué à l'expression de la M ₃ récepteurs représentaient environ 2% de la réponse. Les moyens des trois expériences ± SEM sont indiquées. Le dATA sont de Ehlert et al. ^3.

Discussion

Parce que notre méthode d'estimation de la Région _I (relatif K valeur _b) exige que la mesure de l'agoniste courbes concentration-réponse, notre analyse peut être faite n'importe quand ces courbes sont mesurées.

Si au jour le jour variation de la réponse de la préparation expérimentale (par exemple, des cellules ou tissus) est grande, les mesures de réponse de chaque courbe concentration-réponse peut être normalisée par rapport à la "Top" estimation de l'agoniste standard pour chaque journée expérience. Une estimation du Haut et log EC ₅₀ est estimée pour chaque répétition courbe concentration-réponse de l'agoniste de la norme par analyse de régression telle que décrite dans les sections 2 et 5. Les valeurs de réponse de l'ensemble de l'agoniste de courbes concentration-réponse à un jour donné sont normalisés par rapport à l'estimation de l'agoniste de Haut niveau pour cette journée. Ces données normalisées sont ensuite analysées comme décrit ci-dessus BeginnING à la section 3.

La précision de l'estimation de K _b dépend d'une estimation précise de l'activité du récepteur constitutive. Dans notre cas, la transfection de la M ₃ de récepteurs dans les cellules HEK 293 a provoqué une augmentation de l'hydrolyse du phosphoinositide qui variait d'environ 500 - 1000 cpm de ^[3 H] inositolphosphates mesurée en présence de lithium dans les cellules pré-étiquetés avec [3H] inositol . La réponse maximale à carbachol a été d'environ 50 000 - 60 000 cpm. Avait été la réponse constitutive grande et moins variable, notre estimation de la valeur _b K de la oxotrémorine-M et McN-A-343 aurait été plus précis. L'estimation de K _b dépend aussi d'avoir une estimation précise du facteur de pente transducteur (M) dans le modèle opérationnel. Par conséquent, une plus grande précision aurait pu être atteint que si les concentrations d'agoniste étaient plus rapprochées comme recommandé dans la section 1.3. Running agonistes supplémentaires dans l'expérience aussi augmente considérablement la précision de l'estimation de M, et donc, de K _b.

S'il ya différents états actif du récepteur que le signal par les protéines de couplage différents (par exemple, les protéines G), alors notre méthode d'analyse fournit une estimation précise de l'agoniste de K _b et RA _i les valeurs pour chaque voie effectrice ^3,6. Si plus d'un état ​​actif contribue à une seule réponse mesurée, alors notre méthode d'estimation de la Région _I et K _b représente une moyenne pondérée des différents états actifs en fonction de leur abondance relative et de l'activité ^3.

L'activité du récepteur constitutif peut être induite par de plus exprimer le RCPG et de sa protéine G complémentaires ^13. Cela pourrait changer l'affinité observée et l'efficacité du complexe agoniste-récepteur et peut causer la non-pde signalisation hysiological. Mais des changements dans la nature de la réponse et l'affinité et l'efficacité observée de la population des récepteurs n'impliquent pas de changements fondamentaux dans les Etats quantiques du récepteur, seul un changement dans leur nombre et leur probabilité d'isomérisation. Ainsi, les protéines G ne sont pas tant que déterminant des effets des médicaments tellement comme une fenêtre sur différents effecteurs sélectif du récepteur des États. Si notre méthode d'analyse est appliquée à des dosages spécifiques GPCR de signalisation impliquant un effecteur unique (par exemple, la protéine G), il devrait être possible de mesurer des valeurs agoniste K _b pour effecteur sélectif du récepteur des États - la mesure ultime de la partialité agoniste.