Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

Summary

A ohne Linsen auskommt, On-Chip-Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattform wird gezeigt, dass kann image fluoreszierende Objekte über einen ultra-wide field-of-view von z. B.> 0,6-8 cm2 mit <4 &mgr; m Auflösung mit einem Druck-Sampling-Basis Decodieralgorithmus. Eine solche kompakte und wide-field fluoreszierenden On-Chip-Bildgebungsverfahren könnte wertvoll für High-Throughput-Zytometrie, seltene Zellen Forschungs-und Microarray-Analyse.

Abstract

On-Chip-Linsen auskommt Bildgebung in der allgemeinen Ziele zu sperrig Objektiv-basierten optischen Mikroskopen mit einfacheren und kompakteren Bauformen zu ersetzen, insbesondere für das Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen. Diese neue Technologie-Plattform hat das Potenzial, die Notwendigkeit für sperrige und / oder teure optische Komponenten durch die Hilfe von neuartigen Theorien und digitale Rekonstruktion Algorithmen eliminieren. In die gleiche Richtung, hier zeigen wir eine On-Chip Fluoreszenzmikroskopie Modalität, zB <4 &mgr; m räumliche Auflösung über einen ultra-wide field-of-view (FOV) von> 0,6-8 cm ² erreichen können, ohne die Verwendung von Objektiven , mechanisch-Scan-oder Dünnschicht-basierte Interferenzfilter. In dieser Technik wird Fluoreszenzanregung durch ein Prisma oder halbkugelförmige-Glas-Grenzfläche durch einen inkohärenten Quelle beleuchtet erreicht. Nach der Interaktion mit dem gesamten Objekt Volumen, das ist Anregungslicht von total-interne Reflexion (TIR) ​​Prozess, der an der Unterseite der Probe mikrofluidischen Chip auftretende wird abgelehnt. Die Fluoreszenzemission aus dem angeregten Objekte wird dann durch eine faseroptische Faceplate oder ein Kegel gesammelt und zu einem optoelektronischen Sensor-Array wie eine Charge-Coupled-Device (CCD) geliefert. Durch die Verwendung eines Druck-sampling basiert Decodieralgorithmus, die erworbenen lensfree raw fluoreszierende Bilder der Probe kann schnell verarbeitet werden, um z. B. Ertrag, <4 &mgr; m Auflösung über einen FOV von> 0,6-8 cm ^2. Darüber hinaus vertikal gestapelt Mikro-Kanäle, die durch z. B. getrennt sind, können 50-100 um auch erfolgreich abgebildet werden mit der gleichen lensfree On-Chip-Mikroskopie-Plattform, die weitere Erhöhungen der Gesamtdurchsatz dieser Modalität. Dieses kompakte On-Chip-Fluoreszenz-Imaging-Plattform, mit einem schnellen Druck-Decoder dahinter, könnte eher wertvoll für High-Throughput-Zytometrie, seltene Zellen Forschungs-und Microarray-Analyse.

Protocol

In diesem Abschnitt werden wir die experimentellen Methoden der ohne Linsen auskommt, On-Chip-Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattform ^1-4. Zur Demonstration der Leistungsfähigkeit dieser Technik werden wir On-Chip-Bildgebung für fluoreszierende Mikro-Partikel und beschriftet weißen Blutkörperchen zu zeigen. Obwohl hier nicht diskutiert werden, kann die gleiche lensfree Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattform auch image kleines Modell Tiere wie transgenen C eingesetzt werden elegans Proben ^3.

1. Design der Linsen auskommt On-Chip-Imaging-Plattform

Unsere Linsen auskommt On-Chip-Imaging-Plattform besteht aus mehreren optischen Komponenten einschließlich einer digitalen Sensor-Array (zB ein CCD-Chip), eine inkohärente Lichtquelle, ein Prisma, ein Absorptionsfilter, ein Glasfaser-Faceplate oder ein Glasfaser-Konus. Wie in Abb. 1 dargestellt, sind diese Komponenten mit Mikro-Fluidik-Einrichtungen zusammen, um Fluoreszenz-Imaging von einem großen Probenvolumen auf einem Chip zu erreichen, ohne die Verwendung von Linsen, mechanische Scanner oder Dünnschicht-basierte Interferenzfilter.

1. Digital Sensor Array: Unsere Linsen auskommt Bildgebung Konfiguration nutzt einen optoelektronischen Sensor-Array mit dem Fluoreszenzemission von Ziel-Mikro-Objekte aufnehmen. In dieser Plattform für die Detektion des Fluoreszenzsignals, können verschiedene Arten von Sensor-Arrays eingesetzt werden, wie CCDs (zB Modelle: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, die alle aus KODAK) und komplementäre Metall-Oxid- -Halbleiter-Bildsensoren (CMOS, z. B., Model: MT9T031C12STCD von Micron Technologies). Wichtige Parameter von Interesse für diese Sensor-Arrays sind die Pixel-Größe (zB, 5,4 um, 9 um, 6,8 um und 3,2 um für KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 und MT9T031C12STCD bezeichnet) und die aktive Bildfläche ( z. B. 2,4 cm ^2, 8 cm ^2, 18 cm ² und 32 mm ² für KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000 und MT9T031C12STCD jeweils). Für lensfree On-Chip-Bildgebung können CCD-Sensoren im allgemeinen bevorzugt um einen höheren Durchsatz (breiter aktive Fläche) und eine höhere Sensitivität erreicht werden, während CMOS-Sensoren für relativ billiger und leichter Konstruktionen bevorzugt werden können (z. B. für den Feldeinsatz).
2. Lichtquellen: In unserer Plattform, einer inkohärenten Lichtquelle, z. B. eine einfache Leuchtdiode (LED, z. B. aus Thorlabs, M455L2-C2 und LEDD1B), kann zur Fluoreszenzanregung verwendet werden. In der Versuchsanordnung in Abb.. 1 ist ein Multi-Mode-Glasfaserkabel (Thorlabs, BFH37-1000) mit 1 mm Kerngröße auf einer LED-Lichtquelle (ohne die Verwendung von Linsen oder Einkoppeloptik) und das Anregungslicht butt-gekoppelt wird dann an den gelieferten Probenvolumen durch die Austrittsöffnung dieser Faser. In diesem System sollte die erforderliche Leistung von Fluoreszenzanregung um ~ 0,2 bis 5 mW für ein FOV von> 2-8 cm ² bei der Ausfahrt der Beleuchtungsfaser werden, jedoch sollten die LEDs in der Lage sein Ausgang ~ 5mW-1W Leistungsstufen als butt-Kopplung Ansatz ist erheblich verlustbehaftet, die die Anregung Leistung nimmt am Ausgang der Faser. Um dies zu erreichen Anregung verschiedener Farbstoffe können verschiedene Farb-LEDs auch durch Verwendung eines LWL-Koppler gemultiplext werden.
   Neben On-Chip-Fluoreszenz-Bildgebung kann lensfree holographischen Übertragung Bilder von der gleichen Probe auch mit dieser Plattform durch die Verwendung eines vertikalen Lichtquelle wie in Abb. eingeholt werden. 2. Im Gegensatz zu den Fluoreszenz-Anregungs-Faser, für holographische Bildaufnahme, ist eine andere Glasfaserkabel mit einem kleineren Kerngröße (zB ~ 50-400 um) Kolben gekoppelt anderen LED-Lichtquelle (Mightex, FCS-0625 bis 000). Diese vertikale Beleuchtung Licht, nach dem Austritt aus der Faser-Ende, beginnt zu partiellen räumlichen Kohärenz zu erwerben, wie sie auf die Probe ausbreitet. Der Durchmesser dieses räumlich zusammenhängenden Bereich ist proportional zur Entfernung, die das Licht und ist umgekehrt proportional zu der Austrittsöffnung Größe der Faser. Solange diese räumliche Kohärenz Durchmesser an der Probenebene größer als die Beugung Größe jeder Probe bei der Sensor-Ebene ist, kann das gestreute Licht von jedem Objekt genau mit der Hintergrundbeleuchtung stören, wodurch ein lensfree in-line Hologramm der Probe. Diese erworbenen lensfree Hologramme können dann schnell verarbeitet mit iterativen Phase Erholung Ansätze zu einer Übertragung Hellfeld-Bild der Probe Volumen ^5-7 rekonstruieren. Aus diesem holographischen Beleuchtung Ende einer längeren Wellenlänge LED (dh ~ 625-700 nm) ausgewählt, da die Absorption Filter, mit denen das Anregungslicht Block sind High-Pass Filter mit typischen Cut-Off-Wellenlängen sind z. B., 500-600nm , die es erlaubt Übernahme der Übertragung in-line Hologramme von den Proben ohne ein Problem.
3. Andere optische Komponenten: In diesem On-Chip-Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattform, zwei verschiedene Anregungs-Filter-Methoden werden parallel verwendet werden, um die erforderliche Dunkelfeld-Hintergrund zu erstellen, wie in Abb. 2 dargestellt. Erstens, ein Glasprisma (zB EdmundOptics, rautenförmig oder Taube Prismen) oder ein Glas Hemisphäre wird verwendet, um Total-Internal Reflection (für das Anregungslicht) an der unteren Oberfläche des Mikro-Fluidik-Chip, der die Proben von Interesse Hosts erstellen. Parallel dazu ist eine kostengünstige Absorptionsfilter (zB von Roscolux) verwendet entfernen schwach gestreute Anregungslicht, dass nicht gehorcht, der TIR-Prozess. Nach erfolgreicher Ablehnung der Anregung mit diesen beiden Mechanismen ist nur der Fluoreszenzemission der Proben bei der Detektorebene erworben. Man beachte, dass ein bestimmter Anteil des emittierten Fluoreszenzsignals auch Erfahrungen TIR an die gleiche Schnittstelle. Dies ist jedoch nur begrenzt die Erkennung numerische Apertur dieses lensfree On-Chip-Imaging-Ansatz für ~ 1,0, so dass nur die schrägen Strahlen über eine so hohe Erkennung numerischer Apertur in der Mikro-Chip gefangen bleiben, während der Rest des fluoreszierenden Strahlen können noch traf die aktive Fläche des Sensors-Array, um durch seine Pixel abgetastet werden.
   Trotz einer so großen Erkennung numerischer Apertur, werden die Roh-fluoreszierenden Flecken auf dem Sensor-Array ziemlich breit (zB ~ 150-200 um) seit Fluoreszenzemission wird nicht gerichtet und daher schnell divergiert. Um Ingenieur und eine bessere Kontrolle der räumlichen Verbreitung dieser Fluoreszenz-Signal in unsere Plattform ohne Linsen auskommt, verwendeten wir einen planaren optischen Komponente, dh eine faseroptische Faceplate (zB Edmund Optics, NT55-142), die zwischen dem Objekt und dem platziert wird Sensor Ebenen. Ein Glasfaser-Faceplate ist aus einem 2D-Array von LWL-Kabeln, die optischen Intensität Information tragen von einer Seite des Gerätes zu den anderen zusammen. Seine Hauptfunktion in unserer lensfree On-Chip-Mikroskopie Set-up ist die Kopplung der Freiraum-Modi der Fluoreszenzemission aus dem Probenvolumen in Führung optischen Wellen Reisen ohne räumliche Verbreitung innerhalb der einzelnen Faser, die teilweise schmalen können Sie die lensfree fluoreszierenden Punkt -spread function (PSF) zwischen dem Objekt und dem Detektor Ebenen. Das erhöht unsere Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) als auch die räumliche Auflösung, die durch Verwendung unserer Plattform ohne Linsen auskommt, kann sein.
   Als Alternative zu einer regelmäßigen Frontplatte, können wir auch in unserem On-Chip-Imaging-Plattform nutzen eine "verjüngte" LWL-Frontplatte, die eine erheblich größere Dichte von Lichtwellenleitern auf der Spitze Facette hat im Vergleich zu den unten ein. Eine solche konische Blende nicht nur uns helfen, eine bessere PSF, sondern kann auch in Vergrößerung unserer Plattform einführen (z. B.> 2-3X), die weiter hilft uns, unsere Linsen auskommt Auflösung von bis zu verbessern, zB <4 um. Wir sollten auch beachten, dass das Feld-of-view von einer solchen konischen Design ist von mindestens dem Quadrat der Einführung Vergrößerungsfaktor, wenn eine regelmäßige Frontplatte basierten Imaging-System, das eine Reduktion von z. B. bilden können verglichen reduziert, von ca. 8 cm ² FOV zunächst (CCD: KAI-11002) bis ^<2 cm 2 mit der Verjüngung.
   Schließlich sollten wir auch beachten, dass die Verwendung eines Glasfaser-Faceplate oder eine Verjüngung der lensfree Hologramme der Probe aufgrund der unterschiedlichen optischen Moden des Glasfaser-Arrays ³ verzerrt. Während solche verzerrten lensfree Muster auf dem Detektorarray noch sein kann für bestimmte Zytometrie Verhältnis Anwendungen nützlich sein, zur holographischen Rekonstruktion der Übertragung Bilder, die LWL-Array (zB die Frontblende oder der Verjüngung) muss von der On-Chip-Montage entfernt werden auf Kosten der leicht reduzierten räumlichen Auflösung in der fluoreszierenden Modus ^3.
4. Micro-Fluidik-Chips: Die Mikro-Fluidik-Chips, die in unsere Plattform verwendet werden, sind hergestellt mit PDMS (Polydimethylsiloxan) Wände auf Glasplättchen Erstellung der Mikro-Kanäle, die für die On-Chip-Bildgebung erforderlich sind, gelegt. Zur Herstellung dieser Mikro-Fluidik-Kanäle verfolgen wir das folgende Rezept:
   1. PDMS A und B Elastomere sind gleichmäßig gemischt und gerührt, mit 1:10 Volumen-Verhältnis.
   2. Sobald diese heterogene Lösung in eine Petrischale gegossen wird, ist es bei 65 ° C für 2 Stunden ausgehärtet.
   3. Mit Hilfe eines X-Skalpell, ist die erforderliche Größe und Form des Mikro-Fluidik-Kanalwand aus der Petrischale entnommen.
   4. Das Gerät Bindung erfolgt dann mit Hilfe eines Hochfrequenz-Plasma-Generator (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), die sowohl das Deckglas Dias und PDMS Klebefläche freizulegen Bedürfnisse erreicht.
   5. Nach dieser Plasma-Behandlung wird das Gerät in einen Ofen für ~ 40-50 Minuten bei 70 ° C, um die Bindung zu stärken platziert.
5. Montage und Ausrichtung der Linsen auskommt On-Chip-Mikroskopie-Plattform:
   Das Montageverfahren für unsere lensfree On-Chip-Imaging-Plattform kann als detailliert sein:
   1. Deckglas der opto-elektronischen Sensor-Array entfernt wird.
   2. Mit Hilfe eines Vakuum-Pen (Edmund Optics, NT57-636), ist eine dünne Absorptionsfilter sanft auf der Oberseite des Detektors aktive Fläche platziert.
   3. Ein LWL-Frontplatte oder eine Verjüngung ist im oberen Teil der Absorption f positioniertilter.
   4. Die gefertigten Mikro-Fluidik-Chip wird dann direkt auf der Spitze der Glasfaser-Array platziert.
   5. Ein Glasprisma oder eine Halbkugel über dem Mikro-Fluidik-Chip mit einem Index-Matching-Öl (Cargille, Immersionsöl 300 Series), so dass der Brechungsindex der Oberfläche des Glases Brechungsindex abgestimmt ist montiert.
   6. Side Beleuchtungsfaser näher an das Prisma (oder die Hemi-Sphäre) und zog seinen Winkel wird angepasst, um sicherzustellen, dass Total-interne Reflexion tritt an der Glas-Luft-Grenzfläche entsprechend der Mikro-Fluidik-Chips Bodensubstrat. Die vertikale Beleuchtung (für lensfree Übertragung imaging) ist darauf ausgerichtet, senkrecht auf den Detektor-Array und ist zu einem gewünschten field-of-view zentriert.
   7. Side und vertikale Lichtquellen werden nacheinander ein / ausgeschaltet, um sowohl Fluoreszenz-Imaging und Hellfeld-Übertragung Bildgebung mit gleichen on-Chip-Plattform zu erreichen.
   8. Lensfree RAW-Bilder werden dann aufgenommen mit einem speziell entwickelten Labview-Schnittstelle durch einen PC (z. B. Prozessor mit 3,2 GHz, Intel Core).

2. Probenvorbereitung

Wir verwendeten fluoreszierenden Mikroperlen (zB Invitrogen, Fluospheres) an unsere Imaging-Plattform zu kalibrieren, durch die Messung ihrer lensfree System Point-Spread-Funktion (PSF). Nach dieser ersten PSF Messung erfolgt, können verschiedene Zellen oder kleine Modell Tieren (zB transgene C. elegans Proben) abgebildet mit der gleichen on-Chip-Plattform werden.

Beginnend mit dem nächsten Unterabschnitt, werden wir weitere Details unseres Probenvorbereitung.

1. Fluorescent Mikro-Perlen:
   1. Raw fluoreszierende Kügelchen Lösungen sind mit entionisiertem Wasser kombiniert werden, um die Konzentration der Proben zu optimieren.
   2. ~ 10 ul von fluoreszierenden Bead-Lösung wird mit 40 ul, 5 ml und 20 ml VE-Wasser für 10 pm, 4 m und 2 Mikrometer Durchmesser Perlen, bzw. gemischt. Heterogene Lösungen verschiedener Perlen (zB nicht-fluoreszierenden und fluoreszierenden) werden wie durch Mischen verschiedener Bead-Lösungen mit einander brauchten.
   3. Die endgültige Probe wird dann in der Mikro-Fluidik-Chip von der Seite PDMS Wände gespritzt mit einem scharfen Kanüle (Fisher Scientific, BD PrecisionGlide Needles, 14-826 Series)
2. Weiße Blutkörperchen Etikettierung:
   1. Ein Volumen von ~ 100 ul Vollblut ist mit ~ 1 mL der roten Blutkörperchen Lysepuffer (eBioscience) gemischt.
   2. Nach einer Inkubationszeit von ca. 3 min, die lysierte Blut-Lösung wird zentrifugiert und das Pellet-Schicht ist in ca. 200 ul PBS resuspendiert (Phosphat-gepufferte Salzlösung).
   3. Um die Beschriftung der Nukleinsäure der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen, 5 ul von 1 mM SYTO 16 auf die 200 ul der Resuspension zugegeben, wonach die Probe für ~ 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert.
   4. Zweite Zentrifugieren ist es, diese markierten Probe angewendet, wo der Überstand entfernt ist, die Geräuschkulisse durch Fluoreszenzemission von ungebundenen Farbstoffe zu verringern.
   5. Weiße Blutkörperchen Pellet-Schicht wird in PBS, die dann zu einem mikrofluidischen Chip für lensfree On-Chip-Fluoreszenz-Imaging übertragen werden können (siehe zB Abbildung 7) resuspendiert.

3. Digitale Verarbeitung der erfassten ohne Linsen auskommt, Fluoreszenzbilder

In diesem ohne Linsen auskommt, Imaging-Plattform sind zwei verschiedene Algorithmen verwendet werden, um digital Erhöhung der Auflösung des Systems, nämlich die Lucy-Richardson Dekonvolution und Druckfestigkeit Basis von Stichproben-Decodierung. Durch den Einsatz dieser digitalen Verarbeitungsmethoden haben wir die Verbesserung der Auflösung, die mit jedem Ansatz der Lösung dicht bead-Paaren erreicht werden kann (s. Abbn. 5-6) quantifiziert. Das rekonstruierte lensfree fluoreszierende Bilder können dann pseudocolored (falls gewünscht) werden, um die natürliche Farbe des Mikro-Objekte, die sicherlich erfordert Vorkenntnisse des Fluoreszenzsignals Wellenlänge Highlight, es sei denn, eine Farbe (z. B. ein RGB: Rot-Grün-Blau-CCD- / CMOS)-Sensor-Chip verwendet wird. Für diese digitale Verarbeitung Methoden sind speziell entwickelte Algorithmen verwendet, die nur eine CPU (zB ein 3,2 GHz Prozessor, Intel Core). Potenziell könnte der nächsten Generation Graphics Processing Units (GPUs) auch für eine schnellere Verarbeitung verwendet werden. Neben Bildgebung, wenn nötig, können die decodierten fluoreszierende Objekte ebenfalls automatisch gezählt werden mittels eines speziell entwickelten Schnittstelle (siehe Abb.. 8) für On-Chip-Zytometrie Anwendungen.

1. Die Messung der System Point-Spread Function (PSF):
   Vor einer digitalen Verarbeitung für die Auflösung verbessert (wie Dekonvolution oder Druck-Decodierung), muss die inkohärente Point-Spread Funktion der On-Chip-System zu schätzen, die durch Mittelung mehrerer gemessen lensfree Fluoreszenzmuster von isolierten kleinen fluoreszierenden erstellt erreicht werden Perlen in einer bestimmten Höhe von der Sensor-Chip befindet. Dieseeinzelnen fluoreszierenden Muster werden dann hinsichtlich ihrer Mitte der Masse Koordinaten nach entsprechender Intensität Normalisierung ^1,2 gemittelt werden ausgerichtet. Dieses gemittelte lensfree Muster kann dann als fluoreszierende Point-Spread Funktion unserer On-Chip-Mikroskop eingesetzt werden.
2. Lucy-Richardson Dekonvolution ^1: Um digital zur Verbesserung der räumlichen Auflösung unserer Plattform, füttern wir die Rohstoffe erworben Fluoreszenzbild und dem gemessenen inkohärent Point-Spread-Funktion in einem beschleunigten Lucy-Richardson-Algorithmus ^8-10. Durch die Anwendung der Bayes-Theorem, verwendet das Lucy-Richardson-Algorithmus die gemessenen Point-Spread-Funktion, um iterativ zu verfeinern das Maximum-Likelihood-Schätzung der Fluoreszenz Source-Distribution auf der Objektebene ^8,9. Die Iteration wird in der Regel nach ein paar hundert Zyklen vor der Entstehung der rauscharme Verstärkung beendet werden, um minimale quadratische Fehler zwischen dem prognostizierten und dem gemessenen lensfree Fluoreszenzmuster zu gewährleisten. Die Konvergenz dieser Dekonvolution Algorithmus wurde auch durch einen Vektor Extrapolationsverfahren auf die Berechnung Zeit ¹⁰ verkürzen beschleunigt. Um eine Idee: Dieser Algorithmus bietet eine effektive Auflösung von ~ 20 um (mit Hilfe eines CCD / CMOS-Chip mit einer Pixelgröße von zB ~ 9μm) und kann ein FOV von ~ 8 cm ² innerhalb von wenigen zehn Minuten auf deconvolve einem normalen PC, auf dem Matlab ¹ ist. Beachten Sie, dass die gleiche Rechenzeit um nur ein paar Sekunden fällt für zB ~ 1mm ² FOV, vergleichbar mit dem FOV eines typischen 10-fach Objektiv ist.
3. Druckfestigkeit Probenahme / sensing Basis Sparse-Dekodierung ^2: Weitere Verbesserung der Auflösung (bis zu <4 um) ⁴ kann durch die Verwendung Druckfestigkeit Sensing / Sampling basiert Decodieralgorithmen ^11,12 erreicht werden. Druckfestigkeit Sampling / Sensing bietet eine in jüngster Zeit entstandene theoretischen Rahmen ^13-15, die zu einem spärlichen Signal von viel weniger Proben als das ist nach dem Abtasttheorem erforderlich erholen will. Während im allgemeinen Signal-Rückgewinnung aus unter-abgetastet Messungen ist ein schlecht gestelltes Problem, für eine bestimmte Klasse von Funktionen (nämlich für sparse-Funktionen), die bekannten Abtasttheorem und seine Vertretung Grundlage ist vor kurzem gezeigt, dass sehr ineffizient in Bezug auf der Anzahl der Messungen, die erforderlich sind, dh, kann die gleiche spärliche Signal in der Regel eindeutig von sehr wenigen Proben werden im Vergleich zu den klassischen Sampling-Theorie wieder.
   Ohne Linsen auskommt, fluoreszierende Bilder von unseren On-Chip-Mikroskop aufgenommene inhärent erfüllen eine wichtige Voraussetzung der Druckfestigkeit Decoding: Für die Anwendungen, die von Interesse für diese Arbeit sind, wie Weitwinkel-Fluoreszenz-Zytometrie, seltene Zellanalyse und High-Throughput-Mikro-Array-Darstellung, fluoreszierende Objekte von Interesse können angesehen werden bereits spärlich sein. Daher ist in unseren Linsen auskommt Fluoreszenzmikroskop können Entschlüsselung der Verteilung und der relativen Stärke der Fluoreszenz-Strahler auf der Objektebene liegt als eine groß angelegte l _{1-Regularized} Least Squares Problem, das gelöst werden zB mit kann modelliert werden, ein Innen- Punkt-Methode ^2,12. Dieses Optimierungsproblem lässt sich mathematisch wie folgt ausgedrückt werden:
   
   wobei | | u | | _k = (Σ _i ⁿ | u _i | ^{k) (1 / k)} und | | u | | _∞ = max _i | u _i |. Deshalb minimieren wir l _{1-regularisiert} l _2-Norm der Differenz zwischen der aufgenommenen / gemessen (y) und der geschätzten (Ax) lensfree Bilder, in denen x und A die Source-Distribution zu entschlüsseln und die Messung Matrix gebildet mit dem experimentellen PSF des Systems, bzw.. Wir verwenden auch eine Einschränkung Funktion zwingt die Source-Distribution auf der Objektebene um nicht negativ sein. Dieser iterative Druck Dekodierung Prozess endet, wenn der Wert der Zielfunktion erreicht, um eine vorgegebene Toleranzwert. Regularisierung (β) und der Toleranz-Parameter sind im allgemeinen Funktionen des Objekts Sparsity und die Messung Geräuschpegel und sind in unserem System zu ~ βmax/10 und ~ 0,01, bzw. optimiert.
   Basierend auf den oben beschriebenen numerischen Verfahrens-, Druck-Decodierung von raw Fluoreszenzbilder verbessert unsere Plattform die Fähigkeit spärlich Objekte und Exponate einer Verarbeitungsgeschwindigkeit vergleichbar mit Lucy-Richardson Dekonvolution ^{2 zurückbildet.} Neben bildgebenden einer einzigen Schicht, kann fluoreszierende Objekte in unterschiedlichen Tiefen befinden auch decodiert werden und getrennt voneinander gleichzeitig, indem Sie den gleichen Algorithmus unter Verwendung aller PSFs entsprechend den unterschiedlichen Tiefenschichten ^2.
4. Pseudocoloring: Obwohl dies nicht eine grundsätzliche Einschränkung der vorgestellten On-Chip-Imaging-Plattform beschäftigt hauptsächlich monochrome opto-elektronischen sensor Arrays, die in der Regel einen besseren Signal-Rausch-Verhältnis für die biologische Probe Bildgebung. Daher sind die Roh-fluoreszierende Bilder in Graustufen-Format, das nicht enthält die eigentliche Farbinformation der Proben erworben. Dies könnte durch Farb-CCD / CMOS-Chips in unseren lensfree Imaging-Architektur, so dass 3 Farbkanäle (rot, grün und blau) in jedem lensfree Fluoreszenz-Messung werden erworben gemildert werden. Auf der anderen Seite, wenn die Kennzeichnung Farbstoff Abstrahlcharakteristik bereits bekannt sind, Graustufen-Raw-Format Fluoreszenzbilder einer monochromen Sensor-Chip und ihre dekodiert / deconvoled Versionen können auch künstlich, um Farbbilder mit einem pseudocoloring Algorithmus in zB MATLAB implementiert umgewandelt werden. Zu diesem Zweck können die erworbenen Graustufenbilder in 3-dimensionalen Daten-Cubes, wo jede Farbe von Interesse durch entsprechende Gewichtungsfaktoren an jedem pseudo-Kanal der Datenwürfel synthetisiert werden können, erweitert werden. Als Ergebnis dieser Verarbeitung können monochrome lensfree fluoreszierenden Bildern konvertiert (falls gewünscht) zu Multi-Kanal-Bilder, die bekannte Farbinformationen eines bestimmten fluoreszierenden Objekts liefern.
5. Automatisierte Fluoreszenz-Zellzählung: Für Zytometrie Anwendungen, haben wir auch eine maßgeschneiderte Benutzeroberfläche (. Siehe Abb. 8), die automatisch zählen können die fluoreszierenden Objekte / Zellen auf ihre lensfree Bilder mit unserem On-Chip-Mikroskopie-Plattform erworben entwickelt. Gegen diese Aufgabe, ist zunächst eine weiche Schwelle zum rohen lensfree Bilder angewendet zu verengen mögliche Standorte von fluoreszierenden Objekten. Dann werden eine Reihe von Funktionen (insbesondere regionprops) verwendet werden, um Bildeigenschaften jedes Sub-region of interest wie Position, Fläche, Form und Intensität zu messen. Mit diesen Objektdaten sind binäre Objekte in Untergruppen, wie Zellen, tote Pixel, sowie Staub-oder Hintergrund Autofluoreszenz eingestuft. Nach dem abschließenden Ergebnis der regionprops Funktion gefiltert, um nur die Zellen von Interesse zeigen, kann die Länge der resultierenden Struktur-Array verwendet, um die Zellzahl über die gesamte FOV unserer lensfree On-Chip-Bildwandler zu erhalten.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Eine Übersicht über unser Set-up ist in Abbildung 1 dargestellt, mit mehreren optischen Komponenten, die in ihrem Aufbau verwendet werden. Key Features unserer On-Chip-Mikroskopie-Plattform sind in Abbildung 2 erläutert, einschließlich Fluoreszenz Anregung und Detektion, Totalreflexion sowie teilweise kohärenten Beleuchtung für holografische Übertragung Bildgebung auf der gleichen Plattform. Ohne Linsen auskommt, fluoreszierende On-Chip-Imaging-Ergebnisse aus einer heterogenen Mischung mit verschiedenen Mikro-Partikel (4 um grüne und 10 um grün / rot) sind in den Abbildungen 3-4 dargestellt. Vergleich von Lucy-Richardson Dekonvolution und Druckfestigkeit Sampling / Sensing basierte Dekodierung ist in Abbildung 5 für digital Erhöhung der Auflösung von Rohstoffen ohne Linsen auskommt, fluoreszierende Bilder zur Verfügung gestellt. Druckfestigkeit Dekodierung aktiviert räumliche Auflösung (<4 um) in Abbildung 6 wird quantifiziert. Ohne Linsen auskommt, On-Chip-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen ist in Abbildung 7, die auch Vergleichsbilder mit einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen dargestellt. Schließlich ist unser automatisiertes fluoreszierenden Objekts Zählen Schnittstelle in Abbildung 8 dargestellt.

Abbildung 1. Übersicht über unsere Linsen auskommt On-Chip-Imaging-Set-up ist mit mehreren optischen Komponenten, die in ihrem Aufbau verwendet werden gezeigt.

Abbildung 2. Die schematische Darstellung des On-Chip-lensfree Fluoreszenz-Imaging-Plattform angezeigt wird (linkes Bild). Fluoreszenzanregung wird durch die seitlichen Facette eines rautenförmigen Prisma mit einer inkohärenten Quelle erreicht. Der experimentelle Aufbau unserer On-Chip-Fluoreszenz-Imaging-Plattform wird auch gezeigt (rechtes Bild). Vollblutprobe in einem Mikrofluidik-Chip (Maße: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) wurde durch das Prisma-Schnittstelle, wobei der Index passende Öl verwendet werden, um den Chip und das Prisma montieren war aufgeregt. Nach Ablehnung des Anregungslicht von TIR und der Farbfilter, war nur der Fluoreszenzemission von der markierten Blutzellen durch unsere CCD-Sensorchip (KODAK 11002) über ein Sichtfeld von ca. 2,5 x 3,5 cm aufgezeichnet.

Abbildung 3. Weitwinkel-Linsen auskommt fluoreszierenden On-Chip-Bildgebung aus einer Mischung mit 4 um und 10 um grün fluoreszierende Partikel dargestellt. Zu Vergleichszwecken sind 10X Mikroskop-Objektiv Bilder auch vorgesehen, die stimmen gut mit unseren Linsen auskommt Fluoreszenzbilder.

Abbildung 4.

Abbildung 5. Performance-Vergleich der Lucy-Richardson (LR) Entfaltung und Druckfestigkeit Probenahme (CS) basiert Decodieralgorithmen vorgesehen ist, zur Darstellung von verschiedenen 10 pm bead-pairs. Die obere Reihe zeigt die ohne Linsen auskommt, Roh Fluoreszenzbilder. Die eingefügten Bilder in der oberen Reihe zeigen das Mikroskop Vergleiche der gleichen Partikel, aufgenommen mit einem 10X Objektiv werden. Die mittlere Zeile zeigt unser Druck-Dekodierung Ergebnisse, während die untere Reihe zeigt die Lucy-Richardson Dekonvolution Ergebnisse. d, d _CS, und d _LR beziehen sich auf die Mitte zu Mitte Abstand in mikroskopischen Bilder, decodiert CS ohne Linsen auskommt, Bilder und LR entfaltet ohne Linsen auskommt, Bilder, jeweils.

Abbildung 6. Digitalen Verarbeitung ohne Linsen auskommt, fluoreszierende Rohbilder dargestellt. Ein Druckfestigkeit Sampling Algorithmus wird verwendet, um <4 um räumliche Auflösung durch die Lösung eng gepackten 2 pm Durchmesser Perle Paare zu erreichen. Die Einschübe zeigen auch, 40x Mikroskopobjektiv Vergleiche, die sehr gut überein mit dem decodierten Fluoreszenzbilder. Hier d bezieht sich auf die Mitte zu Mitte Abstand in mikroskopischen Bilder, während d _CS bezieht sich auf die Mitte zu Mitte Abstand in der CS dekodiert ohne Linsen auskommt, fluoreszierende Bilder.

Abbildung 7. Linsen auskommt Bildgebung von Fluoreszenz (SYTO 16) gekennzeichnet weißen Blutkörperchen dargestellt. Die rohen lensfree Bilder sind schnell entschlüsselt mit einem CS basierten Decoder, die sehr gut mit einem herkömmlichen Mikroskop-Bild der gleichen Probe, die mit einem 10x Objektiv aufgenommen wird.

Abbildung 8. Eine maßgeschneiderte automatisierte fluoreszierenden Objekts Zählen Schnittstelle (in MATLAB) dargestellt ist.

Discussion

Wir haben gezeigt, eine On-Chip Fluoreszenz-Mikroskopie-Plattform, die z. B. erreichen können <4 &mgr; m räumliche Auflösung über z. B.> 0,6-8 ^{cm-2-Feld-of-view,} ohne die Verwendung von Objektiven, mechanisch-Scan-oder Dünnschicht-Interferenz-Filter. Bei dieser Technik, mit der Verwendung eines Glasfaser-Faceplate oder eine Verjüngung ist die Fluoreszenzemission von den Objekten mit einem 2D-Array von Glasfaserkabeln, bevor sie zu einem opto-elektronischen Sensor-Array wie eine CCD gelieferten gesammelt / CMOS-Chip. Diese erworbenen lensfree Bilder werden dann schnell verarbeitet werden, um <4 &mgr; m Auflösung über> 0,6-8 ^{cm-2-Feld-of-view} mit einem Druck-Probenahme / sensing Basis Decodieralgorithmus Ertrag. Eine solche kompakte und Weitwinkel-Fluoreszenz-Imaging-Plattform könnte sehr nützlich sein, für High-Throughput-Zytometrie, seltene Zellen Forschung sowie für die Microarray-Analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-8300
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-11002
Charge-coupled device(CCD)	KODAK	KAF-39000
Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS)	Micron	MT9T031C12STCD
High power LED light source	Thorlabs Inc.	M455L2-C2
High power LED driver	Thorlabs Inc.	LEDD1B
Fiber coupled LED light source	Mightex	FCS-0625-000
Vacuum Pen	Edmund Scientific	NT57-636
2, 4, 10 μm Fluospheres	Invitrogen	F-8826, F-8859, F-8836
RBS lysis buffer 1X	eBioscience	00-4333
SYTO 16 labeling reagent	Invitrogen	S7578
Fiber-optic faceplate	Edmund Scientific	NT55-142
Fiber-optic taper	Edmund Scientific	NT55-134
Prisms	Edmund Scientific	NT47-626, NT45-403
Filters	Edmund Scientific	NT39-417
PDMS Elastomers	Dow Corning	Slygard 184