Summary
lensless 온칩 형광 현미경 플랫폼 시연입니다 예의 울트라 와이드 뷰 필드 이상의 이미지를 형광 물체 수, 디코딩 알고리즘을 기반으로 압축 샘플링을 사용하여 <4μm 해상도> 0.6-8 cm2. 이러한 작고 넓은 분야 형광 온 칩 영상 양상은 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구와 microarray 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다.
Abstract
일반적으로 온 - 칩 lensless 영상은 특히 높은 처리량 검사 애플 리케이션을위한보다 간단하고 컴팩트한 디자인으로 부피가 큰 렌즈를 기반 광학 현미경을 대체하는 것을 목표로하고있다. 이 새로운 기술 플랫폼은 소설의 이론 및 디지털 재건 알고리즘의 도움을 통해 부피 및 / 또는 비용 광학 부품의 필요성을 제거하는 가능성이있다. 같은 라인을 따라, 우리는 어떤 렌즈를 사용하지 않고 0.6-8 cm 2 <의 울트라 와이드 뷰 필드 (FOV)를 통해 4μm 공간적 해상도> 예, 얻을 수 온 칩 형광 현미경의 양상을 보여주 , 기계 - 스캔 또는 박막 기반의 간섭 필터. 이 기법에서는 형광 여기는 조리 소스에서 조명 프리즘 또는 반구형 유리 인터페이스를 통해 이루어진다. 전체 개체 볼륨과 상호 작용하면이 여기 조명은 총 - 내부 - 반사 (티르) 샘플 마이크로 유체 칩 하단의 발생 과정에 의해 거부됩니다. 흥분 개체에서 형광 방출은 다음 광섬유 면판 또는 테이퍼에 의해 수집되고 전하 결합 - 장치 (CCD)와 같은 광전자 센서 배열로 전달됩니다. 압축 - 샘플링 기반 디코딩 알고리즘을 사용하여 샘플의 취득 lensfree 원료 형광 이미지를 빠르게 예 항복을 처리할 수, 0.6-8 cm 2 <의 FOV를 통해 4μm 해상도>. 또한, 수직 등으로 구분된 마이크로 채널을 쌓아, 50-100 μm의도 성공적으로 더욱 이러한 양상의 전체 처리량을 증가 같은 lensfree 온 칩 현미경 플랫폼을 사용하여 몇 군데 있습니다. 이 소형 온칩 형광 이미징 플랫폼은, 그 뒤에 빠른 압축 디코더와 함께, 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구와 microarray 분석을 위해 다소 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
이 섹션에서는, 우리는 우리 lensless 온 칩 형광 현미경 플랫폼 1-4 실험 방법을 검토합니다. 이 기법의 기능을 설명하기 위해, 우리는 형광 마이크로 입자와 라벨이 백혈구에 대해 칩 이미징 결과를 표시합니다. 여기에 논의하지 않지만, 같은 lensfree 형광 현미경 플랫폼은 또한 유전자 변형 C. 같은 이미지 작은 모델 동물에 사용할 수 있습니다 엘레간스 샘플 3.
1. Lensless 온 - 칩 이미징 플랫폼의 설계
우리 lensless 온칩 영상 플랫폼은 디지털 센서 배열 (예 : CCD 칩), 조리 조명 소스, 프리즘, 흡수 필터, 광섬유 면판 또는 광섬유 테이퍼를 포함한 여러 가지 광학 부품으로 구성됩니다. 마찬가지로 Fig.1에 나타난 이러한 구성 요소는 어떤 렌즈, 기계 스캐너 또는 박막 기반의 간섭 필터를 사용하지 않고, 칩 큰 샘플 볼륨의 형광 이미징을 달성하기 위해 마이크로 유체 장치와 함께 조립하고 있습니다.
- 디지털 센서 배열 : 우리 lensless 이미징 구성이 대상 마이크로 개체에서 형광 방출을 기록하는 광전자 센서 배열을 사용합니다. 보완 금속 - 산화물이 플랫폼에서 형광 신호의 검출을 위해, 센서 배열의 다른 유형은 같은 CCDs (KAF - 8300, 카이 - 11002, KAF - 39000, KODAK에서 예, 모델)로 사용할 수 있습니다 - 반도체 imagers (CMOS, 예를 들어, 모델 : MT9T031C12STCD, 마이크론 테크놀로지에서). 이러한 센서 배열에 대한 관심의 주요 매개 변수는 픽셀 크기 (예 : 5.4 μm의, 9 μm의, KAF - 8300을위한 6.8 μm의 및 3.2 μm의, 카이 - 11002, 각각 KAF - 39000 및 MT9T031C12STCD) 및 활성 이미징 영역 (포함 예, 2.4 cm 2, 8cm 2, 18cm 2 KAF - 8300을위한 32mm 2, 카이 - 11002, 각각 KAF - 39000 및 MT9T031C12STCD). CMOS 센서는 (예 : 현장 사용) 상대적으로 저렴하고 가벼운 중량 설계를위한 선호하는 수있는 동안 lensfree에 대한 이미지 - 칩, CCD 센서는 일반적으로, 높은 처리량 (광범위한 활성 영역)과 더 나은 감도를 달성하는 선호하실 수 있습니다.
- 광원 : 우리의 플랫폼, 조리 광원, 예를 들어, 간단한 발광 다이오드 (LED, 예를 들어, Thorlabs, M455L2 - C2 및 LEDD1B에서)에서는이 형광 여기에 사용될 수 있습니다. 실험에서 설정 그림 표시됩니다. 1, 1mm 코어의 크기와 다중 모드 광섬유 케이블 (Thorlabs, BFH37 - 1000)가 LED 소스 (모든 렌즈 또는 커플링 광학를 사용하지 않고)과 여기 불빛에 엉덩이를 결합합니다는 다음으로 전달 이 섬유의 출구 조리개를 통해 샘플 볼륨. 이 시스템에서는 형광 여기에 필요한 전력 수준은 조명 섬유의 출구> 2~8cm 2 FOV를위한 ~ 0.2-5 MW 주변되어야하지만, LED는 출력 ~ 5mW - 1W 수 있어야 엉덩이 커플링 방식으로 전력 수준은 섬유의 출력에서 여기 전력을 감소하는 상당한 손실입니다. 각종 염료의 여기를 달성하기 위해 다른 색상 LED를 또한 광섬유 커플러를 사용하여 다중 수 있습니다.
온칩 형광 영상뿐만 아니라, 동일한 샘플의 lensfree 홀로그램 전송 이미지는 그림 그림과 같이 수직 조명 소스를 활용하여이 플랫폼을 얻을 수 있습니다. 2. 형광 여기 섬유와는 달리, 홀로그램 이미지 취득, 작은 코어 크기 (예 : ~ 50-400 μm의)와 다른 광섬유 케이블은 다른 LED 소스 (Mightex, FCS - 0625-000)에 결합 엉덩이에 있습니다. 이 예제 향해 전파로 수직 조명 광은 섬유 엔드를 종료 후, 부분 공간 일관성를 얻기 시작합니다. 이 공간 일관된 지역의 직경이 빛이 여행과 섬유의 출구 조리개 크기에 반비례되는 거리에 비례합니다. 동안 샘플 비행기에서이 공간적 일관성 직경이 센서 비행기 각 시료의 회절의 크기보다 큰이므로, 각각의 개체에서 흩어져 불빛이 신실하게 샘플 인라인 홀로그램 lensfree를 작성, 배경 조명을 방해할 수 있습니다. 이러한 인수 lensfree 홀로그램 다음 빠르게 5-7 샘플 볼륨의 전송 밝은 - 현장 이미지를 재구성하기 위해 위상 복구 접근법을 반복 사용하여 처리할 수 있습니다. 이 홀로그램 조명 엔드 들어, 긴 파장 LED 여기 빛을 차단하는 데 사용되는 흡수 필터 예 전형적인 컷 - 오프 파장 높은 통과 필터 있기 때문에 (즉, ~ 625-700 NM), 500 600nm 선택됩니다 , 이것은 문제없이 인라인 샘플 홀로그램 전송 취득을 수 있습니다. - 기타 광학 부품이 온 칩 형광 현미경 플랫폼에서 두 가지 여기 필터링 방법을 Fig.2와 같이 필요한 어두운 필드 배경을 만들 수 병렬로 사용됩니다. 첫째, 유리 프리즘 (예 : 에드먼드광학, 장사 방형 또는 도브 프리즘) 또는 유리 헤미 - 분야는 관심의 샘플을 호스팅하는 마이크로 유체 칩의 아래쪽 표면에 총 - 내부 반사를 (여기 빛)을 만드는 데 사용됩니다. 이것을 병렬로, 저렴한 흡수 필터 (예 : Roscolux에서) 티르 과정을 준수하지 않는 약하게 흩어져 여기 라이트를 제거하는 데 사용됩니다. 이 두 메커니즘을 사용하여 여기의 성공 거부되면, 샘플만을 형광 방출은 탐지기 비행기에서 취득합니다. 배출 형광 신호의 특정 일부분도 동일한 인터페이스에서 티르를 경험 것을 여기에 있습니다. 그러나,이 유일한 제한이 lensfree의 검출 수치 조리개 ~ 1.0로 이미징 접근 온칩의 형광 광선의 나머지가 아직 할 수있는 동안 같은 높은 검출 수치 개구 위에서만 경사 광선이 마이크로 칩 안에 갇혀있는 상태 그러한 그 픽셀 샘플링하는 센서 배열의 활성 영역을 누르십시오.
형광 방출은 방향 때문에 빠르게 diverges되지 않기 때문에 이러한 대형 검출 수치 개구에도 불구하고, 센서 배열의 원시 형광등 장소 (예, ~ 150-200 μm의) 매우 다양한된다. 엔지니어 더 나은 통제 우리 lensless 플랫폼에서 형광 신호의 확산 공간을 위해, 우리는 개체와 개체 사이에 위치하는 평면 광학 구성 요소, 즉 광섬유 면판 (예, 에드먼드 광학, NT55 - 142) 활용 센서 비행기. 광섬유 면판은 다른 장치의 한쪽에서 광학 농도 정보를 가지고 광섬유 케이블의 2 차원 배열로 구성되어 있습니다. 우리 lensfree의 주된 기능은 온 - 칩 현미경은 설정 부분 lensfree 형광 포인트 범위를 좁힐 수있는 각 섬유, 시간 공간적 확산없이 여행 가이드 광학 파도에 몇 가지 예제 볼륨에서 형광 방출의 자유 공간 모드를하는 것입니다 개체와 검출기의 비행기 사이 확산 기능 (PSF). 이것은 더 이상 우리의 신호 대 잡음 비율 (SNR)뿐만 아니라 lensless 플랫폼을 사용 얻을 수있는 공간 해상도를 증가시킵니다.
일반 스킨의 대안으로, 우리는 또한 온칩 영상 플랫폼의 하단에 한 비교는 최고 패싯에 광섬유 케이블의 상당히 큰 밀도를 가진 "테이퍼"광섬유 스킨을 활용할 수 있습니다. 이러한 테이퍼 스킨은 우리가 더 나은 PSF를 얻는 데는 도움이되지 않습니다, 또한 우리가 예를 들어, <4 μm의 아래로 우리 lensless 해상도를 개선하는 데 도움이되는 추가 (예 :> 2 배)의 플랫폼에 확대 도입할 수 있습니다. 우리는 또한 참고해야하는 필드 뷰 이러한 테이퍼 설계의 예의 감소를 구성 수있는 일반 스킨 기반 이미징 시스템에 비해 도입 배율 계수 최소한의 제곱에 의해 줄어 듭니다에서 ~ 8cm 아래 테이퍼와 <2cm 2 : 처음에 2 FOV (카이 - 11,002 CCD).
마지막으로, 우리는 또한 광섬유 면판 또는 테이퍼의 사용은 샘플의 때문에 광섬유 배열 3 다양한 광학 모드의 lensfree 홀로그램을 왜곡합니다 것입니다. 검출기 어레이에서 이러한 왜곡 lensfree 패턴이 아직 전송 이미지, 광섬유 배열 (예 : 스킨이나 테이퍼)의 홀로그램 재건을 위해 특정 cytometry 관계 어플 리케이션에 유용할 수 있지만 온 - 칩 어셈블리에서 삭제해야 형광 모드 3 약간 감소 공간 해상도의 비용. - 마이크로 유체 칩 : 우리의 플랫폼에 사용되는 마이크로 유체 칩을 온 - 칩 이미징에 필요한 마이크로 채널을 만드는 유리 슬라이드에 배치 PDMS (Polydimethylsiloxane) 벽면을 사용하여 가공하고 있습니다. 이러한 마이크로 유체 채널을 조작하기 위해 우리는 다음과 제조법을 추구 :
- PDMS A와 B 탄성체는 균일하게 혼합하고 1시 10분 볼륨 비율로 흔들 있습니다.
- 이 이기종 솔루션 페트리 접시에 부어되면, 그것은 2 시간 65 ° C에서 치료됩니다.
- X - acto 칼을 사용하여 마이크로 유체 채널 벽 필요한 크기와 모양은 페트리 접시에서 추출됩니다.
- 장치 결합은 다음 고주파 커버 유리 슬라이드와 PDMS의 본딩 영역을 모두 노출해야 플라즈마 발생기 (전기 기술 제품 주식 회사, BD - 10AS)을 사용하여 이루어진다.
- 이 플라즈마 처리 후, 장치는 70 ° C의 결합을 강화시 ~ 40-50분에 대한 오븐 내부에 배치됩니다.
- 조립 및 lensless 온칩 현미경 플랫폼의 정렬 :
우리 lensfree 온칩 영상 플랫폼을위한 조립 절차 등 세부 수 있습니다- 옵토 - 전자 센서 배열의 유리를 커버하는 것은 제거됩니다.
- 진공 펜 (에드먼드 광학, NT57 - 636)를 사용하여 얇은 흡수 필터는 부드럽게 감지기 활성 영역의 상단에 배치됩니다.
- 광섬유 면판 또는 테이퍼이 흡수 F의 상단에 위치합니다ilter.
- 가공 마이크로 유체 칩 그런 다음 직접 광섬유 배열의 맨 위에 배치됩니다.
- 유리 프리즘 또는 헤미 - 영역은 인터페이스의 굴절률이 유리 굴절률에 일치하는 그러한 인덱스 - 일치 오일 (Cargille, 집중 오일 300 시리즈)를 사용하여 마이크로 유체 칩 위에 조립합니다.
- 사이드 조명 섬유 가까이 프리즘 (또는 헤미 - 영역)로 이동하고 각도는 그 전체 - 내부 반사가 마이크로 유체 칩의 아래 기판에 해당하는 유리 무선 인터페이스에서 발생하도록 조정됩니다. 수직 조명은 (lensfree 전송 영상에 대한) 감지기 - 배열에 직각으로 정렬하고 원하는 필드의 전망을 중심으로.
- 사이드 및 수직 가벼운 소스는 순차적 형광 이미징과 같은 온칩 플랫폼을 사용 밝은 - 필드 이미징 전송 모두를 달성하는 ON / OFF 설정됩니다.
- Lensfree 원시 이미지는 다음 PC (예 : 3.2 GHz의 프로세서, 인텔 코어)를 통해 맞춤 개발 Labview 인터페이스를 사용하여 인수하고 있습니다.
2. 샘플 준비
우리는 lensfree 시스템 시점 확산 기능 (PSF)를 측정하여, 우리의 영상 플랫폼을 보정하기 위해 형광 마이크로 비즈 (예, Invitrogen, Fluospheres) 사용. 이 초기 PSF 측정이 완료되면, 다양한 세포 또는 작은 모델 동물 (예, 유전자 변형 C. 엘레간스 샘플) 같은 온 - 칩 플랫폼을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다.
하위 섹션 다음부터 우리는 샘플 준비 단계 자세한 내용을 제공합니다.
- 형광 마이크로 비즈 :
- 원시 형광 구슬 솔루션은 샘플의 농도를 최적화하기위한 DI 물과 결합하고 있습니다.
- 형광 구슬 솔루션 ~ 10 μL 10 μm의 4 μm의 2 μm의 직경 비즈, 각각 40 μL, 5 ML 및 DI 워터 20 ML과 혼합됩니다. 다양한 구슬 (예, 비 - 형광 및 형광)의 이기종 솔루션과 같은 서로 다른 비드 솔루션을 혼합하여 필요한 준비가되어 있습니다.
- 최종 샘플 솔루션은 다음 날카로운 주사 바늘 (피셔 과학, BD PrecisionGlide 니들스, 14-826 시리즈)를 사용하여 측면 PDMS 벽에서 마이크로 유체 칩에 주입
- 백혈구의 라벨링 :
- ~ 100 μL 전체 혈액의 볼륨은 적혈구 세포 lysing 버퍼 (eBioscience)의 ~ 1 ML과 혼합됩니다.
- ~ 3 분 부화 후, lysed 혈액 솔루션 centrifuged되고 펠렛 계층은 PBS의 ~ 200 μL에 resuspended입니다 (인산이 호수 버퍼).
- 형광 염료와 함께 세포의 핵산 레이블을하려면, 1mM SYTO 16 5 μL이 샘플은 상온에서 어둠 속에서 ~ 30 분 incubated하는 후, resuspension의 200 μL에 추가됩니다.
- 둘째 centrifuging가 뜨는가 언바운드 염료의 형광 방출로 인해 배경 노이즈를 감소 제거 어디이 표시된 샘플에 적용됩니다.
- 화이트 혈액 세포 펠릿 계층은 다음 (예를 들어, 그림 7 참조) lensfree 온 - 칩 형광 이미징을위한 마이크로 유체 칩을 전송할 수 있습니다 PBS에 resuspended 있습니다.
3. 획득 lensless 형광 이미지의 디지털 처리
이 lensless 이미징 플랫폼에서 두 가지 알고리즘은 디지털 시스템의 해상도, 즉 루시 - 리처드슨 deconvolution 및 디코딩 기반의 압축 샘플링을 향상하는 데 사용됩니다. 이러한 디지털 처리 방법의 사용을 통해, 우리는 (무화과를 참조하십시오. 5-6)을 밀접하게 포장 비드 - 쌍을 해결하여 각 방식으로 얻을 수있는 해상도 향상을 계량. 재건축 lensfree 형광 이미지는 다음 반드시 형광 신호 파장의 사전 지식을 필요로하는 마이크로 개체의 자연 색상을 강조 (원하는 경우) pseudocolored 수있는 않는 색상 (예 : RGB : 빨강 - 녹색 - 파랑 CCD / CMOS) 센서 칩이 사용됩니다. 이러한 디지털 처리 방법에 대한 사용자 정의 개발된 알고리즘은 (예를 들어 3.2 GHz의 프로세서, 인텔 코어) CPU를 필요로하는 데 사용됩니다. 잠재적으로, 차세대 그래픽 처리 장치 (GPU는)도 빠른 처리를 위해 사용될 수 있습니다. 이미지 이외에, 필요하다면, 디코딩 형광 개체가 자동으로 온칩 cytometry 애플 리케이션을위한 사용자 정의 개발 인터페이스 (그림을 참조하십시오. 8)를 사용하여 계산하실 수 있습니다.
- 시스템 포인트 - 스프레드 기능 (PSF)의 측정 :
이전 해상도 향상 (예 : deconvolution 또는 압축 디코딩 등)에 대한 디지털 처리로, 온 - 칩 시스템의 조리 포인트 확산 기능은 분리된 작은 형광에 의해 만들어진 여러 가지 측정 lensfree 형광 패턴을 평균하여 얻을 수있는, 예상해야 센서 칩에서 일정한 높이에있는 구슬. 이들개인 형광 패턴은 다음 적절한 강도 정규화 1,2 후 평균 수 대량 좌표 그들의 중심과 관련하여 정렬됩니다. 이 평균 lensfree 패턴은 우리의 온 - 칩 현미경의 형광 포인트 확산 기능으로 사용할 수 있습니다. - 루시 - 리처드슨 Deconvolution 1 : 디지털 우리 플랫폼의 공간적 해상도를 개선하기 위해, 우리는 가속 루시 - 리처드슨 알고리즘 8-10에 원료 취득 형광 이미지 측정 조리 포인트 확산 기능을 먹이. 베이즈의 정리를 적용하여, 루시 - 리처드슨 알고리즘은 반복 개체 비행기 8,9에서 형광 소스 배포판의 최대 가능도 추정을 수정하기 위해 측정 포인트 확산 기능을 사용합니다. 반복 프로세스는 예상과 측정 lensfree 형광 패턴 사이의 최소한의 광장 오류를 보장하기 위해 잡음 증폭의 출현 전에 수백 사이클 후에 일반적으로 종료됩니다. 이 deconvolution 알고리즘의 융합도 계산 시간 10을 단축하기 위해 벡터 추정 방법에 의해 가속되었다. 알 방법이 알고리즘은 (예를 들어, ~ 9μm의 픽셀 크기가 CCD / CMOS 칩을 사용) ~ 20 μm의의 효과적인 공간적 해상도를 제공 및 분 몇 수십 시간 ~ 8cm 2 FOV를 deconvolve 수 Matlab 1을 실행하는 일반 PC. 같은 계산 시간이 예에 대한 몇 초 방울주의 전형 10X 목적 렌즈의 FOV 비교입니다 ~ 1mm 2 FOV.
- 압축 샘플링 / 기반 스파스 신호 디코딩 2 감지 : 추가 해상도 향상 (아래 <4 μm의)를 4가 압축 감지를 사용하여 / 기반 디코딩 알고리즘에게 11,12을 샘플링하여 얻을 수 있습니다. 압축 샘플링 / 감지는 샘플링 정리에 따라 필요한 것보다 훨씬 적게 샘플에서 스파스 신호를 복구하는 것을 목표로 최근 새로운 이론적 프레임 워크 13-15를 제공합니다. 언더 샘플 측정에서 일반적으로있는 동안, 신호 복구는 최근 측면에서 매우 비효율적인 것으로 표시됩니다 함수의 특정 클래스 (즉, 스파스 기능), 잘 알려진 샘플링 정리와 그 표현 기초를위한, 나쁘게 인한 문제 즉이 필요한 측정의 숫자 같은 스파스 신호는 일반적으로 고유 클래식 샘플링 이론에 비해 매우 적은 시료로부터 복구할 수 있습니다.
우리의 온 - 칩 현미경에 기록된 Lensless 형광 이미지는 본질적으로 압축 디코딩의 중요한 요구 사항을 충족 같은 넓은 분야 형광 cytometry, 희귀 세포 분석 및 높은 처리량 마이크로 어레이 이미징으로이 작품은 관심있는 응용 프로그램을 위해, 관심 형광 개체가 이미 스파스로 간주 수 있습니다. 따라서, 우리 lensless 형광 현미경으로 배포 및 개체 비행기에있는 형광 방출의 상대적인 장점의 디코딩은 대규모 L 1 - Regularized 예를 사용하여 해결할 수있는 최소 스퀘어스 문제로 모델링 할 수있는 인테리어 - 포인트 방식 2,12. 이 최적화 문제는 수학적으로 표현할 수 :
어디에 | | U | | K = (Σ I N | U I | K) (1 / K) 및 | | U | | ∞ = 최대 I | U I |. 따라서, 우리는 내가 1 - regularized 리터 기록된 / 측정 (Y)와 X와 A는 디코딩하는 소스 배포판을 대표하고 측정 매트릭스가를 사용하여 형성 예상 (도끼) lensfree 이미지, 차이의 2 표준을 최소화 각각 시스템의 실험 PSF. 우리는 또한 개체 비행기에서 소스 배포판은 음수가 아닌 수 강요 제약 기능을 사용하십시오. 비용 함수의 가치가 미리 정해진 공차 값에 도달하면 이것은 반복 압축 디코딩 과정이 끝납니다. Regularization (β)와 관용 매개 변수는 개체 sparsity 및 측정 소음 레벨의 일반적인 기능으로하고 있으며, ~ βmax/10와 ~ 0.01 시스템, 각각에 최적화되었습니다.
에 따라 위에서 설명한 숫자 체계, 원료 형광 이미지의 압축 디코딩 크게 스파스 개체와 전시 루시 - 리처드슨 Deconvolution 2 비교 처리 속도를 해결하기 위해 플랫폼의 능력을 향상시킵니다. 이미지 하나의 레이어를하는 것 외에도, 서로 다른 깊이에있는 형광 물체도 디코딩 할 수 있으며, 동시에 2 개의 다른 깊이 레이어에 해당하는 모든 PSFs를 사용하여 동일한 알고리즘을 실행하여 서로 구분. - Pseudocoloring : 아닌 근본적인 한계가, 제공하는 동안 온 칩 영상 플랫폼은 주로 단색 고용 옵토 - 전자 SE일반적으로 생물 학적 샘플 이미징을위한 더 나은 신호 대 잡음 비율을 제공 nsor 배열. 따라서 원시 형광 이미지는 샘플의 실제 색상 정보를 포함하지 않는 형식을 그레이 스케일에 인수됩니다. 이것은 3 색 채널 (빨강, 녹색 및 파랑) 각 lensfree 형광 측정에 인수되는 등 우리 lensfree 이미징 아키텍처의 색상 CCD / CMOS 칩을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 반면에, 라벨 염료의 방출 특성이 이미 알려져있는 경우, 원시 형식은 센서 칩 단색 및 디코딩 / deconvoled 버전도 인위적으로 예, MATLAB에서 구현 pseudocoloring 알고리즘을 사용하여 컬러 이미지로 변환될 수의 형광 이미지를 그레이 스케일. 이러한 목적을 위해, 그레이 스케일 인수 이미지는 관심의 색상 데이터 큐브의 각 가상 채널에 적절한 무게 요소를 사용하여 합성 수있는 3 차원 데이터 큐브로 확장하실 수 있습니다. 이 처리의 결과로, 단색 lensfree 형광 이미지는 주어진 객체의 알려진 형광 색상 정보를 제공하는 다중 채널 이미지 (원하는 경우) 변환할 수 있습니다.
- 자동 형광 세포 계수 : cytometry 어플 리케이션을 위해, 우리는 또한 자동으로 우리의 온 - 칩 현미경 플랫폼과 인수들은 lensfree 이미지에 따라 형광 개체 / 세포를 셀 수있는 맞춤 설계된 사용자 인터페이스를 (. 그림 참조 8) 개발했습니다. 이 작업을 목표로, 처음에는 부드러운 임계값은 형광 개체의 잠재적인 위치를 좁힐 원료 lensfree 이미지에 적용됩니다. 그런 다음, 함수의 연속은 (특히 regionprops) 위치, 면적, 모양과 강도와 같은 관심의 각 하위 지역의 이미지 속성을 측정하는 데 사용됩니다. 이러한 개체 데이터를 사용하여 이진 개체가 같은 세포, 죽은 픽셀,뿐만 아니라 먼지나 배경 자동 형광으로 subgroups로 구분됩니다. 일단 regionprops 기능의 최종 결과가 관심만을 세포를 보여주 필터링, 결과 구조 배열의 길이는 우리 lensfree 온칩 영상기의 전체 FOV 이상의 셀 개수를 얻을 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
우리 설정의 개요는 자사의 조립에 사용되는 여러 가지 광학 부품과 그림 1에 표시됩니다. 우리 온칩 현미경 플랫폼의 주요 기능은 형광 여기와 감지, 총 내부 반사뿐만 아니라, 동일한 플랫폼에서 홀로그램 전송 영상에 대해 부분적으로 - 일관된 조명을 포함하여, 그림 2에서 설명합니다. 다양한 마이크로 입자 (4 μm의 녹색 및 10 μm의 녹색 / 적색)을 포함하는 이종 혼합의 Lensless 형광 온 칩 이미징 결과는 3-4 그림에 표시됩니다. 루시 - 리처드슨 deconvolution과 샘플링 / 기반 디코딩을 감지 압축의 비교는 디지털 원료 lensless 형광 이미지의 해상도를 향상을위한 그림 5에서 제공됩니다. 압축 디코딩은 공간 해상도 (<4 μm의)는 그림 6에서 계량가 활성화. 찬란 표시 백혈구의 Lensless 온 - 칩 현미경 또한 종래의 형광 현미경으로 촬영한 비교 이미지를 제공하는 그림 7에서 보여주고있다. 마지막으로, Google의 자동 형광 개체 카운트 인터페이스는 그림 8에 표시됩니다.
우리 lensless 온칩 영상 설정 그림 1. 개요의 조립에 사용되는 여러 광학 구성 요소와 함께 표시됩니다.
그림 2. 온칩 lensfree 형광 이미징 플랫폼의 개략도 다이어그램 (왼쪽 이미지) 표시됩니다. 형광 여기는 조리 소스를 사용하여 편능형 프리즘의 측면 패싯을 통해 이루어진다. 설정의 온 칩 형광 이미징 플랫폼의 실험도 (오른쪽 이미지) 표시됩니다. microfluidic 칩 (크기 : 2.5 X 3.5 X 0.3 cm) 내에 전체 혈액 샘플은 인덱스와 일치하는 기름은 칩 및 프리즘을 조립하는 데 사용했던 프리즘 인터페이스를 통해 흥분했다. 티르와 컬러 필터에 의해 여기 빛을 거절되면 레이블이 붙은 혈액 세포에서만 형광 방출은 ~ 2.5 X 3.5 ㎝의 FOV를 통해 우리의 CCD 센서 칩 (KODAK 11002)에 의해 기록되었다.
그림 3. 4 μm의 및 10 μm의 녹색 형광 입자를 포함하는 혼합물의 와이드 필드 lensless 형광 온 칩 이미지는 그림입니다. 비교 목적을 위해, 10X 현미경 목표 이미지는 또한 lensless 형광 이미지와 잘 동의하는, 제공됩니다.
그림 4.
그림 5. 루시 - 리처드슨 (LR) deconvolution 및 디코딩 알고리즘을 기반으로 압축 샘플링 (CS)의 성능 비교는 다양한 10 μm의 비드 - 쌍 이미징을 위해 제공됩니다. 맨 윗줄은 lensless 원시 형광 이미지를 보여줍니다. 맨 윗줄에 삽입된 페이지 이미지 10X 객관적인 렌즈를 사용하여 획득하는 동일한 입자의 현미경 비교를 보여줍니다. 아래 행이 루시 - 리처드슨 deconvolution 결과를 보여줍니다 반면 중간 행은 우리 압축 디코딩 결과를 보여줍니다. D, D CS, 그리고 D LR은 현미경 이미지의 중심 - 투 - 중심 거리를 참조 CS는 lensless 이미지를 해독하고, LR은 각각 lensless 이미지를 deconvolved.
그림 6. lensless 형광 RAW 이미지의 디지털 처리가 그림입니다. 압축 샘플링 기반 알고리즘은 밀접하게 포장이 μm의 직경 비드 쌍을 해결하여 <4 μm의 공간적 해상도를 달성하는 데 사용됩니다. insets 또한 디코딩 형광 이미지를 잘 동의 40X 현미경의 객관적인 비교를 보여줍니다. D CS는 CS 디코딩된 lensless 형광 이미지의 중심 - 투 - 중심 거리를 의미하는 동안 여기에서 D는, 현미경 이미지의 중심 - 투 - 중심 거리를 말합니다.
그림 7. 찬란 (SYTO 16) 표시 백혈구의 Lensless 이미지는 그림입니다. 원시 lensfree 이미지는 빠르게 10X 목적 렌즈와 함께 구입한 것과 동일한 샘플의 기존 현미경의 이미지와 잘 동의 CS 기반의 디코더를 사용하여 해독됩니다.
그림 8. 맞춤 설계된 자동 형광 개체 카운트 인터페이스 (MATLAB)을 그림입니다.
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Discussion
우리는 예를 들어, 달성할 수있는 온 칩 형광 현미경 플랫폼 시연 <예여 4μm 공간적 해상도를> 0.6-8 cm이 어떤 렌즈, 기계 - 스캔 또는 박막 간섭 - 필터를 사용하지 않고 뷰 필드. 이 기법에서는 광섬유 면판 또는 테이퍼를 사용하여, 개체의 형광 방출는 같은 CCD으로 옵토 - 전자 센서 어레이에 전달되기 전에 광섬유 케이블의 2D - 배열로 수집 / CMOS 칩. 이러한 인수 lensfree 이미지는 다음 신속하게 기반 디코딩 알고리즘을 감지 압축 샘플링 /를 사용하여 0.6-8 cm 2 뷰 필드 <통해 4μm 해상도를> 양보로 처리됩니다. 이러한 작고 넓은 필드 형광 이미징 플랫폼은 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구뿐만 아니라 microarray 분석위한 매우 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
A. Ozcan는 기꺼이 NSF 경력 상, 이사, NIH의 사무실에서 ONR 영 탐정 수상 2009 NIH 원장의 새로운 이노 수상 DP2OD006427의 지원을 인정한다. 저자는 또한 빌 & 멜린다 게이츠 재단, 미국 보다폰 재단, 그리고 NSF 비시 프로그램 (상 # 0,754,880 및 0,930,501 이하)의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-8300 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-11002 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9T031C12STCD | |
| High power LED light source | Thorlabs Inc. | M455L2-C2 | |
| High power LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B | |
| Fiber coupled LED light source | Mightex | FCS-0625-000 | |
| Vacuum Pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 2, 4, 10 μm Fluospheres | Invitrogen | F-8826, F-8859, F-8836 | |
| RBS lysis buffer 1X | eBioscience | 00-4333 | |
| SYTO 16 labeling reagent | Invitrogen | S7578 | |
| Fiber-optic faceplate | Edmund Scientific | NT55-142 | |
| Fiber-optic taper | Edmund Scientific | NT55-134 | |
| Prisms | Edmund Scientific | NT47-626, NT45-403 | |
| Filters | Edmund Scientific | NT39-417 | |
| PDMS Elastomers | Dow Corning | Slygard 184 |
References
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