Summary
Um sem lente no chip plataforma de microscopia fluorescente é demonstrado que pode objetos de imagem fluorescente através de uma ultra-wide campo de visão de, por exemplo,> 0,6-8 cm2 com <4μm resolução usando uma amostra de compressão baseada algoritmo de decodificação. Como um compacto e de campo amplo modalidade de imagem fluorescente on-chip poderia ser valioso para high-throughput citometria, raro de célula de pesquisa e análise de microarray.
Abstract
On-chip de imagem sem lente, em geral, destina-se a substituir os volumosos lente baseada em microscópios ópticos com desenhos mais simples e compacto, especialmente para aplicações high-throughput screening. Esta plataforma tecnológica emergente tem o potencial de eliminar a necessidade de volumoso e / ou caros componentes ópticos através da ajuda de novas teorias e algoritmos de reconstrução digital. Na mesma linha, aqui nós demonstramos um on-chip modalidade de microscopia fluorescente que pode conseguir, por exemplo, <4μm resolução espacial mais uma ultra-wide campo de visão (FOV) de> centímetros 0,6-8 2 sem o uso de lentes , mecânico-digitalização ou película fina filtros de interferência baseado. Nesta técnica, excitação fluorescente é alcançado através de uma interface de prisma ou hemisférica de vidro iluminado por uma fonte incoerente. Depois de interagir com o volume objeto inteiro, esta luz de excitação é rejeitado pelo total de interna-reflexão (TIR) processo que está ocorrendo na parte inferior da amostra micro-chip fluídico. A emissão fluorescente dos objetos animado é então recolhido por uma placa de fibra óptica ou de um cone e é entregue a um conjunto de sensores optoeletrônicos tais como charge-coupled-device (CCD). Usando uma amostragem de compressão algoritmo de decodificação baseado, adquirida lensfree primas imagens fluorescentes da amostra pode ser rapidamente processada para produzir por exemplo, <4μm resolução sobre um FOV de> 0,6-8 cm 2. Além disso, empilhadas verticalmente micro-canais que são separados por exemplo, 5-10 mM também pode ser fotografada com sucesso usando o mesmo lensfree on-chip plataforma de microscopia, o que aumenta ainda mais o rendimento global da modalidade. Este compacto on-chip plataforma de imagem fluorescente, com um decodificador rápida compressão por trás dele, poderia ser bastante valiosa para high-throughput citometria, raro de célula de pesquisa e análise de microarray.
Protocol
Nesta seção, iremos rever os métodos experimentais de nossa plataforma de microscopia sem lente no chip fluorescentes 1-4. Para demonstrar as capacidades desta técnica, vamos mostrar os resultados on-chip de imagem para micro-partículas fluorescentes e rotulado células brancas do sangue. Embora não discutido aqui, o mesmo lensfree plataforma de microscopia fluorescente também pode ser usado para animais pequena imagem do modelo, como transgênicos C. amostras elegans 3.
1. Projeto da Plataforma de imagem sem lente On-Chip
Nossa plataforma de imagem sem lente no chip é composto por vários componentes ópticos, incluindo um sensor digital (por exemplo, um chip CCD), uma fonte de iluminação incoerente, um prisma, um filtro de absorção, uma placa de fibra óptica ou de um cone de fibra óptica. Como mostrado na Fig.1, estes componentes são montados com micro-fluídicos dispositivos para alcançar imagens fluorescentes de um volume grande amostra em um chip, sem o uso de lentes, scanners mecânico ou película fina filtros de interferência baseado.
- Array de Sensor Digital: Nossa configuração de imagem sem lente utiliza um conjunto de sensores optoeletrônicos para gravar a emissão fluorescente do alvo micro-objetos. Nesta plataforma, para a detecção do sinal de fluorescência, diferentes tipos de sensor de matrizes podem ser utilizados, tais como CCDs (eg, Modelos: KAF-8300, KAI-11002, KAF-39000, todos da KODAK) e complementary metal-oxide -imagers semicondutores (CMOS, por exemplo, Modelo: MT9T031C12STCD, da Micron Technologies). Parâmetros-chave de interesse para estes conjuntos de sensores incluem o tamanho do pixel (por exemplo, 5,4 mM, 9 mM, 6,8 mm e 3,2 mm para KAF-8300, KAI-11002, 39000 e KAF-MT9T031C12STCD, respectivamente) e a área de imagem ativa ( por exemplo, 2,4 cm 2, 8 cm 2, 18 cm 2 e 32 mm 2 para KAF-8300, KAI-11002, 39000 e KAF-MT9T031C12STCD, respectivamente). Para lensfree on-chip de imagem, sensores CCD pode, em geral, ser preferido para alcançar um maior rendimento (maior área ativa) e melhor sensibilidade, enquanto que os sensores CMOS podem ser preferido para os projetos de peso relativamente mais barato e mais leve (por exemplo, para uso em campo).
- Fontes de Luz: Na nossa plataforma, uma fonte de luz incoerente, por exemplo, um diodo emissor de luz simples (LED, por exemplo, de Thorlabs, M455L2-C2 e LEDD1B), pode ser usado para a excitação de fluorescência. No set-up experimental mostrado na figura. 1, um modo multi-cabo de fibra óptica (Thorlabs, BFH37-1000) com um tamanho do núcleo mm é butt acoplado a uma fonte de LED (sem o uso de lentes ou qualquer ótica de acoplamento) ea luz de excitação é então entregue ao volume da amostra através da abertura de saída desta fibra. Neste sistema, o nível de potência necessária de excitação de fluorescência deve ser em torno ~ mW 0,2-5 para um FOV de> fevereiro 02-08 centímetros na saída da fibra de iluminação, no entanto, os LEDs devem ser capazes de saída de 5mW ~-1W níveis de potência como a abordagem butt acoplamento é consideravelmente com perdas que diminui o poder de excitação na saída da fibra. Para alcançar a excitação de corantes diversos, LEDs de cores diferentes também podem ser multiplexados usando um acoplador de fibra óptica.
Além on-chip de imagem fluorescente, imagens lensfree transmissão holográfica de uma mesma amostra também pode ser obtida com esta plataforma, utilizando uma fonte de iluminação vertical, como ilustrado na figura. 2. Ao contrário da fibra de excitação de fluorescência, para aquisição de imagem holográfica, um cabo de fibra ótica diferente, com um tamanho menor do núcleo (por exemplo, ~ 5-40 mm) é acoplado a bunda de outra fonte LED (Mightex, FCS-0625-000). Esta luz de iluminação vertical, depois de sair da fibra final, começa a adquirir coerência espacial parcial como ele se propaga em direção à amostra. O diâmetro desta região espacialmente coerente é proporcional à distância que a luz viaja e é inversamente proporcional ao tamanho da abertura de saída da fibra. Enquanto este diâmetro coerência espacial no plano da amostra é maior que o tamanho de difração de cada amostra na placa do sensor, a luz espalhada a partir de cada objeto pode fielmente interfere com a luz de fundo, criando uma lensfree em linha holograma da amostra. Estes hologramas adquiridos lensfree podem então ser rapidamente processados usando abordagens iterativa fase de recuperação para reconstruir uma imagem clara de transmissão de campo do volume de amostra 5-7. Para este fim de iluminação holográfico, um comprimento de onda LED (ie, ~ 625-700 nm) é selecionada, pois os filtros de absorção que são usados para bloquear a luz de excitação são filtros passa-alta com as típicas de corte de comprimentos de onda, por exemplo, 500-600nm , que permite a aquisição de transmissão em linha hologramas das amostras sem um problema. - Outros componentes ópticos: Nesta plataforma on-chip microscopia fluorescente, dois métodos diferentes de excitação de filtragem são usadas em paralelo para criar o fundo escuro-campo de preenchimento obrigatório, conforme mostrado na Fig.2. Primeiro, um copo de prisma (por exemplo, EdmundOptics rombóide, ou prismas pomba) ou um copo hemi-esfera é usado para criar total-reflexão interna (para a luz de excitação) na superfície inferior do chip micro-fluídicos que hospeda as amostras de interesse. Em paralelo a isso, um filtro de absorção de baixo custo (por exemplo, de Roscolux) é usado remover a luz de excitação fraca dispersa que não obedece o processo de TIR. Após a rejeição de sucesso da excitação com estes dois mecanismos, apenas a emissão fluorescente das amostras é adquirido no plano detector. Note aqui que uma certa fração do sinal emitido fluorescentes também experiências TIR na mesma interface. No entanto, isso limita apenas a abertura de detecção numérico desta lensfree on-chip aproximação da imagem latente para ~ 1.0, de tal forma que apenas os raios oblíquos acima como abertura uma alta de detecção numéricos permanecem presos dentro do micro-chip, enquanto o resto dos raios fluorescentes podem ainda atingiu a área ativa do sensor array a ser recolhido pelo seus pixels.
Apesar de tal abertura detecção de um grande numérica, os pontos-prima fluorescentes para o sensor array-se bastante ampla (por exemplo, ~ 150-200 mm) desde fluorescentes emissão não é direcional e, portanto, rapidamente diverge. Para o engenheiro e melhor controle espacial divulgação desta sinal fluorescente na nossa plataforma sem lente, utilizamos um componente óptico planar, ou seja, uma placa de fibra óptica (por exemplo, Edmund Optics, NT55-142), que é colocado entre o objeto eo aviões sensor. A placa de fibra óptica é composta por uma matriz 2D de cabos de fibra óptica que carregam informação de intensidade óptica de um lado do dispositivo para o outro. Sua principal função no nosso lensfree on-chip microscopia de set-up é o casal modos de espaço livre da emissão fluorescente do volume de amostra em guiada ondas ópticas espaciais que viajam sem se espalhando dentro de cada fibra, o que pode diminuir parcialmente o ponto lensfree fluorescentes espalhou-função (PSF) entre o objeto e os aviões detector. Isso aumenta ainda mais a nossa relação sinal-ruído (SNR), bem como a resolução espacial que pode ser conseguido usando a nossa plataforma sem lente.
Como uma alternativa a uma faceplate regular, também podemos utilizar em nossa plataforma de imagens on-chip "cônico" faceplate de fibra ótica que tem uma densidade significativamente maior de cabos de fibra óptica na sua faceta superior em comparação com o fundo. Como uma faceplate cônico não só nos ajudar a alcançar um PSF melhor, mas também pode introduzir ampliação na nossa plataforma (por exemplo,> 2-3X), que ainda nos ajudam a melhorar a nossa resolução sem lente para baixo, por exemplo, <4 mm. Devemos também observar que o campo de visão de um tal desígnio cônico é reduzida em pelo menos o quadrado do fator de ampliação introduzida quando comparado com um normal sistema de imagens baseado faceplate, o que pode constituir uma redução de, por exemplo, de ~ 8 centímetros 2 FOV inicialmente (CCD: KAI-11002) até <2 cm 2 com a vela.
Finalmente, devemos notar também que o uso de uma placa de fibra óptica ou uma vela distorce os hologramas lensfree da amostra por causa de vários modos ópticos de matriz de fibra óptica 3. Embora tais padrões distorcidos lensfree na matriz detector ainda pode ser útil para aplicações de certa relação citometria, para a reconstrução de imagens holográficas de transmissão, a matriz de fibra óptica (por exemplo, o painel ou a vela) precisa ser removido do conjunto on-chip ao custo de um pouco menor resolução espacial no modo 3 fluorescente. - Micro-fluídicos Chips: Os chips micro-fluídicos que são utilizados em nossa plataforma são fabricados utilizando PDMS (polidimetilsiloxano) paredes colocadas em lâminas de vidro criando o micro-canais que são necessários para on-chip de imagem. Para fabricar esses canais micro-fluídicos que perseguimos a seguinte receita:
- PDMS A e B são elastômeros uniformemente misturado e mexido com relação de volume de 1:10.
- Uma vez que esta solução heterogênea é vertido para uma placa de Petri, é curado a 65 ° C por 2 horas.
- Usando uma faca de X-acto, o tamanho necessário e forma do micro-fluídicos canal de parede é extraído da placa de Petri.
- A ligação do dispositivo é, então, conseguido através de uma freqüência alta de plasma gerador (Electro-Technic Products Inc., BD-10AS), que precisa expor tanto os slides tampa de vidro e PDMS área adesiva.
- Após esse tratamento plasma, o dispositivo é colocado dentro de um forno para ~ 40-50 minutos a 70 ° C para fortalecer o vínculo.
- Montagem e alinhamento da plataforma de microscopia sem lente no chip:
Os procedimentos de montagem para a nossa plataforma de imagem lensfree on-chip podem ser detalhados como:- Tampa de vidro da opto-eletrônica do sensor array é removido.
- Usando uma caneta de vácuo (Edmund Optics, NT57-636), um filtro de absorção fina é delicadamente colocada no topo da área de detector ativo.
- A placa de fibra óptica ou uma vela é posicionada no topo desta f absorçãoILTER.
- O fabricados micro-chip fluídico é, então, colocado diretamente no topo da matriz de fibra óptica.
- Um prisma de vidro ou de uma hemi-esfera é montado acima do chip micro-fluídicos usando um óleo índice de correspondência (Cargille, imersão em óleo 300 Series) de tal forma que o índice de refração da interface é comparado com o índice de refração do vidro.
- Iluminação lateral de fibra é aproximou-se do prisma (ou a hemi-esfera) e seu ângulo é ajustado para garantir que reflexão total interna ocorre na interface ar-vidro correspondente ao substrato do chip micro-fluídicos do fundo. A iluminação vertical (transmissão de imagens para lensfree) está alinhado a ser perpendicular ao detector de arranjo e está centrada a um desejado campo de visão.
- Laterais e verticais fontes de luz são seqüencialmente ligado / desligado para alcançar tanto de imagens fluorescentes e brilhantes-campo de imagem de transmissão usando a plataforma on-chip mesmo.
- Imagens Lensfree-primas são adquiridas em seguida, usando um custom-developed de interface Labview através de um PC (por exemplo, processador de 3,2 GHz, Intel Core).
2. Preparação da Amostra
Fluorescentes que usamos micro-esferas (eg, Invitrogen, Fluospheres) para calibrar a nossa plataforma de imagem, medindo o seu sistema lensfree ponto espalhou-função (PSF). Após essa medida PSF inicial é feito, várias células ou animais modelo pequeno (por exemplo, amostras de transgênicos C. elegans) pode ser fotografada usando a plataforma on-chip mesmo.
Começando com a próxima sub-seção, iremos fornecer mais detalhes sobre os nossos passos de preparação da amostra.
- Fluorescentes micro-esferas:
- Raw fluorescentes soluções talão são combinados com água DI para otimizar a concentração das amostras.
- ~ ML 10 de talão fluorescentes solução é misturada com 40 mL, 5 mL e 20 mL de água DI por 10 mM, 4 mm de diâmetro e 2 contas mM, respectivamente. Soluções heterogêneas de contas diferentes (por exemplo, não-fluorescentes e fluorescentes) são preparados conforme a necessidade através da mistura de diferentes soluções de talão com o outro.
- A solução da amostra final é então injetada no micro-chip fluídico das paredes laterais PDMS usando uma agulha de seringa afiada (Fisher Scientific, agulhas BD PrecisionGild 14-826 Series)
- Rotulagem de células brancas do sangue:
- Um volume de aproximadamente 100 mL de sangue todo é misturado com ~ 1 mL de tampão de lise vermelho das células sanguíneas (eBioscience).
- Após a incubação por ~ 3 min, a solução é centrifugada de sangue lisado ea camada de pellet é ressuspenso em 200 mL ~ de PBS (Phosphate buffered saline).
- Para identificar o ácido nucléico das células com corantes de fluorescência, 5 mL de 1mM SYTO 16 é adicionado à mL 200 de ressuspensão, após o qual a amostra é incubada por ~ 30 min no escuro à temperatura ambiente.
- Centrifugação segunda é aplicada a essa amostra rotulada, onde o sobrenadante é removido para diminuir o ruído de fundo devido à emissão fluorescente de corantes não ligados.
- Glóbulos brancos pellet camada é ressuspenso em PBS, que podem então ser transferidos para um chip micro-fluídicos para lensfree on-chip de imagem fluorescente (ver, por exemplo, a Figura 7).
3. Processamento digital da adquirida sem lente imagens fluorescentes
Nesta plataforma de imagem sem lente, dois algoritmos diferentes são usados para aumentar a resolução digital do sistema, ou seja, a deconvolução Lucy-Richardson e amostragem compressão baseada decodificação. Através da utilização destes métodos de processamento digital, que quantificou o melhoramento de resolução que podem ser alcançados com cada abordagem, resolvendo de forma compacta talão de pares (ver Figs. 5-6). O reconstruída lensfree imagens fluorescentes podem ser pseudocolored (se desejar) para realçar a cor natural dos objetos micro-, o que certamente exige conhecimento prévio do comprimento de onda de sinal fluorescente, a não ser uma cor (por exemplo, um RGB: vermelho-verde-azul CCD / CMOS) sensor chip é usado. Para estes métodos de processamento digital, custom-desenvolveu algoritmos que são usados apenas necessita de uma CPU (por exemplo, um processador de 3,2 GHz, Intel Core). Potencialmente, a próxima geração de unidades de processamento gráfico (GPUs) também poderia ser usado para processamento mais rápido. Além de imagens, se necessário, os objetos decodificado fluorescentes também podem ser contados automaticamente usando uma interface personalizada desenvolvida (ver fig. 8) para aplicações on-chip citometria.
- Medição do sistema Ponto-Spread Function (PSF):
Antes de qualquer processamento digital para a resolução de melhoria (como deconvolução ou decodificação de compressão), a função de ponto de espalhar-incoerência do sistema on-chip precisa ser estimado, o que pode ser obtido pela média de várias medidas lensfree padrões fluorescentes criado por fluorescentes isoladas pequenas grânulos localizados a uma certa altura do sensor chip. Estespadrões individuais fluorescentes são então alinhados com respeito a seu centro de massa a ser coordenadas em média após 1,2 apropriada intensidade de normalização. Este padrão lensfree média pode então ser usado como a função de ponto de espalhar-fluorescente de nosso microscópio on-chip. - Lucy-Richardson Deconvolução 1: Para digitalmente melhorar a resolução espacial de nossa plataforma, nós alimentamos a imagem adquirida primas fluorescentes e as medidas de pontos de função espalhar-incoerência em um acelerado 10/08 Lucy-Richardson algoritmo. Ao aplicar o teorema de Bayes, o algoritmo de Lucy-Richardson usa a medida de pontos de função espalhou para iterativamente refinar a estimativa de máxima verossimilhança da distribuição do código fonte de fluorescência no plano objeto 8,9. O processo de iteração é terminada normalmente após algumas centenas de ciclos antes da emergência da amplificação de ruído para garantir erro quadrado mínima entre a projeção ea medida lensfree padrões fluorescentes. A convergência desse algoritmo de deconvolução também foi acelerada por um método de extrapolação vector para encurtar o tempo de computação 10. Para dar uma idéia: este algoritmo fornece uma resolução efetiva espacial de ~ 20 microns (usando um chip CCD / CMOS com um tamanho de pixel de, por exemplo, ~ 9μm) e pode deconvolve um FOV de ~ 8 cm 2, dentro de algumas dezenas de minutos em um PC normal que esteja executando o Matlab 1. Note-se que o tempo de computação mesma cai para apenas alguns segundos para, por exemplo, ~ 1 milímetro 2 FOV que é comparável ao de uma lente FOV objetivo típico 10X.
- Compressão de amostragem / detecção baseada sinal esparsos decodificação 2: melhora a resolução mais (até <4 mm) 4 pode ser conseguido através de compressão Sensing / Sampling algoritmos baseados decodificação 11,12. Amostragem de compressão / Sensing fornece um quadro teórico 13-15 recentemente emergentes que tem como objetivo recuperar um sinal de escassa a partir de amostras muito menos de que é necessário de acordo com o teorema de amostragem. Embora, em geral de recuperação do sinal, a partir de sub-amostradas medições é um problema mal colocado, para uma classe específica de funções (ou seja, para as funções de escassa), o teorema de amostragem bem conhecida e sua base de representação foi recentemente mostrou-se bastante ineficiente em termos do número de medidas que são necessárias, ou seja, o mesmo sinal esparsas podem, em geral, ser exclusivamente recuperada a partir de amostras muito poucos em comparação com a teoria da amostragem clássica.
Sem lente imagens fluorescentes gravado por nosso microscópio on-chip inerentemente satisfazer um requisito importante de decodificação de compressão: Para os aplicativos que são de interesse para este trabalho, como de campo amplo citometria fluorescentes, a análise de células raras e de alto rendimento de imagens micro-array, objetos fluorescentes de interesse pode ser considerada como já fraca. Portanto, no nosso microscópio fluorescente sem lente, a decodificação da distribuição e da relação de forças entre os emissores fluorescentes localizadas no plano objeto pode ser modelado como um l em larga escala de 1 regularizada Least Squares Problema que pode ser resolvido usando, por exemplo, um interior- método do ponto 2,12. Este problema de otimização pode ser matematicamente expressa como:
onde | | u | | k = (Σ i n | u i | k) (1 / k) e | | u | | ∞ = max i | u i |. Portanto, minimizar l 1 l 2-regularizada norma da diferença entre o registrado / medido (y) e os cerca de imagens (Ax) lensfree, onde x e A representam a distribuição do código fonte para ser decodificado ea matriz de medição formado usando o PSF experimental do sistema, respectivamente. Nós também usamos uma função restrição forçando a distribuição do código fonte no plano objeto a ser não negativo. Esse processo iterativo de decodificação de compressão termina quando o valor da função custo chega a um valor de tolerância pré-determinado. Parâmetros de regularização (β) e tolerância são as funções gerais da dispersão objeto eo nível de ruído de medição, e são otimizados em nosso sistema para ~ ~ βmax/10 e 0,01, respectivamente.
Com base no esquema acima delineado numérica, decodificação de compressão de imagens fluorescentes primas melhora muito a capacidade de nossa plataforma para resolver os objetos esparsos e apresenta uma velocidade de processamento comparável à Lucy Richardson Deconvolução-2. Além de imagens de uma única camada, objetos fluorescentes localizadas em diferentes profundidades também pode ser decodificado e separados uns dos outros ao mesmo tempo, executando o mesmo algoritmo usando todos os PSF correspondente à profundidade de camadas diferentes 2. - Pseudocoloring: Embora não seja uma limitação fundamental, o apresentado on-chip plataforma de imagem em sua maioria monocromáticas emprega opto-eletrônica siarrays nsor que, em geral, proporcionar uma melhor relação sinal-ruído para imagens de amostra biológica. Portanto, as imagens fluorescentes primas são adquiridas em escala de cinza formato, que não contém as informações de cor verdadeira das amostras. Isso poderia ser atenuado pelo uso de cores CCD / CMOS chips em nossa arquitetura imagem lensfree tal que 3 canais de cores (vermelho, verde e azul) são adquiridos em cada medição lensfree fluorescente. Por outro lado, se a rotulagem características de emissão de corantes já são conhecidas, formato RAW em tons de cinza fluorescente de um sensor de chip-monocromática e suas versões decodificado / deconvoled também pode ser artificialmente convertidos em imagens, cores, utilizando um algoritmo implementado em pseudocoloring por exemplo, MATLAB. Para este propósito, as imagens adquiridas em tons de cinza pode ser expandida em 3-dimensional de dados cubos, onde qualquer cor de interesse podem ser sintetizados, usando-se fatores de ponderação em cada canal pseudo do cubo de dados. Como resultado deste processamento, imagens monocromáticas lensfree fluorescentes podem ser convertidos (se desejar) para imagens multi-canal que fornecem informações de cor conhecida de um determinado objeto fluorescente.
- Contagem de células automatizado fluorescente: Para aplicações de citometria, temos também desenvolveu uma interface de usuário personalizados (ver Fig. 8.) Que pode contar automaticamente os objetos fluorescentes / células com base em suas imagens lensfree adquiridos com a nossa plataforma de microscopia on-chip. Em direção a essa tarefa, inicialmente limiar de um pano macio é aplicada a imagens brutas lensfree para diminuir possíveis locais de objetos fluorescentes. Então, uma série de funções (especialmente regionprops) são usados para medir as propriedades da imagem de cada sub-região de interesse, como posição, área, forma e intensidade. Usando esses dados objeto, objetos binários são classificados em subgrupos, como as células, os pixels mortos, bem como a fluorescência de poeira ou de fundo auto. Uma vez que o resultado final da função regionprops é filtrada para mostrar apenas as células de interesse, o comprimento da matriz estrutura resultante pode ser usado para obter a contagem de células ao longo dos FOV inteira do nosso imager on-chip lensfree.
4. Resultados representativos:
Uma visão geral do nosso set-up é mostrado na Figura 1, com vários componentes ópticos que são utilizados na sua montagem. Principais características de nossa plataforma de microscopia on-chip são explicados na Figura 2, incluindo excitação fluorescente e detecção, reflexão interna total, bem como iluminação parcialmente coerente para a transmissão de imagens holográficas na mesma plataforma. Sem lente fluorescentes resultados on-chip de imagem de uma mistura heterogênea contendo vários micro-partículas (4 mm de verde e 10 mM verde / vermelho) são mostrados nas Figuras 3-4. Comparação de Lucy-Richardson deconvolução e compressão de amostragem / Sensing decodificação é fornecido com base na Figura 5 para digitalmente melhorar a resolução de matérias-primas sem lente imagens fluorescentes. Decodificação de compressão habilitado resolução espacial (<4 mm) é quantificado na Figura 6. Microscopia on-chip sem lente de fluorescente etiquetado células brancas do sangue é ilustrada na Figura 7, que também oferece imagens de comparação tomada com um microscópio fluorescente convencional. Finalmente, nossa interface contagem automatizada fluorescentes objeto é mostrado na Figura 8.
Figura 1. Visão geral dos nossos sem lente no chip set-up de imagem é mostrada com vários componentes ópticos que são utilizados na sua montagem.
Figura 2. O esquema de on-chip plataforma de imagem lensfree fluorescente é mostrado (imagem à esquerda). Excitação de fluorescência é conseguida através da faceta lateral de um prisma rombóide usando uma fonte incoerente. O set-up experimental da nossa plataforma de imagem on-chip fluorescentes também é mostrado (imagem à direita). Amostra de sangue total dentro de um chip microfluídico (dimensões: 2,5 x 3,5 x 0,3 cm) foi animado por meio da interface prisma, onde o petróleo índice correspondente foi usado para montar o chip eo prisma. Após a rejeição da luz de excitação pela TIR e do filtro de cor, apenas a emissão fluorescentes das células de sangue rotulados foi gravado pelo nosso chip sensor CCD (KODAK 11002) ao longo de um FOV de ~ 2,5 x 3,5 cm.
Figura 3. Wide-campo sem lente de imagens on-chip fluorescentes de uma mistura contendo 4 mm e 10 mM verde partículas fluorescentes é ilustrado. Para fins de comparação, as imagens objetiva de 10X microscópio também são fornecidos, que concordam bem com os nossos sem lente imagens fluorescentes.
Figura 4.
Figura 5. Comparação de desempenho da Lucy-Richardson deconvolução (LR) e amostragem de compressão (CS), com base algoritmos de decodificação são fornecidas, para geração de imagens de vários 10 mM talão de pares. A linha superior mostra a crua sem lente imagens fluorescentes. As imagens embutidas na linha de cima mostra as comparações microscópio das partículas mesmos que são adquiridos utilizando uma lente objetiva de 10X. A linha do meio demonstra nosso resultados de decodificação de compressão, enquanto a linha inferior ilustra os resultados Lucy-Richardson deconvolução. d, d CS, e d LR referem-se as distâncias de centro a centro em imagens de microscópio, CS decodificado imagens sem lente, e LR deconvolved imagens sem lente, respectivamente.
Figura 6. Processamento digital de imagens fluorescentes sem lente prima é ilustrado. Um algoritmo de compressão com base de amostragem é usada para alcançar <4 mM resolução espacial, resolvendo de forma compacta 2 pares M diâmetro do talão. As inserções mostram também comparações microscópio 40X objetivo, que concorda muito bem com as imagens decodificadas fluorescente. Aqui d refere-se às distâncias de centro a centro em imagens de microscópio, enquanto d CS refere-se às distâncias de centro a centro-nos decodificado sem lente CS imagens fluorescentes.
Figura 7. Imagem sem lente de fluorescência (SYTO 16) rotulados células brancas do sangue é ilustrado. As imagens são primas lensfree rapidamente decodificados usando um decodificador baseado CS, que concorda muito bem com uma imagem de microscópio convencional com a mesma amostra que se adquire com uma lente objetiva de 10X.
Figura 8. Um design personalizado interface de contagem automatizada fluorescentes objeto (no MATLAB) é ilustrado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós demonstramos uma plataforma on-chip microscopia fluorescente que pode conseguir, por exemplo, <4μm resolução espacial mais, por exemplo, cm> 2 0,6-8 campo de visão sem o uso de lentes, de varredura mecânica ou thin-film-interferência filtros. Nesta técnica, com o uso de uma placa de fibra óptica ou uma vela, a emissão fluorescente dos objetos é coletada com um array 2D de cabos de fibra óptica, antes de ser entregue a um opto-eletrônica do sensor array como um CCD / chip CMOS. Estas imagens são então adquiridos lensfree rapidamente processados para produzir <4μm resolução mais> 0,6-8 cm 2 de campo de visão por meio de amostragem de compressão / detecção algoritmo de decodificação baseado. Como uma plataforma de imagem compacto e de campo amplo fluorescentes pode ser bastante útil para high-throughput citometria, raras células de pesquisa, bem como para análise de microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
A. Ozcan agradece o apoio da NSF Prémio Carreira, o ONR Young Investigator Award 2009 e Prêmio de Diretor do NIH Innovator New DP2OD006427 do Gabinete do Diretor, NIH. Os autores também agradecem o apoio da Fundação Bill & Melinda Gates Foundation, Vodafone Americas Foundation, NSF e programa Bish (sob Prêmios # 0754880 e 0930501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-8300 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-11002 | |
| Charge-coupled device(CCD) | KODAK | KAF-39000 | |
| Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) | Micron | MT9T031C12STCD | |
| High power LED light source | Thorlabs Inc. | M455L2-C2 | |
| High power LED driver | Thorlabs Inc. | LEDD1B | |
| Fiber coupled LED light source | Mightex | FCS-0625-000 | |
| Vacuum Pen | Edmund Scientific | NT57-636 | |
| 2, 4, 10 μm Fluospheres | Invitrogen | F-8826, F-8859, F-8836 | |
| RBS lysis buffer 1X | eBioscience | 00-4333 | |
| SYTO 16 labeling reagent | Invitrogen | S7578 | |
| Fiber-optic faceplate | Edmund Scientific | NT55-142 | |
| Fiber-optic taper | Edmund Scientific | NT55-134 | |
| Prisms | Edmund Scientific | NT47-626, NT45-403 | |
| Filters | Edmund Scientific | NT39-417 | |
| PDMS Elastomers | Dow Corning | Slygard 184 |
References
- Coskun, A. F., Su, T., Ozcan, A. Wide field-of-view lens-free fluorescent imaging on a chip. Lab Chip. 10, 824-824 (2010).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Lensless wide-field fluorescent imaging on a chip using compressive decoding of sparse objects. Opt. Express. 18, 10510-10523 (2010).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Lensfree Fluorescent On-Chip Imaging of Transgenic Caenorhabditis elegans Over an Ultra-Wide Field-of-View. PLoS ONE. 6, e15955-e15955 (2011).
- Coskun, A. F., Sencan, I., Su, T., Ozcan, A. Wide-field lensless fluorescent microscopy using a tapered fiber-optic faceplate on a chip. Analyst. , (2011).
- Seo, S. High-Throughput Lens-Free Blood Analysis on a Chip. Analytical Chemistry. 82, 4621-4627 (2010).
- Mudanyali, O. Compact, light-weight and cost-effective microscope based on lensless incoherent holography for telemedicine applications. Lab Chip. 10, 1417-1417 (2010).
- Tseng, D. Lensfree microscopy on a cellphone. Lab Chip. 10, 1787-1787 (2010).
- Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-745 (1974).
- Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. J. Opt. Soc. Am. 62, 55-59 (1972).
- Biggs, D. S. C., Andrews, M. Acceleration of iterative image restoration algorithms. Appl. Opt. 36, 1766-1775 (1997).
- Candes, E., Wakin, M. An Introduction To Compressive Sampling. Signal Processing Magazine, IEEE. 25, 21-30 (2008).
- Kim, S., Koh, K., Lustig, M., Boyd, S., Gorinevsky, D. An Interior-Point Method for Large-Scale L1-Regularized Least Squares. Selected Topics in Signal Processing, IEEE. 1, 606-617 (2007).
- Candes, E. The restricted isometry property and its implications for compressed sensing. Comptes Rendus Mathematique. 346, 589-592 (2008).
- Baraniuk, R. Compressive Sensing [Lecture Notes]. Signal Processing Magazine, IEEE. 24, 118-121 (2007).
- Romberg, J. Imaging via Compressive Sampling. Signal Processing Magazine, IEEE. 25, 14-20 (2008).
